Praktikum-Biochemie
Praktikum Biochemie
Allgemeine Hinweise zum Praktikum
Lesen Sie die Arbeitsanleitungen für jeden Versuch vor jedem Kurstag sorgf?ltig durch und erg?nzen Sie Ihr Wissen aus den Lehrbüchern.
Führen Sie keine Versuchsanleitung aus, ehe Sie diese nicht wirklich verstanden haben. Graphische Darstellungen
Biochemische Resultate lassen sich oft sehr gut graphisch bzw. numerisch ausdrücken. Dazu tr?gt man gew?hnlich die abh?ngige Variable (also die Messgr??e) auf der Y-Achse (Ordi-nate) und die unabh?ngige Variable (also feste oder vorgegebene Gr??en) auf der X-Achse (Abszisse) auf. Dabei ist die Wahl des richtigen Ma?stabes und sinnvoller Einheiten wichtig. Weitere Hinweise
Beachten Sie bitte stets die allgemeinen Vorsichtsma?nahmen:
Tragen Sie im Labor bitte immer Schutzbrille und Schutzkittel, bei der Arbeit gegebenenfalls Schutzhandschuhe.
Bewahren Sie keine Kleidungsstücke und Taschen im Labor auf.
Trinken, Essen und Rauchen sind im Labor untersagt.
Pr?gen Sie sich bitte ein:
Welcher Fluchtweg besteht? Wo ist die n?chste Notbrause, der n?chste Feuerl?scher, der n?chste Verbandkasten, das n?chste Telefon.
Alle Unf?lle, auch triviale, sind sofort zu melden!
Bei Hautver?tzungen sofort mit viel Wasser abspülen.
Bei Augenver?tzungen sofort mit viel flie?endem Wasser ausspülen (Augenbrause). Auge eventuell mit Gewalt ?ffnen. Augenklinik!
Für das Gelingen der Experimente ist sorgf?ltiges und sauberes Arbeiten eine unerl?ssliche Vorbedingung. Achten Sie auch darauf, dass Sie nicht durch unvorsichtiges Arbeiten sich selbst und Ihre Kommilitonen gef?hrden.
Besondere Vorsicht ist beim Umgang mit konzentrierten S?uren und Laugen geboten.
Mit brennbaren Flüssigkeiten (Ether, Alkohol, ...) darf nur gearbeitet werden, wenn in der N?he alle offenen Flammen gel?scht sind.
Der Dampf einiger L?sungsmittel ist schwerer als Luft und kann sich daher auf dem Labortisch ansammeln.
Liste der durchzuführenden Versuche
Aminos?uren und Peptide
Versuch 1:Ninhydrin-Reaktion (13)
Versuch 2:Nachweis von Zuckerersatzstoffen in Getr?nken (Aspartam) (14)
Versuch 3:Identifizieren einer unbekannten Aminos?ure (16)
Versuch 4:Proteinbestimmung nach Bradford (17)
Versuch 5:L?slichkeitsverhalten und F?llung von Proteinen (19)
Versuch 6:Fraktioniertes Aussalzen: Hühnerei-Albumine und -Globuline (22)
Versuch 7:F?llen und Wiederl?sen von Proteinen (23)
Kohlenhydrate
Versuch 8:Identifizieren von Zuckern - Nachweisreaktionen (28)
Reaktion nach Molisch (28)
Reaktion nach Seliwanoff (29)
Reaktion nach Bial (30)
Fehlingsche Probe (31)
Reaktion nach Barfoed (31)
Reaktion nach W?hlk (32)
Farbreaktion mit Iodl?sung (32)
Versuch 9: Drehwert von Zuckern - Zuckerinversion (34)
Versuch 10:St?rkespaltung (35)
Versuch 11:Enzymatische Bestimmung von Glucose (Hexokinase-Test) (36)
DNA
Versuch 12:Isolierung von DNA aus einer Frucht (Tomate) (38)
Spektroskopische Untersuchungen
Spektroskopische Arbeitstechniken werden in der Biochemie zur Konzentrationsbestimmung, zur Aufkl?rung und Beschreibung der Struktur biologischer Makromoleküle und Membranen, aber auch für die Erfassung enzymatischer Reaktionen eingesetzt. Diese Methoden beruhen auf dem Grundprinzip, dass elektromagnetische Strahlung bestimmter Wellenl?nge und Inten-sit?t in die zu untersuchende L?sung eingestrahlt und beim Durchgang durch die L?sung ab-sorbiert, gestreut oder wieder emittiert wird.
Bei der Absorptionsspektroskopie wird die Intensit?t der einfallenden und aus der Messl?sung austretenden Strahlung erfasst und miteinander verglichen. Der Zusammenhang zwischen den Lichtintensit?ten vor und nach der Absorption wird durch das Lambert-Beersche Gesetz be-schrieben. Dabei wird vorausgesetzt, dass die absorbierende Substanz homogen in der L?sung verteilt ist und dass Lichtstreuungen und Photoreaktionen ausgeschlossen werden k?nnen.
A – Absorption (Extinktion)
I0 – Lichtintensit?t des eingestrahlten Lichtes
I – Lichtintensit?t des austretenden Lichtstrahls
e – Extinktionskoeffizient (abh. von Temperatur, L?sungsmittel, Wellenl?nge) in l·mol-1·cm-1
d – Schichtdick
e der Küvette in cm
c – Konzentration der L?sung in mol·l-1
Anstatt der Absorption A wird h?ufig die Transmission (Durchl?ssigkeit) T oder die prozentuale Transmission T% angegeben.
Die Begriffe Absorption und Extinktion werden oft synonym verwendet. Man sollte dabei jedoch berücksichtigen, dass mit der Extinktion sowohl die Absorption als auch die Licht-streuung erfasst wird. So wird bei der Untersuchung einer Suspension lichtstreuender Partikel (z.B. Milch) eine Extinktion gemessen, Absorption entsprechend dem Lambert-Beerschen Gesetz findet jedoch nicht statt.
Das Lambert-Beersche Gesetz ist nur für sehr verdünnte L?sungen und unter Verwendung streng monochromatischen Lichtes exakt gültig. Die Gr??en I, I0, e und damit auch A sind wellenl?ngenabh?ngig. Die Angabe der Wellenl?nge, bei der gemessen wird, ist daher immer erforderlich. Quantitative Analysenverfahren k?nnen durch subjektive und objektive Faktoren beeinflusst werden. Dissoziations- und Assoziationsvorg?nge, Solvatationsprozesse, Zusatz von Neutralsalzen oder Pufferl?sungen, ?nderungen des pH-Wertes, Temperaturschwankun-gen, Verunreinigungen im L?sungsmittel und in verwendeten Substanzen k?nnen st?ren und damit eine Abweichung vom Lambert-Beerschen Gesetz bewirken.
Die Extinktion ist bei konstanter Schichtdicke linear von der Konzentration der zu untersuch-enden L?sung abh?ngig. Dieser Zusammenhang wird für die Aufstellung von Kalibrier-geraden genutzt. Man verwendet Standardl?sungen bekannter Konzentration und stellt die Extinktion in Abh?ngigkeit von der Konzentration graphisch dar.
Chromatographie
Einblick in die Bio-Chemie von Zellen und Geweben ist nur m?glich, wenn man in der Lage ist, das in einem Extrakt aus biologischem Material vorhandene Gemisch der verschiedensten Zellinhaltsstoffe auf definierte Weise in seine zahlreichen Komponenten zu zerlegen, einzelne Bestandteile zu isolieren und zu identifizieren. Zu den leistungsf?higsten Methoden z?hlt die Chromatographie.
Der russische Botaniker Michail Tswett beschrieb 1906 seine Untersuchungen von Pflanzen-extrakten und deren Trennung durch Chromatographie (…Farbenschreiben“) in verschiedene Farbstoffe. Heute wird die Chromatographie nicht mehr nur für farbige Substanzen angewandt.
Das grundlegende Prinzip aller chromatographischen Verfahren ist die oft wiederholte Ein-stellung eines Gleichgewichtes zwischen einer ruhenden (station?ren) Phase und einer bewegten (mobilen) Phase. Das Gleichgewicht kann sich aufgrund verschiedener physi-kalisch-chemischer Effekte ausbilden.
- Verteilungs-Chromatographie: Die Trennung erfolgt durch unterschiedliches L?sungsverhalten des Analytens in mobiler und station?rer Phase.
- Adsorptions-Chromatographie: Trennung erfolgt aufgrund unterschiedlich starker adsorptiver Bindungen der verschiedenen Komponenten zur station?ren Phase.
- Ionenchromatographie: Trennprinzip ist die Ausbildung unterschiedlich starker Ionenbindungen (Salzbrücken) zwischen den Analyten zur station?ren Phase.
- Gr??enausschluss-Chromatographie (z.B. Gelchromatographie): Trennung erfolgt aufgrund der Molekülgr??e.
- Affinit?tschromatographie: als station?re Phase wird eine für den Analyten spezifische chemische Verbindung eingesetzt, die aufgrund nichtkovalenter Kr?fte eine Trennung bewirkt. Es handelt sich hierbei um eine hochselektive Methode (Schlüssel-Schloss-Prinzip).
Die oben genannten Trennprinzipien kommen im Allgemeinen nicht rein, sondern im unter-schiedlichen Ma?e gemischt vor, meist dominiert aber ein Effekt. Enantiomere (chirale Verbindungen, die sich wie Bild- und Spiegelbild verhalten) k?nnen nur voneinander getrennt werden, wenn die station?re Phase auch chiral ist.
Neben der Einteilung der Chromatographie nach Trennprinzipien, kann man zus?tzlich auch nach den Aggregatzust?nden der verwendeten Phasen (fest, flüssig, gasf?rmig) klassifizieren. Folgende Methoden werden h?ufig im Labor eingesetzt:
- flüssig-fest-Chromatographie (Liquid Solid Chromatography)
- flüssig-flüssig-Chromatographie (Liquid Liquid Chromatography)
- gas-fest-Chromatographie (Gas Solid Chromatography)
- gas-flüssig-Chromatographie (Gas Liquid Chromatography)
Die verschiedenen Ausführungsformen führen schlie?lich zu vielf?ltigen Verfahren wie Papier- und Dünnschichtchromatographie (DC; TLC Thin Layer Chromatography) einschlie?lich der Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC, High Performance Thin Layer Chromatography), S?ulen- oder Flüssig-Chromatographie (LC Liquid Chromatography) mit ihrer Weiterentwicklung der Hockdruck- bzw. Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC; High Performance Liquid Chromatography). Andere
Dünnschichtchromatographie (DC)
Die Dünnschichtchromatographie ist eine sehr schnelle, einfache und kostengünstige Methode der Chromatographie. Auf eine Probenvorbereitung kann in den meisten F?llen verzichtet werden. Die station?re Phase befindet sich bei der DC als dünne Schicht (z.B. Kieselgel, Kieselgur, Aluminiumoxid, Cellulose, Polyamid) auf einem geeigneten Tr?ger aus Glas, Aluminiumfolie oder Kunststoff.
Die DC-Analyse beginnt mit dem Auftragen der Proben an der Startlinie (ca. 1,5 cm vom Rand entfernt). Dieses erfolgt punkt-, linien- oder für pr?parative Zwecke auch bandenf?rmig. Dabei ist die punktf?rmige Auftragung mittels Kapillare die g?ngigste Methode. Die Dünnschichtplatte wird, nachdem die Proben aufgetragen und getrocknet sind, in einem meist geschlossenen Gef?? (Dünnschichtkammer oder Becherglas) entwickelt. Dazu tauch man die DC-Platte mit dem unteren Ende in die Dünnschichtkammer, die bis zu 1 cm H?he mit dem Laufmittel (mobile Phase) gefüllt ist. Aufgrund der Kapillarit?t steigt die mobile Phase nach oben und transportiert die aufgetragenen Analyten je nach Polarit?t mehr oder wenige gut mit. Zur Erlangung reproduzierbarer Laufstrecken ist die S?ttigung der Kammeratmosph?re mit Laufmitteldampf erforderlich. Dazu muss die Dünnschichtkammer verschlossen sein. Eine Auskleidung der Kammerw?nde mit Filterpapier wirkt hilfreich. Die Chromatographie wird beendet, wenn das Laufmittel den oberen Rand fast erreicht hat.
Dünnschichtkammer: A normale S?ttigung, B totale S?ttigung. Ermittlung des R f -Wertes
Zur Auswertung genügt bei qualitativen Analysen die Sichtbarmachung und Lokalisierung der nachzuweisenden Substanzen. Am einfachsten geschieht dies durch Mitlaufen von Vergleichssubstanzen. Um verschiedene DCs vergleichen zu k?nnen, werden relative Retentions-Strecken – R f -Werte (Retention Factor ) – angegeben. Der R f -Wert ist dabei als Verh?ltnis der Wanderungsstrecke des Substanzfleckes (S ) zur Wanderungsstrecke der L?semittelfront (L ) definiert.
Der R f -Wert ist eine stoffspezifische Konstante. Er ist für einen gegebenen Stoff abh?ngig von der Natur der beiden Phasen, d.h. der Art des Dünnschichtmaterials und der S
L
gewandert ist. Je gr??er die R f-Wert sind, desto gr??er ist die Aufenthaltswahrscheinlichkeit der Substanzmoleküle in der mobilen Phase. Das entspricht der Beobachtung, dass in der DC weitgelaufene Substanzflecke deutlich diffuser sind als solche in der N?he des Starts.
Die Reproduzierbarkeit der R f-Werte wird jedoch übersch?tzt. Der R f-Wert h?ngt von einer gro?en Zahl von Einflüssen ab. Die wichtigsten sind neben Dünnschichtmaterial und Laufmittelzusammensetzung die Schichtdicke des Dünnschichtmaterials, Plattenformat, Herstellung und Vorbehandlung der Schicht (insbesondere der Einfluss von Luftfeuchtigkeit), Temperatur, Trennkammer und Trenntechnik, S?ttigungszustand der Kammer, Laufstrecke, Entfernung des Startpunktes vom Flüssigkeitsspiegel, Reinheit des Flie?mittels (Alter der Mischung), relative Menge des Flie?mittels, Aufgetragene Substanzmenge, Begleiter, Konzentration der Probel?sung. Deshalb sollte man bei der Identifizierung wenn m?glich immer eine Vergleichssubstanz mitlaufen lassen und wenigstens zwei verschiedene Lauf-mittelsysteme verwenden.
Zuverl?ssiger als der R f-Wert ist die auf eine Bezugssubstanz berechnete relative Laufstrecke, R B = a/b (a = Laufstrecke der Substanz, b = Laufstrecke der Bezugssubstanz). Die Bezugs-substanz sollte dabei m?glichst der gleichen Stoffklasse angeh?ren. R B-Werte k?nnen auch gr??er als 1 sein.
Die meisten Substanzen sind nicht durch Eigenf?rbung zu detektieren, so dass sie auf der Dünnschichtplatte sichtbar gemacht werden müssen. Zur unspezifischen Sichtbarmachung werden h?ufig Dünnschichtplatten mit einer UV-aktiven station?ren Phase verwendet. Solche DC-Platten fluoreszieren bei UV-Licht-Bestrahlung. Viele Substanzen l?schen diese Fluoreszenz und k?nnen so detektiert werden.
Farblose Substanzen k?nnen auch durch spezifische oder unspezifische postchromato-graphische Farbreaktionen sichtbar gemacht werden, wobei die notwendigen Reagenzien entweder aufgesprüht oder im Tauchverfahren aufgebracht werden: Bedampfung mit Jod, Reaktion mit Vanillin-Schwefels?ure, Cer-Molybd?n-Reagenz oder Kaliumpermanganat. Für die spezifische Detektion von Aminos?uren eignet sich das Besprühen mit Ninhydrinreagenz. Meist werden Dünnschichtchromatogramme nur qualitativ ausgewertet. Zur quantitativen Auswertung werden entweder die Fl?chen der Substanzflecken herangezogen oder eine photometrische Auswertung durchgeführt. Hierzu stehen kommerziell erh?ltliche Scanner zur Verfügung, die das reflektierte Licht messen. Alternativ k?nnen auch die Substanzflecken ausgekratzt werden und die zu bestimmenden Substanzen nach Extraktion in L?sung quantitativ in ihrer Menge bzw. Konzentration bestimmt werden. Radioaktiv markierte Verbindungen k?nnen durch Autoradiographie nachgewiesen werden.
Aminos?uren und Peptide
Vorbemerkungen
Aminos?uren (AS) bilden die Grundbausteine einer wichtigen Stoffklasse, der Proteine. Alle Proteine sind aus dem gleichen ubiquit?ren Satz von 20 (bzw. 21: Selenocystein) Aminos?uren (proteinogene Aminos?uren) aufgebaut. Darüber hinaus existieren in der Natur noch eine Vielzahl anderer Aminos?uren, sogenannte Nicht-Standard-AS. Einige davon sind Intermediate (Zwischenprodukte) im Stoffwechsel, z.B. Homocystein im Methioninstoff-wechsel oder Ornithin und Citrullin im Harnstoffcyclus.
Alle Aminos?uren haben Trivialnamen oder allgemeine Namen, die sich z.T. von den Quellen ableiten, aus denen sie zuerst isoliert wurden (z.B. Asparagin: Spargel- Asparagus offici-nalis). Sie k?nnen mit einem Drei-Buchstaben-Code (Gly, Asn, Glu, …) oder mit einem Ein-Buchstaben-Code (G, N, E, …) abgekürzt werden. Bis auf L-Prolin (cyclisch, Aminogruppe im Ring) haben alle a-Aminos?uren folgende Struktur:
COOH
C H2Fischer-Projektion einer L-Aminos?uren (Aminogruppe links)
Die Standard-Aminos?uren besitzen an Position 1 eine Carboxyl-Gruppe und am a-Kohlen-stoff (Position 2) eine Amino-Gruppe, sie unterscheiden sich nur in der Seitenkette R. Die einfachste Aminos?ure ist Glycin (R = H).
Mit Ausnahme des Glycins enthalten alle Aminos?uren mindestens ein asymmetrisches Kohlenstoffatom (C-Atom mit vier unterschiedlichen Substituenten) und treten damit in 2 enantiomeren Formen (L = Aminogruppe links, D = Aminogruppe rechts) auf, die sich zueinander wie Bild und Spiegelbild verhalten. Proteine sind ausschlie?lich aus L-Aminos?uren aufgebaut. D-Aminos?uren kommen in der Natur nur begrenzt vor, u.a. in einigen Peptid-Antibiotika und in Form von Oligopeptiden in Bakterienzellw?nden.
In Abh?ngigkeit der Polarit?t der Seitenkette R k?nnen die Aminos?uren in 3 Hauptgruppen eingeteilt werden.
Polarit?t der Seitenkette Vertreter
unpolar, neutral Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Pro
polar, neutral (ungeladen) Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln, Trp
polar, geladen
negativ (sauer) positiv (basisch) Asp, Glu His, Lys, Arg
Aminos?uren sind amphotere Verbindungen, sie liegen in w?ssriger L?sung als Zwitterionen vor, die in Abh?ngigkeit vom pH-Wert der L?sung saure oder basische Reaktionen zeigen. Die funktionellen Gruppen (Amino- und Carboxylgruppe) fungieren entweder als Protonendonator oder Protonenakzeptor. Den pH-Wert, bei dem die AS als Zwitterionen vorliegt, bezeichnet man als isoelektrischen Punkt, pI. Hier ist die Aminos?ure demnach nach au?en ungeladen, sie kann nicht im elektrischen Feld wandern.
Der pI von neutralen AS liegt ungef?hr zwischen 5 und 6, bei den sauren AS zwischen 2,5 und 3,5 und bei den basischen AS zwischen 7,5 und 11. L?slichkeit und spezifische Drehung durchlaufen am pI ein Minimum. Bei niedrigeren pH-Werten liegen AS als Kationen (pos. geladen) vor, bei h?heren pH-Werten als Anion (neg. geladen).
Peptide sind Polymere der Aminos?uren. Werden zwei Aminos?uren über eine Amidbindung (Peptidbindung) kovalent verknüpft, entsteht ein Dipeptid, durch Kondensation weiterer Aminos?uren Tripepdide (3 AS), Tetra-, Penta-, ..., Oligopeptide (< 10 AS), Polypeptide (10 – 50 Aminos?uren, molekulare Masse unter 10000) und Proteine, die aus Tausenden Amino-s?ureeinheiten aufgebaut sein k?nnen.
Den endst?ndigen Rest, der eine freie a-Aminogruppe tr?gt, bezeichnet man als N-terminalen (aminoterminalen), den anderen Rest mit der freien Carboxylgruppe als C-terminalen (carboxyterminalen) Rest.
Zur Schreibung von Peptid-Formeln benutzt man meist Ein- oder Dreibuchstabennotationen für die Aminos?uren. Zum Beispiel stehen AG oder Ala-Gly für l-Alanylglycin, [H2N-CH(CH3)-CO-NH-CH2-COOH] und GA oder Gly-Ala für das isomere Glycyl-l-alanin [H2N-CH2-CO-NH-CH(CH3)-COOH]; falls nicht anders gekennzeichnet (etwa durch: Gly?Ala), steht links die freie Amino-Gruppe und rechts die freie Carboxy-Gruppe. Zum qualitativen Nachweis von Peptiden sind einige der auch auf Aminos?uren anwendbaren Methoden geeignet, ferner die Biuret-Reaktion, die zusammen mit Folins-Reagenz auch zur quantitativen Bestimmung geeignet ist (Lowry-Methode). Die Bestimmung der Aminos?ure-Zusammensetzung von Peptiden ist erst nach hydrolytischer Spaltung m?glich, die chemisch oder enzymatisch mit Proteasen vorgenommen werden kann. Hochaufl?sende Auftrennungen und Charakterisierungen von Peptid-Gemischen k?nnen mit HPLC, Kapillarelektrophorese und Massenspektrometrie erfolgen. Zur Trennung der Aminos?uren bedient man sich chromatographischer Methoden (Dünnschicht-, Gas- und Ionenaustauschchromatographie, HPLC). Die Ionenaustauschchromatographie hat besonders breite Anwendung gefunden. Einen Aufschluss über den tats?chlichen Aufbau von Peptiden, d.h. über die Art der Verknüpfung der Aminos?ure-Bausteine miteinander, erh?lt man durch die Sequenzanalyse. Zwei Aminos?uren (z.B. Glycin und Alanin) k?nnen zu zwei verschiedenen Dipeptiden (siehe oben) zusammengesetzt werden, bei drei verschiedenen Aminos?uren gibt es schon 6, bei vier 24 M?glichkeiten. Die Sequenzanalyse ist prinzipiell eine Methode der Endgruppen-bestimmung, bei der die Peptid-Kette wiederholt an einem Ende (meist der freien Amino-Gruppe) um jeweils einen Aminos?ure-Rest verkürzt wird (Sanger-Abbau, Edman-Abbau). Die chemische Peptid-Synthese erfolgt entweder auf konventionelle Weise in L?sung oder durch weitgehend automatisierte und computergesteuerte Merrifield-Verfahren. Der zeitliche Aufwand ist aufgrund der Entwicklung automatischer Verfahren und der Festphasentechnik ungleich geringer geworden. Für die Herstellung biologisch aktiver und pharmakologisch nutzbarer Peptide werden heute neben der chemischen Peptid-Synthese in zunehmendem Ma?e Methoden der Biotechnologie und Gentechnik eingesetzt.
Die Biosynthese von Peptiden erfolgt im allgemeinen gem?? der Protein-Biosynthese durch Translation der Sequenz der mRNA an Ribosomen, wobei die Peptide vielfach anschlie?end aus gr??eren Vorstufen proteolytisch herausgeschnitten werden.
In Mikroorganismen k?nnen Peptide auch durch nicht-ribosomale Synthese an Multienzym-Komplexen (z.B. verschiedene Peptid-Antibiotika) oder durch direkte Verknüpfung mit Hilfe einzelner Enzyme (z.B. Glutathion) gebildet werden.
Proteine
Vorbemerkungen
Die Bezeichnung …Eiwei?“ ist historisch bedingt und geht auf die ursprüngliche Isolierung aus dem Hühnereiwei? (Hühnerei) zurück. Schon relativ früh zeigte sich jedoch, dass Eiwei?e Bestandteile praktisch aller lebenden Zellen sind und dass sie aufgrund ihrer Strukturvielfalt an nahezu allen Lebensprozessen wesentlichen Anteil haben. Deshalb wird heute allgemein
die von Berzelius 1838 gepr?gte Bezeichnung …Protein“ (von gr. proteuo = erstrangig) der ?lteren Bezeichnung …Eiwei?“ vorgezogen.
Proteine sind in der belebten Welt allgegenw?rtig. Auf der Anwesenheit bestimmter Proteine beruhen Struktur, Funktion und Stoffwechsel aller lebenden Zellen und Gewebe; in gewissen Sinn sind die Proteine die Tr?ger der Lebensfunktionen. Man findet sie gleicherma?en in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen.
Die folgende Tabelle veranschaulicht Funktion und Bedeutung der Proteine:
Protein Funktion Beispiel
Enzym Biokatalysator Lactatdehydrogenase Transportprotein Transport H?moglobin
Kontraktile Proteine Fortbewegung, Kontraktion Actin, Myosin Abwehrproteine Schutz, Abwehr Thrombin, Interferone Strukturproteine Strukturbildung, Stütz- und Gerüst-
Kollagen, Keratin, Fibroin
funktion
N?hrstoffprotein Aminos?urevorrat Ovalbumin, Casein Regulatorische Proteine Steuerung zellul?rer und
Insulin, Glucagon
physiologischer Vorg?nge
Stark vereinfacht bestehen Proteine aus einer Aneinanderreihung verschiedener Aminos?uren (21 Standard-a-L-Aminos?uren), ab ca. 50 AS-Bausteinen spricht man von Proteinen. Neben den Standard-Aminos?uren enthalten bestimmte Proteine in meist geringen Anteilen auch eine nicht proteinhaltige Gruppe (z.B. Phosphat, Lipide, Nucleins?uren, Kohlenhydrate) und werden entsprechend als Phospho-, Lipo-, Nucleo- oder Glycoproteine bezeichnet.
Die Proteine sind wie die Aminos?uren amphotere Stoffe. Sie liegen in Abh?ngigkeit vom pH-Wert als polyvalente Kationen, Anionen oder Zwitterionen vor. Der Hauptanteil an dissoziablen Gruppen wird von den funktionellen Gruppen der Aminos?uren-Seitenketten gestellt. Im Gegensatz zu den Aminos?uren k?nnen die Werte bei Proteinen sehr stark schwanken, da die Dissoziation durch Nachbargruppen im Makromolekül beeinflusst wird.
Ladungszustand eines globul?ren Proteins in Abh?ngigkeit vom pH-Wert
Die biologische Funktion eines Proteins wird durch seine Konformation, d.h. die r?umliche Anordnung der Atome im Protein bestimmt, die weit über die blo?e Abfolge (Aminos?ure-sequenz) hinausgeht. Man unterscheidet vier Strukturebenen.
Die Prim?rstruktur gibt Auskunft über Anzahl und Reihenfolge der durch Peptidbindungen miteinander verknüpften AS-Bausteine, entspricht also der AS-Sequenz.
Wasserstoff-Brückenbindungen des Typs N–H···O=C zwischen den Atomen des Peptid-Rück-grats sind für die Ausbildung von Sekund?rstruktur verantwortlich, es entstehen gefaltete Abschnitte (a-Helix oder ?-Faltblatt). Die Sekund?rstruktur beschreibt demzufolge die lokale r?umliche Anordnung benachbarter Aminos?urereste ohne Berücksichtigung der Konformation der Seitenkette.
Unter der Terti?rstruktur versteht man die r?umliche Anordnung der Peptid-Kette sowie der Aminos?ure-Seitenresten, die durch Disulfid-Brücken, durch Wasserstoff-Brückenbindungen, durch ionische und durch hydrophobe Wechselwirkungen, meist zwischen AS-Seitenketten, stabilisiert wird. Die Terti?rstruktur beschreibt also die r?umliche Beziehung aller AS einer Polypeptidkette, einschlie?lich der intramolekularen Wechselwirkungen der Seitenketten, d.h. die vollst?ndige dreidimensionale Struktur einer Polypeptidkette.
Proteine, die aus mehr als einer Polypeptidkette aufgebaut sind (multimere Proteine) besitzen schlie?lich noch eine weitere Strukturebene, die Quart?rstruktur. Diese beschreibt die r?um-liche Anordnung der Polypeptidketten bzw. Untereinheiten innerhalb eines Proteins und die Art ihrer Kontakte (intermolekulare Wechselwirkungen).
Sekund?rstruktur-Elemente von Proteinen: a) a-Helix; b) ?-Faltblatt mit antiparallelen (1) u. parallelen (2) Str?ngen
Proteinanalytik
Vorbemerkungen
Quantitative Proteinbestimmungen z?hlen zu den wichtigsten und am h?ufigsten durchge-führten Untersuchungen im biochemischen Labor. Die anwendbaren Methoden sind sehr vielgestaltig und werden durch neue biochemischen Erkenntnisse und schnelle Innovationen im technischen Bereich immer spezifischer und empfindlicher. Die Proteinproben sind h?ufig
h?ltnissen zusammengesetzt sind. Manche Proteine enthalten zus?tzlich zum Proteinanteil prosthetische Gruppen (meist kovalent gebundene, Nicht-Eiwei?-Komponente mit kataly-tischer Wirkung), so dass sehr komplexe Strukturen resultieren. Bei den bisher bekannten Methoden werden grundlegende Eigenschaften der Proteine genutzt:
- Vorhandensein von Peptidbindungen
- Reaktivit?t von Gruppen in den Aminos?ureseitenketten
- Kolloidcharakter
- Ligandbindungsverm?gen
Die Proteinreinigung ist auch heute noch eine der gr??ten Herausforderungen der Bioanalytik und oft sehr zeitaufwendig. Durch mehrere Reinigungsstufen im Verlauf der Protein-pr?paration k?nnen enorme Abweichungen zwischen seiner tats?chlichen und der mit einer ausgew?hlten Methode bestimmten Menge auftreten.
Exakte Ergebnisse bei der Proteinbestimmung erh?lt man nur, wenn eingewogener Standard und zu bestimmendes Protein die gleiche Zusammensetzung aufweisen oder ein m?glichst heterogenes Proteingemisch mit einem m?glichst universellen Standardprotein verglichen wird. Die Auswahl des Standards ist jedoch sehr schwierig, da ein Protein, das chemisch-analytischen Anforderungen entspricht, nur schwer zu pr?parieren ist. Bei der Auswahl der Bestimmungsmethode muss beachtet werden, ob man einen qualitativen Nachweis führen will, ob man ein semiquantitatives Ergebnis (…schwach“ – …mittel“ – …stark“) oder ein exaktes Ergebnis als Zahlenwert angeben m?chte.
Da die meisten quantitativen Analysenverfahren durch zahlreiche subjektive und objektive Faktoren beeinflusst werden, sollte für jeden Reagenzansatz eine Kalibierreihe aufgestellt werden. Die wichtigste Kontrolle ist der Leerwert, d.h. alle Komponenten des Testansatzes werden wie bei einer …richtigen“ Messung behandelt, nur anstelle des Analyten (= Probe) wird ein entsprechendes Volumen L?sungsmittel (Puffer) zugesetzt. Um einen vertretbaren Mittelwert bilden zu k?nnen und …Ausrei?er“ eindeutig zu erkennen, sollten Dreifachbe-stimmungen des Leerwertes, der L?sungen für die Kalibriergerade und der Probe selbst durchgeführt werden.
Viele Verfahren sind sowohl für eine qualitative als auch für einen quantitative Bestimmung von Aminos?uren und Peptiden geeignet. Zur quantitativen Proteinbestimmung werden in der Praxis vorrangig die Biuret-, Lowry- und Bradford-Methode sowie die direkte UV-Absorp-tionsmessung eingesetzt. Es gibt aber keine Farbreaktion oder spektroskopische Methode, die alle Eigenschaften eines Proteins in gleicher Weise anspricht. Aufgrund der Farbreaktion im stark Sauren oder stark Basischen werden Proteine bei kolorimetrischen Methoden irrever-sibel denaturiert. Bei spektroskopischen Methoden bleibt die biologische Funktion des Proteins erhalten. Dadurch kann das Protein für weitere Untersuchungen verwendet werden. Andererseits sind direkte spektroskopische Methoden weniger empfindlich als kolori-metrische Bestimmungen. Für eine direkte spektroskopische Bestimmung werden deshalb h?here Konzentrationen ben?tigt. Beide Verfahren k?nnen durch die Anwesenheit anderer Substanzen wie Salze, Zucker, Detergenzien oder Nucleins?uren beeinflusst werden.
Biuret-, Lowry- und Bradford-Methode basieren auf Farbreaktionen mit speziellen Reagen-zien. Die Intensit?t der F?rbung ist dabei ein direktes Ma? für die Konzentration des Proteins bzw. der an der Farbreaktion beteiligten Gruppen und wird spektralphotometrisch erfasst. Diese F?rbemethoden k?nnen unter Berücksichtigung des Lambert-Beerschen Gesetzes nur in
Die Biuret-Methode beruht auf der Bildung eines intensiv gef?rbten Kupfer-Chelat-Kom-plexes, dessen Farbintensit?t gemessen wird. Der Biuret-Assay ist im Vergleich zu den anderen Farb-Assays der unempfindlichtste. Die Reaktion ist typisch für Verbindungen mit mindestens zwei CO-NH-Gruppen (Peptidbindung) und deshalb zur Bestimmung von Proteinen und Peptiden geeignet. St?rend wirken vor allem Ammonium-Ionen, sowie schwach reduzierende und stark oxidierende Substanzen.
Bei der Proteinbestimmung nach Lowry ist die Sensitivit?t durch einen zus?tzliche Farb-reaktion (Reaktion des Folin-Ciocalteau-Phenol-Reagenz) in Kombination mit der Biuret-Reaktion enorm gesteigert, allerdings wird diese Methode durch nichtproteinogene Substanzen sehr leicht beeintr?chtigt. Die F?rbung ist relativ instabil.
Bei der Bradford-Methode sind im Gegensatz zur Proteinbestimmung nach Biuret und Lowry keine Kupfer-Ionen involviert, sonder es werden blaue S?urefarbstoffe (Coomassie-Brillantblau) eingesetzt, die unspezifisch an kationische und unpolare, hydrophobe Seiten-ketten der Proteine binden. Die Methode ist die empfindlichste quantitative F?rbemethode. Von Vorteil ist, dass die Bradford-Methode eine Reihe von Substanzen toleriert, die bei den anderen Bestimmungsmethoden st?ren. Insbesondere ist hier die Toleranz gegenüber Redukt-ionsmitteln zu nennen. Hingegen st?ren alle Substanzen, die das Absorptionsmaximum von Coomassie-Brillantblau beeinflussen. Dies ist aufgrund der Unspezifit?t der Wechsel-wirkungen sehr schlecht abzusch?tzen. Der gr??te Nachteil dieser Methode besteht in der Subjektivit?t dieses F?rbe-Assays, da gleiche Mengen an verschiedenen Standardproteinen erhebliche Differenzen in den resultierenden Absorptionskoeffizienten verursachen k?nnen. Auch unter nahezu idealen Bedingungen und Ausschluss st?render nichtproteinogener Bestandteile erh?lt man bei der Bestimmung eines Proteins mit den verschiedenen Methoden Ergebnisse, die bis zu 20% voneinander abweichen k?nnen. Die gleiche Proteinl?sung gibt mit Test A ein anderes Ergebnis als mit Test B. Auch liefert der gleiche Test mit den gleichen Konzentrationen verschiedener Proteine (z.B. 1 mg/ml Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Cytochrom C) verschiedene Werte. Es ist deshalb unbedingt erforderlich bei der Darlegung der Ergebnisse sowohl die Versuchsbedingungen als auch die Analysenmethode anzugeben. Eine "wahre", absolut richtige Proteinmenge l?sst sich demnach mit den verschiedenen Farbreaktionen allein nicht ermitteln, wohl aber erh?lt man innerhalb einer Methode und mit einer dafür erstellten Kalibriergeraden bei korrekter Ausführung stets reproduzierbare Werte. Bei der photometrischen Bestimmung kolloidaler L?sungen (Proteinl?sungen und Zell-suspensionen) wird die Schw?chung des eingestrahlten Lichtes durch Lichtabsorption durch chromophore Gruppen und durch Lichtstreuung an Partikeln gemessen. Dabei muss berück-sichtigt werden, dass Proteine in Abh?ngigkeit von der Konzentration untereinander in Wechselwirkung treten und sich Sekund?r- und Terti?rstruktur konzentrationsabh?ngig ver?ndern. Das Lambert-Beersche Gesetz ist folglich nur für einen begrenzten Bereich gültig.
Versuch 1: Ninhydrin-Reaktion
1. Vorbemerkungen
Die Ninhydrin-Reaktion ist eine wichtige Nachweisreaktion für a-Aminos?uren, prim?re Amine, Ammoniak, Peptide und Proteine mit freien Aminogruppen. Der entstehende Farbstoff (Ruhemanns Purpur) absorbiert bei 570 nm, ist also violett - Ausnahme Prolin: 440 nm, gelb.
Proteine und Peptide reagieren mit Ninhydrin langsamer. Sekund?re und terti?re Amine, Harnstoff sowie ?- und ?-Aminos?uren zeigen diese Reaktion nicht.
O
OH
OH
COOH
H 2N
H +
Ninhydrin α-Aminos?ure O
N
O
O
Farbstoff
2
Eine interessante Anwendung von Ninhydrin ist die Erstellung von Fingerabdrücken. Da im Schwei? Aminos?uren vorkommen, k?nnen diese mit Ninhydrin reagieren und die Finger- bzw. Handabdrücke sichtbar machen.
2. Ger?te und Chemikalien
- Reagenzgl?ser - Wasserbad
- Ninhydrin-Reagenz: 0,5%ige L?sung in Aceton
- je 1%ige L?sung von Pepton und Harnstoff, 0,1%ige L?sung von Glycin
3. Durchführung
Zu 1 ml einer Probel?sung (pH-Optimum der Reaktion etwa 7) gibt man ca. 5 Tropfen Ninhydrin-Reagenz und erhitzt bis zur Farbentwicklung im Wasserbad. Führen Sie die Reaktion mit L?sungen von Glycin, Harnstoff und Pepton (partiell hydrolisiertes Protein) durch und bestimmen Sie das Absorptionsmaximum.
4. Auswertung
untersuchte Probe F?rbung Absorptionsmaximum Glycin
Versuch 2: Nachweis eines Zuckerzusatzstoffes in
Getr?nken (Aspartam)
1. Vorbemerkungen
Die Menschheit hat durch alle Jahrhunderte hindurch mit wachsender Begeisterung sü?e Speisen gegessen. In den letzten 150 Jahren stieg der Pro-Kopf-Verbrauch an Zucker (Saccha-rose) von 2 kg auf 35 kg an. Der steigende Zuckerkonsum wurde mit zahlreichen chronischen Erkrankungen, wie Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Zahnkaries u.a. in Verbindung gebracht. Ursache dafür ist einerseits der hohe Kaloriengehalt und andererseits die chemische Zusammensetzung der Saccharose aus D-Glucose und D-Fructose. Insbesondere für die zahlreichen Diabetiker bedeutet eine Erh?hung des ohnehin schon hohen Blutzuckerspiegels durch Einnahme von glucosehaltigen Stoffen eine lebensbedrohende Gefahr.
Substanzen mit einem intensiven Sü?geschmack sind seit der Entdeckung des Saccharins im Jahre 1879 bekannt und haben einen weit h?heren Sü?ungsgrad als Saccharose (Rüben-zucker). Da Sü?stoffe praktischen keinen N?hrwert besitzen und somit die Kalorienzufuhr einschr?nken, leisten sie auch für die Gesundheit übergewichtiger Menschen einen nicht unerheblichen Beitrag.
Da bekannte Sü?stoffe wie Saccharin und Cyclamat neuerdings gesundheitssch?dlich bedenk-lich sind (karzinogene Wirkung im Tierexperiment), besteht an neuen, n?hrwertfreien und insulinunabh?ngigen metabolisierenden Sü?stoffen auf Basis k?rpereigener Stoffe ein erhebliches Interesse.
Dazu geh?ren u.a. zahlreiche Aminos?uren (überwiegend D-Reihe) und einige Aspartyl-peptide (Dipeptidester der L-Asparagins?ure). Die Geschmackswirkung von Aminos?uren ist im Wesentlichen von der Konfiguration sowie vom hydrophoben Charakter der Seitenkette abh?ngig; letztere beeinflusst insbesondere die Geschmacksintensit?t. Peptide dagegen zeigen unabh?ngig von der Konfiguration mit wenigen Ausnahmen neutralen oder bitteren Geschmack.
Wie so h?ufig in der Wissenschaft war es eine Zufallsentdeckung, als Schlatter 1968 bei einer Synthese feststellte, dass der Dipeptidester Asp-Phe-OMe sü? schmeckt. Bemerkenswert ist, dass die Bausteine dieses Dipeptid-Sü?stoffes (Asp und Phe) sogar bitter schmecken. Aspartam wird inzwischen weltweit eingesetzt, doch ist seine Stabilit?t nicht immer aus-reichend. Probleme treten nicht beim Sü?en von Getr?nken zum sofortigen Genuss auf, aber beim Zusetzen von Aspartam zu Lebensmitteln, die l?ngere Zeit erhitzt werden müssen sowie bei Getr?nken, die l?ngere Zeit gelagert werden sollen. M?gliche Abbaureaktionen sind z.B. eine a/?-Umlagerung, die Hydrolyse zu den Komponenten und die Ausbildung eines hetero-cyclischen Ringsystems – dem Diketopiperazin.
Aspartam besitzt die 180 – 200fache Sü?kraft (bezogen auf Saccharose) und wird im Dünndarm nach seiner Verseifung in seine beiden resorptionsf?higen Aminos?uren Asparagins?ure und Phenylalanin zerlegt, die wegen ihrer geringen Konzentration als Energietr?ger keine Rolle spielen.
(wie z.B. viele light-Getr?nke) die Aspartam enthalten, den Hinweis "enth?lt eine Phenyl-alaninquelle" tragen. Neugeborene werden heute auf Phenylketonurie routinem??ig getestet, damit schwerste Gehirnsch?den verhindert werden. Jede eiwei?haltige Ern?hrung kann Menschen mit Phenylketonurie sch?digen. (Informieren Sie sich über die Krankheit, wie man sie medizinisch nachweist, welche Therapien es gibt!)
über m?gliche weitere Gesundheitsgefahren durch die Verwendung von Aspartam gibt es kontroverse Meinungen. Die FDA wertete eine gro?e Anzahl toxikologischer und klinischer Studien zu Aspartam aus und erkl?rte 1981 den Gebrauch für sicher, sofern eine Tagesdosis von 50 mg/kg K?rpergewicht / Tag nicht überschritten wird. Der EU-Grenzwert wurde auf 40 mg/kg K?rpergewicht / Tag festgesetzt.
Weitere Sü?stoffe sind z.B. Acesulfam (E 950), Cyclamat (E 952) und Saccharin (E 954).
2. Ger?te und Chemikalien
- DC-Zubeh?r
- Untersuchungsmaterial: Phenylalanin
Phenylalaninmethylester (Hydrochlorid)
Asparagins?ure
Aspartam
Cola light, Deit
3. Durchführung
Dünnschichtchromatographische Trennung auf Papier (PCG) oder Kieselgelplatten (TLC). Folgende Proben werden von links nach rechts aufgetragen:
1) 1 μl Phenylalanin (0,2%ig)
2) 1 μl Phenylalaninmethylester (0,2%ig)
3) 1 μl Asparagins?ure (0,2%ig)
4) 1 μl Aspartam (Asp-Phe-OMe) (0,2%ig)
5) 1 μl Cola light
6) 2 x 1 μl Cola light
7) 1 μl Deit
8) 2 x 1 μl Deit
- Platte in Trennkammer (ca. 15 min) auftrennen;
Flie?mittel: sek-Butanol : Ameisens?ure : Wasser = 70 : 2 : 30
- Anf?rben des Chromatogramms mit Ninhydrin (in Aceton), lufttrocknen
- anschlie?end auf eine Heizplatte legen bei 70 °C, bis Banden sichtbar sind
4. Auswertung
Werten Sie das Chromatogramm visuell aus und bestimmen Sie die R f-Werte!
Stoff R f-Wert Bemerkung
Phenylalanin (0,2%ig)
Phenylalaninmethylester (0,2%ig)
Asparagins?ure (0,2%ig)
Aspartam (Asp-Phe-OMe) (0,2%ig)
Cola light
Versuch 3: Identifizieren einer unbekannten Aminos?ure
1. Ger?te und Chemikalien
- DC-Zubeh?r
- verschiedene Aminos?urel?sung als Vergleichssubstanz
- zwei L?sung einer unbekannten Aminos?ure
2. Durchführung
- Auftragen der Aminos?urestandards sowie der unbekannte Probe auf DC-Platte - Platte in Trennkammer (ca. 15 min) auftrennen;
Flie?mittel: sek-Butanol : Ameisens?ure : Wasser = 70 : 2 : 30
- Anf?rben des Chromatogramms mit Ninhydrin (in Aceton), lufttrocknen
- anschlie?end auf eine Heizplatte legen bei 70 °C, bis Banden sichtbar sind
3. Auswertung
Werten Sie das Chromatogramm visuell aus und bestimmen Sie die R f-Werte!
Substanz R f-Wert Bemerkung
unbekannte Probe 1
unbekannte Probe 2
Versuch 4: Proteinbestimmung nach Bradford
1. Vorbemerkungen
Die Proteinbestimmung nach Bradford ist eine einfache, sensitive und wenig st?ranf?llige Standardmethode. Der Triphenylmethan-Farbstoff Coomassie-Brillantblau R-250 (G-250) bindet über verschiedene Wechselwirkungen recht unspezifisch an die Proteine. In saurer L?sung liegt der Farbstoff in der protonierten kationischen Form mit einem Absorptions-maximum von 470 nm vor, hat also eine rote Farbe.
C
N +
HN OCH 2CH 3
CH 2
SO 3-
H 3C
CH 3
N H 2C
H 2C
CH 3
SO 3Na H 3C
Bei der Bildung des Farbstoff-Protein-Komplexes wird dagegen die anionische Form des Farbstoffes stabilisiert, welche ein Absorptionsmaximum von 595 nm zeigt, also blau ist. Da der Extinktionskoeffizient des Farbstoff-Protein-Komplexes au?erdem sehr viel h?her als der des freien Farbstoffes ist, kann die Zunahme der Absorption bei 595 nm durch die Bildung des Komplexes mit hoher Empfindlichkeit gegen das freie Farbreagens photometrisch gemessen werden und ist ein Ma? für die Proteinkonzentration in der L?sung.
St?rende Detergenzien wie SDS und Triton müssen vorher gegebenenfalls durch Dialyse, Ultrazentrifugation oder F?llen des Proteins entfernt werden.
Berücksichtigt werden sollte, dass die Farbintensit?t der Proteine variiert. Die folgende Tabelle zeigt die Farbausbeute einiger ausgew?hlter Proteine mit dem Bradford-Reagenz.
Protein relative Farbausbeute in % (BSA = 100%) Rinderserumalbumin (BSA) 100 Cytochrom C 108 Ribonuclease A 82 Carboanhydrase 81 Lysozym 80 Ovalbumin 76 Gelantine 53 Immunglobulin G 42 Trypsin 40 Pepsin 28 Mittelwert für eine Vielzahl von Proteinen 82
2. Ger?te und Reagenzien
- Spektralphotometer, Plastikküvetten
- Bradford-Reagenz, bestehend aus: Coomassie-Brillantblau G-250, konz. Phosphors?ure (88%,
16 M), Ethanol (96%) (100 mg G-250 in 47 ml EtOH und 100 ml H3PO4 unter Rühren 3 h über Nacht
l?sen, mit H2O auf 1000 ml verdünnen und filtrieren (bei 4°C in brauner Flasche ca. 3 Monate stabil) - Proteinstandard (Rinderserumalbumin) 1% (10 mg/ml)
- Proteinl?sung unbekannter Konzentration
3. Durchführung und Auswertung
Erstellen der Kalibriergeraden
- aus dem Proteinstandard 10 μL entnehmen und mit H2O auf 1000 μL (1:100) verdünnen
- aus der 1:100-Verdünnung in je 2 Mikrolitergef??e (Doppelbestimmung) pipettieren:
0 μl ( = 0 μg Protein) - Leerwert
20 μl ( = 2 μg Protein)
40 μl ( = 2 μg Protein)
60 μl ( = 4 μg Protein)
70 μl ( = 7 μg Protein)
80 μl ( = 8 μg Protein)
100 μl ( = 10 μg Protein)
- alle Proben auf 100 μl mit Wasser auffüllen
- zu jedem dieser 100 μl-Ans?tze 900 μl Bradford-Reagenz pipettieren und kr?ftig mischen
- nach etwa 5 min bis max. 30 min die Extinktion bei 595 nm im Photometer gegen den Leerwert messen
- Mittelwert aus den Extinktionen der Parallelans?tze bilden
- Kalibriergerade durch Auftragen der A595-Werte gegen die jeweilige Proteinmenge erstellen
Messpunkt A595 (1) A595 (2) A595 (Mittelwert)
20 μl
40 μl
70 μl
80 μl
100 μl
Bestimmung der Proteinmenge in der unbekannten Probe
- aus der unbekannten Probe 10μl, 20μl, 40μl und 80μl entnehmen und mit Wasser auf 100μl verdünnen
- 900 μl Farbreagenz zugeben und kr?ftig mischen
- A595 gegen den Leerwert messen und anhand der Kalibriergeraden die entsprechende Proteinmenge bestimmen (Interpolation). Sollte die Extinktion au?erhalb der Kalibriergeraden liegen, muss eine kleinere Ausgangsprobe genommen werden, bzw.
die Ausgangsl?sung verdünnt werden)
- Durch Division der bestimmten Proteinmenge durch das Volumen der unbekannten Probe (10 – 80 μl) erh?lt man die Konzentration (μg/μl) des Proteins in der Ausgangsl?sung
Ausgangsvolumen der unbekannten Probe A595Proteinmenge
[μg]
Proteinkonzentration
[μg/μl]
10 μl 20 μl 40 μl
Versuch 5: L?slichkeitsverhalten und F?llung von
Proteinen
Vorbemerkungen
Entsprechend ihrer L?slichkeit, des Ladezustandes und der Aminos?urezusammensetzung werden globul?re Proteine eingeteilt in Albumine, Globuline, Prolamine / Gluteline und Histone / Protamine.
Albumine sind gut kristallisierbare Proteine, die im pH-Bereich 4 bis 8,5 wasserl?slich sind. Sie lassen sich durch sehr hoch konzentrierte Salzl?sungen ausf?llen (bspw. Ammonium-sulfatl?sung, 80 – 85% S?ttigung). Albumine sind reich an negativ geladenen Aminos?uren wie Asp und Glu (20 – 25%) sowie an Leu und Ile (bis zu 15%), aber arm an Gly (1%).
Sie kommen insb. in tierischen Flüssigkeiten und Geweben vor, weniger h?ufig dagegen in Pflanzensamen. Wichtige Vertreter sind u.a. das Ovalbumin des Eiwei?es, das Lactalbumin der Milch, das Serumalbumin des Blutplasmas, das Ricin des Rizinussamens sowie das Leucosin, das in Weizen-, Roggen- und Gerstenk?rnern vorkommt. Albuminl?sungen werden medizinisch bei Schockzust?nden, Eiwei?- und Blutverlusten infudiert.
Die weit verbreiteten multifunktionellen Globuline sind h?hermolekularer als die Albumine und in reinem Wasser nicht oder nur schwer l?slich. (L?slichkeitsminimum am isoelektrischen Punkt), in verdünnten L?sungen von Neutralsalzen und Alkalien dagegen leicht l?slich. Durch 20-50%ige S?ttigung mit Ammoniumsulfat kann man sie aus ihren L?sungen ausf?llen, w?hrend die Albumine bei diesen Konzentrationen noch gel?st bleiben. Sie fallen erst bei h?heren Salzkonzentrationen aus.
Globuline kommen in fast allen tierischen und pflanzlichen Zellen und K?rperflüssigkeiten vor. Sie enthalten haupts?chlich die Aminos?uren Leu, Gly, Lys, Arg und Tyr. Zu den Globulinen geh?ren u.a. zahlreiche Enzyme, die meisten Serumproteine (Serumglobuline), beispielsweise die Immunoglobuline des Blutes, weiterhin Myosin, der Hauptbestandteil des Muskeleiwei?es und das Lactoglobulin der Milch. Ein pflanzliches Globulin ist z.B. das in den Hülsenfrüchten vorkommende Vicilin.
Die Albuminfraktion des Eiklars l?sst sich von der Globulinfraktion durch fraktionierte F?llung mit Ammoniumsulfatl?sung abtrennen.
Prolamine und Gluteline sind niedermolekulare Proteine, die in Getreide vorkommen.
Prolamine enthalten haupts?chlich die Aminos?uren Pro (bis zu 15%) und Glu (30 – 45%), dagegen sehr wenig Lys. Gluteline bestehen haupts?chlich aus Gln und Pro. Viele Prolamine und Gluteline sind strukturell miteinander verwandt, wobei die Gluteline durch Disulfidbrücken verbundene polymere Aggregate bilden.
Die Prolamine sind in 70%igem Ethanol l?slich und k?nnen so von den zurückbleibenden Glutelinen getrennt werden, mit denen sie zusammen den Kleber (Gluten) des Getreides bilden.
Wichtige Vertreter der Proamine sind Gliadine in Weizen und Roggen, Hordeine in der Gerste und Zein in Mais. Wichtige Vertreter der gluteline sind die Glutenine des Weizens.
Protamine enthalten bis zu 85% Arg, Histone bestehen haupts?chlich aus Lys und Arg. Histone und Protamine sind basisch reagierende globul?re Proteine, die in Wasser und S?uren l?slich sind. Sie bilden mit den Nucleins?uren stabile Assoziate (Nucleoproteine).
Die F?llung (Pr?zipitation) von Proteinen aus einer L?sung ist eine der ersten Techniken, die zur Reinigung von Proteinen eingesetzt wurde. Die Methode beruht auf der Wechselwirkung von pr?zipiterenden Salzen mit den in der L?sung befindlichen Proteinen.
Diese Agenzien k?nnen relativ unspezifisch sein und praktisch alle Proteine aus einer L?sung ausf?llen. Die Salzf?llung steht h?ufig am Anfang eines Reinigungsverfahrens zur Gewinnung der Gesamtproteine aus einem Zell-Lysat, wobei das Ziel die Abtrennung der Proteine von anderen gel?sten Komponenten wie Nucleins?uren, Kohlenhydraten und anderen niedermole-kularen Verbindungen ist.
Manchmal k?nnen darüber hinaus schon kleine Unterschiede in der L?slichkeit von Proteinen für eine Fraktionierung der Proteine durch vorsichtige Zugabe definierter Mengen eines F?llungsreagenzes ausgenutzt werden.
Proteine lassen sich z.B. durch ?nderung der Ionenst?rke, des pH-Wertes oder durch Zugabe von mit Wasser mischbaren organischen L?sungsmitteln ausf?llen. Die am h?ufigsten ver-wendete Methode ist die Ausf?llung durch hohe Salzkonzentrationen. Stark vereinfacht beschrieben l?uft diese F?llung wie folgt ab: Gel?ste Ionen binden viele Wassermoleküle in ihren Solvathüllen. Ist die Konzentration der Ionen hoch, dann werden freie Wassermoleküle knapp und Dom?nen eines Proteins, die nur schwache Wechselwirkungen mit Wasser eingehen, verlieren ihre Solvathülle. Sie sind nun nicht mehr gut in Wasser l?slich und fallen dementsprechend aus. Proteine, die ausgepr?gte hydrophobe Dom?nen besitzen, fallen bei geringeren Salzkonzentrationen aus als stark hydrophile Proteine.
Die ?lteste und am h?ufigsten angewendete Methode Proteine zu f?llen ist, sie durch Zugabe von Ammoniumsulfat auszusalzen. Ammoniumsulfat ist besonders gut geeignet, da es in Konzentrationen > 0,5 M die biologische Aktivit?t auch empfindlicher Proteine schützt. Es ist leicht wieder von den Proteinen zu entfernen (Dialyse, Ionenaustauscher) und au?erdem preiswert. Ammoniumsulfat wird üblicher Weise unter kontrollierten Bedingungen (Tempe-ratur, pH-Wert) portionsweise zu der Proteinl?sung zugegeben, wodurch eine fraktionierte F?llung und damit eine Anreicherung des interessierenden Proteins m?glich wird. Die Abh?n-gigkeit der L?slichkeit eines Proteins von der Salzkonzentration unterscheidet sich von Protein zu Protein. Zum Beispiel kann man das Blutgerinnungsprotein Fibrinogen mit 0,8 M Ammoniumsulfatl?sung ausf?llen, Serumalbumin aber erst mit 2,4 M Ammoniumsulfat-l?sung. Myoglobin kristallisiert in einer 3 M Ammoniumsulfatl?sung. Man sollte aber beachten, dass eine vollst?ndige F?llung mehrere Stunden dauern kann. Ammoniumsulfat-pr?zipitate sind normalerweise dicht und gut abzentrifugierbar. Eine Einschr?nkung stellt die Pufferwirkung des Ammoniumsulfats im alkalischen Milieu dar, so dass die Ammonium-sulfatf?llung nur bis zu einem pH-Wert von 8 benutzt werden sollte. Proteinsuspensionen in Ammoniumsulfatl?sungen sind meistens sehr stabil und k?nnen bei 4°C bis zu mehreren Monaten gelagert werden.
Schon lange ist bekannt, dass Proteine mit organischen L?sungsmitteln wie Aceton,