_淀粉样蛋白诱导大鼠海马神经元Tau蛋白异常磷酸化及雌激素的保护作用

　第21卷　第5期医学研究生学报

V o l .21　N o .5

　2008年5月J o u r n a l o f M e d i c a l P o s t g r a d u a t e s

M a y .2008

·论 著·

β淀粉样蛋白诱导大鼠海马神经元T a u 蛋白

异常磷酸化及雌激素的保护作用

段立晖1

,　周国庆1

,　夏树开2

,　孙　芳1

,　胡云龙2

,　林世康

2

1.南京大学医学院临床学院(南京军区南京总医院)干部神经内科,江苏南京210002;

2.南京川博生物科技有限公司,江苏南京210061

摘要:　目的:研究β淀粉样蛋白诱导大鼠海马神经元T a u 蛋白异常磷酸化及雌激素的保护作用。　方法:将24只S D 大鼠随机分为正常对照组、A D 组、A D+雌二醇组,每组8只。除正常对照组以外的16只大鼠海马内注射凝聚态A β25-35制成阿尔茨海默病(A D )模型;A D+雌二醇组大鼠于建模后2周,皮下注射雌二醇。三组大鼠M o r r i s 水迷宫检测大鼠认知功能,B i e l s c h o w s k i 染色法观察海马神经元形态,免疫组化法观察T a u 蛋白异常磷酸化变化。　结果:A D+雌二醇组大鼠M o r r i s 水迷宫测试明显优于A D 组(P<0.001);海马C A 1区T a u 蛋白磷酸化阳性细胞数(26.2±3.5、49.2±3.1、61.5±4.5、42.1±2.7、61.2±2.3、24.0±1.6)明显少于A D 组(45.4±3.1、106.7±7.6、79.3±3.2、67.7±2.9、97.5±2.9、46.7±5.8)(P<0.01);海马C A 1区神经元形态较A D 组规则。结论:β淀粉样蛋白可诱导大鼠海马神经元T a u 蛋白出现异常磷酸化,雌激素替代治疗,可改善A D 大鼠的认知功能,并抑制海马T a u 蛋白的异常磷酸化。

关键词:　β淀粉样蛋白;　阿尔茨海默病;　T a u 蛋白;　雌激素

中图分类号:　R 459.1 文献标识码:　A 文章编号:　1008-8199(2008)05-0486-05

E s t r o g e n i n h i b i t s β-a m y l o i d -i n d u c e da b n o r m a l p h o s p h o r y l a t i o n

o f t a u i n r a t h i p p o c a m p a l n e u r o n s

D U A NL i -h u i 1

,Z H O UG u o -q i n g 1

,X I AS h u -k a i 2

,S U NF a n g 1

,H UY u n -l o n g 2

,L I NS h i -k a n g 2

(1.D e p a r t m e n t o f G e r i a t r i c N e u r o l o g y ,S c h o o l o f M e d i c i n e ,N a n j i n g U n i v e r s i t y /N a n j i n g G e n e r a l H o s p i -t a l o f N a n j i n g M i l i t a r y C o m m a n d ,P L A ,N a n j i n g 210002,J i a n g s u ,C h i n a ;2.N a n j i n g C h u a n b o B i o -t e c h C o .,L t d .N a n j i n g 210061,J i a n g s u ,C h i n a )

A b s t r a c t :　O b j e c t i v e :T o s t u d y t h e a b n o r m a l p h o s p h o r y l a t i o no f t a ui n d u c e d b y β-a m y l o i d p r o t e i n i n h i p p o c a m p a l n e u r o n s a n d n e u r o p r o t e c t i o n b y e s t r o g e n .　M e t h o d s :T w e n t y -f o u r S Dr a t s w e r e r a n d o m l y a n d e q u a l l y d i v i d e d i n t o a n o r m a l c o n t r o l g r o u p ,a n A D(A l z h e i m e r 's d i s e a s e )g r o u p a n d a n A D +e s t r o -g e n g r o u p .A Dm o d e l s w e r e e s t a b l i s h e d b y i n j e c t i n g A β25-35i n t o t h e h i p p o c a m p u s o f 16o f t h e r a t s a n d 2w e e k s l a t e r ,h a l f t h e m o d e l r a t s r e c e i v e d e s t r o g e n i n j e c t i o n .T h e c o g n i t i o n o f t h e 3g r o u p s o f r a t s w a s t e s t e d b y M o r r i s w a t e r m a z e ,t h e p a t h o l o g i c a l c h a n g e s o f t h e h i p p o c a m p u s o b s e r v e d b y

B i e l s c h o w s k i

·

486·＊

收稿日期:　2008-01-18;　修订日期:　2008-02-26基金项目:　南京军区南京总医院科研基金资助项目(批准号:2006024)

作者简介:　段立晖(1980-),男,北京人,医师,医学硕士研究生,从事神经内科专业。

DOI :10.16571/j .cn ki .1008-8199.2008.05.031

s t a i n i n g,t h e t a u h y p e r p h o s p h o r y l a t i o n d e t e c t e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g a n d t h e r e s u l t s c o m-p a r e d.　R e s u l t s:C o m p a r e d w i t ht h e A Dg r o u p,t h e r e s u l t s o f t h e M o r r i s w a t e r m a z e t e s t w e r e s i g n i f i-

c a n t l y b e t t e r(P<0.001)i n t h e A D+e s t r o g e n g r o u p,P-t a u p o s i t i v e c e l l s r e m a r k a b l y f e w e r(26.2±

3.5,49.2±3.1,61.5±

4.5,42.1±2.7,61.2±2.3,24.0±1.6v s4

5.4±3.1,10

6.7±

7.6,

79.3±3.2,67.7±2.9,97.5±2.9a n d46.7±5.8)(P<0.01),a n d t h e n e u r o f i b r i l s i n t h e h i p p o-

c a m p u s m o r e r e g u l a r.　C o n c l u s i o n:E s t r o g e n i m p r o v e s t h e c o g n i t i o n o f A Dr a t s a n di n h i b i t sβ-a m y-l o i d-i n

d u c

e d a b n o r m a l p h o s p h o r y l a t i o n o

f t a u i n t h e h i p p o c a m p u s.

K e y w o r d s:　β-a m y l o i d p r o t e i n;　A l z h e i m e r's d i s e a s e;　T a u;　E s t r o g e n

0　引 言

阿尔茨海默病(A l z h e i m e r d i s e a s e,A D)主要以进行性痴呆为临床特征,其主要病理改变是在海马和颞叶皮质出现老年斑、神经元纤维缠结和营养不良性轴突改变等。老年斑的形成与β淀粉样蛋白(β-a m y l o i d p r o t e i n,Aβ)在细胞外的过度沉积有关,而神经元纤维缠结则主要由T a u蛋白异常磷酸化所致。T a u蛋白在Aβ诱导神经退行性病变过程中起着重要作用[1]。与这些过程密切相关的因素包括雌激素系统以及胆碱能系统等[2-4]。有研究认为,雌激素对A D有一定的保护作用,两者之间的关系也逐渐受到重视[5-9]。

本实验选用成年S D大鼠,通过脑立体定位技术给大鼠海马背侧注射Aβ25-35多肽片段,并予以雌激素处理,从行为学、形态学和抑制T a u蛋白异常磷酸化等方面,观察雌激素对A D大鼠神经细胞的保护作用。

1　材料和方法

1.1　材料

1.1.1　动物及分组　健康雌性成年S D大鼠24只,由南京军区南京总医院比较医学科提供,体质量为300～450g,术前饲养1周,自由饮食,室温22～25℃,每天光照12h。将实验大鼠随机分为3组:正常对照组、A D组、A D+雌二醇组,每组8只。

1.1.2　试剂与仪器　Aβ25-35多肽片段购自A l e x i s 公司,17β-雌二醇购自S i g m a公司,T a u(p-T h r181)、T a u(p-T h r205)、T a u(p-T h r231)、T a u(p-S e r262)、T a u (p-S e r404)、T a u(p-S e r396)多克隆抗体均由南京川博生物科技有限公司提供,脑立体定向仪(江湾I 型)系上海第二军医大学制造。

1.2　方法

1.2.1　凝聚态Aβ25-35的制备　按G i o v a n n e l l i 等[10]的方法,将1m g Aβ25-35溶于200μl无菌等渗盐水中,制成5n m o l/μl浓度,密封后置于37℃细胞培养箱中96h,形成凝聚态。

1.2.2　动物模型制作　①A D组:8只大鼠4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,用脑立体定位仪取平颅头位固定大鼠,参照包新民等[11]的《大鼠脑立体定位图谱》,确定右侧前囟后3.8m m、中线旁2.5m m,颅骨表面下3.0m m为右侧海马背侧部,用1μl微量注射器5m i n内缓慢注入Aβ25-351μl,留针10m i n。术后给予青霉素钠盐5万单位肌内注射,1/d,连续3d。②A D+雌二醇组:8只大鼠侧脑室注射Aβ25-352周后皮内注射17β-雌二醇,200μg/k g,每周2次,共5周。③A D组和正常对照组大鼠于2周后皮下注射等渗盐水,1m l/k g,每周2次,共5周。

1.2.3　空间学习记忆力检测　采用M o r r i s[12]的水迷宫法。水迷宫参照中国科学院上海药物研究所设计,水温保持在19～20℃,周围参照物不变。于注射后14d,进行水迷宫训练,每天训练2次(上、下午各1次),连续6d。训练时,按东北、西北、东南、西南4个象限依次将大鼠面向池壁放入水中,设定最长游动时间为120s,以秒表计时,记录大鼠找到平台所需时间,记为潜伏期。然后撤除平台,选定和平台相对的象限中点为入水点,记录120s内大鼠为搜索平台而穿过平台区的次数(以注射后第20d的成绩作为测试结果)。

1.2.4　取材　大鼠断头处死,取出全脑置于10%甲醛中浸泡约1～2h后,冠状切取视交叉和乳头体之间的脑组织,继续置于甲醛中固定24h。组织块经常规脱水、透明、浸蜡、包埋成蜡块,行冠状切片,片厚4μm,分别用于B i e l s c h o w s k i染色和免疫组织化学染色。

1.2.5　B i e l s c h o w s k i染色　组织切片经脱蜡、逐级乙醇脱水及水洗后,于37℃温箱内用20%硝酸银水溶液避光浸染25～35m i n,随后蒸馏水洗3～5m i n; 10%甲醛还原数秒钟至切片呈现黄色为止,水洗3～5m i n;用氨银溶液滴染20～40s,倾去染液,直接用40%甲醛液再次还原1～2m i n;5%硫代硫酸

·

487

·

　第5期 段立晖,等　β淀粉样蛋白诱导大鼠海马神经元T a u蛋白异常磷酸化及雌激素的保护作用

钠水溶液固定3～5m i n ,水洗3～5m i n ;然后用滤纸将切片周围水分吸干,乙醇脱水,二甲苯透明,中性

树胶封固。

1.2.6　免疫组织化学染色　按标准A B C 免疫组织化学染色方法,组织切片于70℃烤片1h ,常规脱蜡,P B S 液冲洗3次,每次3m i n ;3%H 2O 2阻断内源性过氧化物酶10m i n ,P B S 液冲洗3次,每次3m i n ;枸橼酸盐缓冲液高压抗原修复,再予P B S 冲洗3次,每次3m i n ;用免疫组化笔将各切片的组织圈起,非免疫动物血清孵育15m i n ,倾去血清,予一抗[T a u (p -T h r 181)、T a u (p -T h r 205)、T a u (p -T h r 231)、T a u (p -S e r 262)、T a u (p -S e r 404)、T a u (p -S e r 396)]4℃孵育过夜;P B S 液冲洗3次,每次5m i n 后,以相应二抗孵育10m i n ;P B S 液冲洗2次,每次5m i n ,单蒸水4次,每次3m i n ,辣根过氧化物酶孵育10m i n ;P B S 液冲洗3次,每次5m i n ,D A B 显色,苏木精复染,脱水、透明、中性树胶封固。P B S 液代替一抗作阴性对照。每只大鼠取3张切片,每张切片高倍(×400)镜下计数海马C A 1区5个视野阳性细胞总数,计算每个视野平均阳性细胞数。1.2.7　统计学分析　定量结果以均数±标准差(x

±s )表示,组间均数比较用单因素方差分析,两两组间比较用t 检验。采用S P S S 11.5统计软件进行分析,以P ≤0.05为差异有显著性统计学意义。2　结 果

2.1　各组大鼠M o r r i s 水迷宫实验结果比较　与正常对照组比较,A D 组的逃避潜伏期显著延长,撤除平台后,A D 大鼠穿过原平台位置的次数明显减少(P <0.001);与A D 组比较,A D+雌二醇组逃避潜

伏期明显缩短,穿过原平台位置的次数明显增多(P <0.001);但A D+雌二醇组与正常对照组比较,

则差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　三组大鼠M o r r i s 水迷宫实验结果比较(x ±s )

T a b l e 1　R e s u l t s o f M o r r i s w a t e r m a z e i n t h e t h r e e g r o u p s o f r a t s

(x ±s )

组　别n 逃避潜伏期(s )穿过平台次数正常对照组811.9±1.28.4±1.89A D 组842.7±2.9＊4.1±1.43＊A D+雌二醇组

8

15.3±1.9■

7.8±1.88■

与正常对照组比较,＊P<0.001;　与A D 组比较,■P<0.001

2.2　各组大鼠海马组织形态学表现　正常对照组

大鼠海马结构和神经元形态正常,细胞体未着色,轴突呈棕褐色,神经元纤维排列规则整齐、紧密、形态完整(图1,见后插页)。A D 组大鼠海马神经元缺失,残留的海马神经元轴突即神经纤维走形紊乱、增粗、肿胀,染色加深(图2,见后插页)。A D+雌二醇组大鼠海马神经元轴突排列较A D 组明显整齐有序,密集程度减低,但较正常对照组差(图3,见后插页)。2.3　各组海马组织不同位点的T a u 蛋白磷酸化水平　正常对照组仅检测到少量特异性位点标记的阳性神经元,与之相比,A D 组T h r 181、T h r 205、T h r 231、S e r 262、S e r 404及S e r 396阳性表达数量明显增加(P <0.01)。给予雌激素干预后,A D+雌二醇组T h r 181、T h r 205、T h r 231、S e r 262、S e r 404及S e r 396阳性表达数量显著低于A D 组(P<0.01)。但A D+雌二醇组与正常对照组比较,差异无统计学意义(P >0.05)。见表2。

表2　三组阳性海马神经元数目比较(x ±

s )T a b l e 2　N u m b e r s o f p o s i t i v e h i p p o c a m p a l n e u r o n s i nt h et h r e e g r o u p s o f r a t s (x ±s )

组　别n T a u (p T h r 181)T a u (p T h r 205)T a u (p T h r 231)T a u (p S e r 262)T a u (p S e r 404)T a u (p S e r 396)正常对照组821.6±4.745.3±6.954.1±4.337.3±3.156.4±2.722.4±2.3A D 组845.4±3.1＊106.7±7.6＊79.3±3.2＊67.7±2.9＊97.5±2.9＊46.7±5.8＊A D+雌二醇组

8

26.2±3.5■

49.2±3.1■

61.5±4.5■

42.1±2.7■

61.2±2.3■

24.0±1.6■

与正常对照组比较,＊P<0.01;　与A D 组比较,■P<0.01

3　讨 论

A D 是一种以获得性持续性记忆力减退、认知功能障碍以及行为异常为特征的中枢神经系统退行性疾病。A β的产生及其在大脑皮质的蓄积,被认为

是A D 形成和发展的关键因素[13-15]

。根据G i o v a n -

n e l l i 等[16]

提出的A β25-35是最具毒性基因片段的

假设,本实验选择了A β25-35大鼠海马内注射。实验结果证实凝聚态A β25-35海马注射具有明确的神经毒性作用,可较好地模拟A D 行为和病理表现。 有实验证明,雌激素可作为有潜力的治疗手段,

可预防或延迟A D 的发展[17]

。本研究水迷宫测验

·488·医学研究生学报2008年5月　第21卷　

结果发现,A D组较正常对照组的潜伏期明显延长,同时撤离平台后,穿越原平台位置的次数也明显增加,说明A D大鼠的学习记忆能力显著下降。而A D+雌二醇组的测验结果显著优于A D组,但与正常对照组的差异无统计学意义,说明雌二醇可改善A D大鼠的认知功能,同时对A D大鼠的记忆损害具有明显的保护作用。

已有研究表明,Aβ可通过诱导细胞凋亡[18],诱导产生活性氧,从而触发氧化应激反应[19],影响胆碱能神经系统[20],诱导T a u蛋白过度磷酸化[21]以及通过炎症或胶质等激活[22]机制引发A D。本实验通过B i e s c h o w s k i染色观察到大鼠海马神经元损伤变化。注射Aβ25-35后,局部海马神经元出现大片缺失,且神经纤维走行紊乱,并出现增粗、肿胀、断裂以及纤维深染等损害表现,说明神经细胞骨架微管系统发生改变,进一步证实了Aβ25-35对大鼠海马神经元的毒性作用。有资料表明[23-26],雌激素拮抗Aβ对神经元毒性作用的机制可能是通过其膜结合位点激活c A M P-蛋白激酶A-环腺苷酸反应元件结合蛋白途径,激活c A M P信号转导系统,导致磷脂酰肌醇-3激酶活化。通过该途径激活细胞内抗氧化物谷胱甘肽,帮助神经元拮抗Aβ的氧化毒性作用。Z h a o等[27]研究发现,17β-雌二醇可保护神经元拮抗Aβ25-35引起的细胞内A T P减少。本实验经雌激素治疗后,海马神经元损伤明显减轻,神经纤维排列较规则,且无显著增粗、肿胀、断裂等,说明予以雌激素可能通过拮抗Aβ的神经毒性作用,减轻A D病理改变。

国内外研究表明,凝聚态Aβ25-35能使神经元发生退行性改变,并导致T a u蛋白在特定位点的磷酸化增多[28,29]。T a u蛋白共有21个T a u-S e r和T a u-T h r磷酸化位点,目前多数研究仅选取S e r199/ S e r202、S e r396、T h r231等特定位点,本研究除选取具有代表性的S e r396、T h r231位点外,还选取了T h r181、T h r205、S e r262、S e r404等位点进行磷酸化水平研究。实验发现,海马注射Aβ25-35后,应用特异性位点标记的磷酸化T a u蛋白抗体对海马神经元进行免疫组化染色,观察到阳性表达的神经元数目明显增多;而应用雌激素治疗后,A D大鼠海马C A1区T a u蛋白磷酸化表达水平明显降低。进一步证实了Aβ25-35可以诱导T a u蛋白异常磷酸化增多,而雌激素可能通过抑制T a u蛋白的异常磷酸化,来减轻海马神经元损伤。

雌激素的作用是多途径和多环节的,但目前对于外源性雌激素治疗A D仍存在争论[30]。总体来说,可认为雌激素是A D的保护性因素[31],内源性雌激素水平与A D存在明确的剂量-效应关系[32],补充外源性雌激素对A D具有治疗作用[33],但其替代剂量与时间的关系、长期应用雌激素替代治疗的不良反应等问题,尚需进一步的论证。

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(责任编辑:鲁　立;　英文编辑:罗永合)

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(责任编辑:齐　名;　英文编辑:罗永合)

·490·医学研究生学报2008年5月　第21卷