DNA提取的完整步骤

DNA提取的完整步骤

1．取新鲜或冷冻样品的肌肉组织100ul-200ul或95%ALC保存的样品组织0.05g。

2．将组织尽量剪碎，分别装入1.5ml 的离心管中。

3．每管中加入450ul的裂解缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0; 100mM EDTA, pH8.0)

4．每管加入10% SDS 50-100ul(70-80不定) (1-2%),再加入2.5-5ul（3ul）蛋白酶K (20mg/ml),是其终浓度达100ug/ml. 混匀，55℃3h至过夜（期间将管子颠倒几次）。

5．样品中加入150ul NaCl（盐析作用），室温8000rpm离心20min，去沉淀，然后在上清液中加入等体积（500ul）预冷异丙醇（沉淀DNA），混匀，20℃处理30min，14000rpm离心10min，去上清液。沉淀加70%ALC洗涤离心去ALC，室温挥发ALC5-10min，加TE 500ul，加10ul RNAase (终浓度4mg/ul)，即2.5ul。37℃ 30min 或65℃ 15min。

6．加等体积酸液（提取DNA中的蛋白质）缓慢来回颠倒离心管10min，13000-15000rpm离心10min。用移液管（大口Tip头）小心取出上层相至另外干净的离心管中，不要触到两相之间的白色蛋白层（可视情况重复操作次）。

7．加入等体积酚：氯仿(催取酚)（1：1），轻摇,缓慢颠倒混匀10min 13000-15000rpm 离心5-10分钟，取上层清液于干净离心管中。

8．加入等体积氯仿（氯仿：异戊醇（阻止氯仿挥发）=24：1），轻摇，缓慢颠倒混匀10min,13000-15000rpm离心5-10min。取上清液加入1/10体积2M NaCl和等体积-20℃保存的无水乙醇（或等体积异丙醇）（沉淀DNA），沉淀DNA 10min,13000rpm离心5min，去上清，加入100-150ul70%ALC,离心，小心倒掉ALC（当心DNA沉淀丢失），用70%ALC 再洗一次，然后去ALC。45℃烘箱烘干15-30min，用双蒸水沿管壁沿四周冲洗（TE量视DNA沉淀量而定，在80-250ul之间），溶解12-24h,-20℃保存备用。

魁蚶DNA提取

（因裂解严重，故简化DNA提取步骤）

1．取95%乙醇保存的组织0.05g，放入500ul的蒸馏水中浸泡半天，再换一次蒸馏水浸泡半天。

2．将组织尽量剪碎，放入盛有450ul裂解缓冲液（TE）的1.5ml 离心管中（10mM Tris-HCl，pH8.0，10mM EDTA pH8.0）

3．每管中加入10%的SDS 50-100ul （80ul），（1-2%），再加入2.5-5.0ul（一般4.0ul或5.0ul）蛋白酶K（20mg/ml），使其终浓度达100ul/ml，混匀。55℃水浴 3小时至过夜(期间将管子颠倒几次)，加2.5ul RNAase,37℃ 30min或65℃ 15min，（RNAase易降解，一般不许再加RNAase，形成沉淀）。

4．样品中加入150ul NaCl，室温4000rpm离心20min (T=15℃)，去沉淀，然后在上清液中加入等体积酚液（提Pr）。缓慢颠倒离心管10min，13000-15000rpm离心10-15min，用移液管大口Tip头小心取出上层水相至另外干净的离心管中，不要触到两相间的白色蛋白层。

5．再上清液中加入于冷得等体积异丙醇（沉淀DNA)，混匀，20℃处理30min,14000rpm离心10min，去上清液。

6．沉淀用70%的乙醇洗涤，离心去乙醇，室温挥发。

后80ul H2O 离解DNA