人3型腺病毒GZ13株的分离鉴定及六邻体蛋白的分子进化研究

*国家自然科学青年基金资助项目（编号：31100133）△通信作者。E －mail ：gzwcs@fimmu．com

人3型腺病毒GZ13株的分离鉴定及六邻体

蛋白的分子进化研究

*

张其威1，赵素慧1，王长兵2，朱冰2，朱利1，赵卫1，李凌1，万成松1

△

1

南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系（广州510515）；

2

广东省广州市妇女儿童医疗中心中心

实验室（510120）

【摘要】目的分离鉴定1株引起儿童急性支气管肺炎的腺病毒及分析其主要中和抗原六邻体蛋白的分子

进化趋势。方法

采用荧光定量PCR 方法，对1例引起严重支气管肺炎的患儿咽拭子进行检测，并从中分离得到

1株腺病毒（命名为GZ13）。利用型特异性引物PCR 进行初步亚型鉴定；克隆该株腺病毒完整的六邻体蛋白基因，测序和序列比对，确定其型别；同时与GenBank 上人3型腺病毒的六邻体蛋白进行同源性比对，分析预测六邻体蛋白的分子进化趋势。结果

该临床标本经荧光定量PCR 鉴定为腺病毒强阳性，型特异性引物PCR 初步鉴定

为3型；完整六邻体基因比对最终确定为人3型腺病毒；GZ13株与我们先前分离的GZ01、GZ02株及台湾地区分离株核苷酸及氨基酸的同源性均大于99%。结论

引起该例儿童急性支气管肺炎的病原体为人3型腺病毒，目

前在广州以及台湾地区流行的3型腺病毒仍属同一流行株，其主要中和性抗原六邻体蛋白未出现明显变异，这对今后开发研究人3型腺病毒疫苗及药物具有重要指导意义。

【关键词】人3型腺病毒；六邻体蛋白；分子进化

Isolation and identification of human adenovirus type 3GZ 13strain and the molecular evolution of hexon pro-tein．

ZHANG Qi －wei ☆，ZHAO Su －hui ，WANG Chang －bing ，ZHU Bing ，ZHU Li ，ZHAO Wei ，LI Ling ，WAN

Cheng －song．☆

Department of Microbiology ，School of Public Health and Tropical Medicine ，Southern Medical University ，

Guangzhou 510515，China

Corresponding author ：WAN Cheng －song ，E －mail ：gzwcs @fimmu．com

【Abstract 】Objective

To isolate and identify the human adenovirus （HAdV ）from a child with an acute bron-chopneumonia ，and to analyze the molecular evolution of the neutralizing antigen hexon protein．Methods

The adenovi-rus ，named GZ13，was isolated from the throat swab of a child with severe acute bronchopneumonia by FQ －PCR．Type －specific primers were used to primary identification of virus type by PCR．The complete hexon gene was cloned and se-quenced for confirmation．The hexon protein was also compared with the other HAdV －3to predict its molecular evolu-tion．Results

The adenovirus specimen was confirmed by FQ －PCR ，and classified as HAdV －3by primary PCR typ-ing ，which was further confirmed with hexon gene blast．There was 99%homogeneity of nucleotide and amino acid be-tween the GZ13strain and GZ01，GZ02or Taiwan strain according to alignment with all hexon proteins of adenovirus type 3．Conclusion

HAdV －3is associated with this acute bronchopneumonia．The prevalent type 3adenoviruses ，GZ13，

Taiwan Strains and other Guangzhou strains ，belong to circulating single strain．The stability and conservation of hexon is helpful in development of HAdV －3vaccine in future．

【Key words 】human adenovirus type 3；hexon ；molecular evolution

人腺病毒（human adenovirus ，

HAdV ）属于哺乳动物腺病毒属，为无包膜双链DNA 病毒，呈二十面体结构

［1］

。六邻体（hexon ，120kD ）是腺病毒衣壳二十面体的主要蛋白，每个六邻体由3个亚基组成，含有大量型特异性中和表位，能够刺激机体产生型特异性中和抗体。腺病毒能引起人类广泛的疾病：急性上、下呼吸道感染，暴发性眼结膜炎，急性出血性膀胱炎以及婴幼儿

胃肠炎等［2］

。目前已发现的HAdV 有56个型别，分为7个种（A G ）［3］

。其中B 种腺病毒与人类致病性密切相关，可分为2个亚种：B1（包含HAdV －3、－7、

－16、－21、－50和SAdV －21）和B2（HAdV －11、－14、－34和－35）［4－6］。人3型腺病毒（HAdV －3）具有更高的毒性并且与严重的临床症状相关

［7］

。

1982—1993年，日本的呼吸道感染疾病大部分由HAdV －3引起［8］。2004年，中国江苏省9个城镇共709例呼吸道感染患者感染HAdV －3［9］，同年，我们发现并报道了一起广东省广州市某幼儿园258名儿童感染HAdV －3引起的急性咽结膜热的爆发［10－11］

。在台

湾，

HAdV －3更是近几年呼吸道感染疾病的主要血清型

［12－13］

。本研究从广州1例引起严重支气管肺炎的

患儿咽拭子标本中分离鉴定得到1株腺病毒，并进行PCR 分型、六邻体基因测序，最终确定该临床分离株的

型别；同时分析了腺病毒主要中和性抗原六邻体蛋白的分子进化情况，为今后研究开发儿童HAdV－3疫苗及药物提供理论基础。

1材料与方法

1．1病毒分离2011年1月，从广州市妇女儿童医疗中心内科住院部临床确诊为急性支气管肺炎的1例3岁患儿采集咽拭子标本，接种HeLa细胞进行病毒分离，待出现典型致细胞病变效应（CPE）后病毒于－80?冰箱中保存，并命名为GZ13。

1．2病毒鉴定抽提咽拭子标本中的核酸（通用型核酸快速提取试剂盒，华银公司），利用荧光定量PCR方法对该标本中的各种呼吸道病毒进行鉴定。提取培养病毒的DNA（OMEGA Viral DNA提取试剂盒），利用我们设计的腺病毒分型引物进行PCR扩增分型［11］，扩增引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1．3基因克隆及序列测定利用引物HexF：5'－GC-CGCAGTGGTCTTACATGCACATC－3'和HexR：AG-CACGCCGCGAATGTCAAAG，PCR扩增该腺病毒的六邻体基因，PCR反应条件：94?1min，94?30s，55?30s，72?3min，72?7min，扩增32个循环。纯化回收PCR产物（OMEGA公司的DNA凝胶回收试剂盒），克隆入pMD18－T载体（Takara），选取阳性重组质粒送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，并装配成一条完整序列。

1．4同源性分析及型别鉴定利用Bioedit7软件分析该腺病毒六邻体的核苷酸与氨基酸序列，对该序列进行注释并提交到GenBank；利用Blastn、Blastp软件对该株病毒六邻体基因的核苷酸及氨基酸序列在Gen-Bank上进行比对，确定与该序列同源性最高的六邻体基因序列。

2结果

2．1腺病毒GZ13的分离感染HeLa细胞120h后细胞病变情况如图1所示，细胞变圆、肿胀、成簇等典型腺病毒CPE病变特征

。

图1感染腺病毒GZ13株120h后HeLa细胞病变情况（?100）2．2GZ13荧光定量PCR检测结果通过对咽拭子标本中多种呼吸道病毒进行荧光定量PCR检测，发现腺病毒检测呈强阳性（CT值=19.03），证明该标本为腺病毒阳性。

2．3GZ13六邻体基因PCR分析鉴定从病毒液中提取六邻体基因DNA，利用HAdV－3型特异性引物进行扩增，可见样品在300bp处出现目标条带，初步证明该分离株为HAdV－3（图2）。利用HAdV－3六邻体扩增引物对GZ13株进行六邻体全基因PCR扩增，在约3kb处扩增出六邻体目的基因片段（图3）

。

M：100bp DNA Ladder；1：无模板空白对照；2：GZ13病毒株DNA

图2GZ13型特异性引物PCR

扩增结果

M：1kb DNA Ladder；1：无模板空白对照；2：GZ13病毒株DNA 图3PCR扩增GZ13六邻体全长基因的结果

2．4GZ13株六邻体基因序列测定、亚型鉴定及分析将初步分型的六邻体基因片段克隆至pMD18－T载体，进行菌落筛选培养，质粒进行PCR鉴定，将序列送至上海英潍捷基有限公司测序，拼接注释后获得GZ13株六邻体基因序全长序列（2835bp，944个氨基酸，GenBank登录号：JQ764730）。Blastn和Blastp分析表明，GZ13株属于HAdV－3，与型特异性PCR扩增分型结果一致。GZ13株六邻体基因与GenBank中公布的台湾、广州地区的HAdV－3基因同源性非常高，核苷酸和氨基酸同源性均＞99%，其中核苷酸仅有5 10个碱基差异，氨基酸仅有4 8个差异（表1、2），提示近年来在广州以及台湾地区流行的HAdV－3其主要中和性抗原六邻体蛋白仍非常稳定和保守，未出现明

显变异。

表1GZ13株六邻体基因全长核苷酸序列Blastn结果

HAdV－3六邻体基因序列GenBank

登录号

核苷酸

同源性（%）

Gap

数目（%）

837－05－TW EF4946502830/2835（99）0/2835（0）1964－99－TW EF4946422830/2835（99）0/2835（0）Guangzhou01DQ0994322828/2835（99）0/2835（0）Guangzhou02DQ1056542825/2835（99）0/2835（0）

表2GZ13株六邻体蛋白氨基酸序列Blastp结果

HAdV－3六邻体蛋白序列GenBank

登录号

氨基酸

同源性（%）

Gap

数目（%）

837－05－TW ABU63123940/944（99）0/2835（0）1964－99－TW ABU63115940/944（99）0/2835（0）Guangzhou01DQ099432939/944（99）0/2835（0）Guangzhou02DQ105654936/944（99）0/2835（0）

3讨论

近年来的研究发现，HAdV开始出现越来越多的变异，特别是主要中和性抗原六邻体蛋白，新近发现的几株新亚型均为六邻体基因的变异重组株［14］。我国陕西2006年爆发的腺病毒感染经基因组测序鉴定为HAdV－14和HAdV－11六邻体基因的重组体，并命名为新型HAdV－55［15］。新出现的变异株及新亚型其传染性可能更强，人群尚未形成免疫保护。因此，今后对我国目前流行的腺病毒六邻体蛋白基因的变异情况进行实时监测就显得至关重要，有助于预测腺病毒可能引起的爆发性疾病，为疾病防控提供参考依据。

本研究从急性支气管肺炎患儿咽拭子标本中利用荧光定量PCR鉴定为腺病毒阳性，细胞培养分离获得病毒株GZ13，利用型特异性引物PCR初步分型，鉴定该株腺病毒属于人HAdV－3。通过对该临床株六邻体基因进行测序获得完整的全长基因序列，并进行序列注释，提交到GenBank。将该序列与GenBank公布的所有HAdV六邻体基因全序列进行比对，确定该序列与HAdV－3六邻体基因序列同源性最高，大于99%，进一步证明引起儿童急性支气管肺炎的这株病毒属于HAdV－3。同时发现我们目前分离的HAdV－3与台湾流行株、我们2004年分离的广州株同源性非常高（大于99%），提示GZ13株和台湾株仍属于同一流行株；分离出的HAdV－3其主要中和性抗原六邻体蛋白仍非常稳定和保守，未出现明显变异，这对今后开发研究HAdV－3疫苗具有重要指导意义。

从1996年开始美国陆军健康研究中心启动发热性呼吸道疾病的人群监测项目，以提供在疫苗减少过程中和减少后腺病毒的分子流行病学数据［16］。2000年开始，美国建立包括15个监测点涉及14个州的全国腺病毒监测网络。日本对腺病毒也有连续8年的监测［17］。中国台湾地区1991—2002、2004—2005年也有连续监测资料的报道［12－13］。但是在中国大陆，近年来对腺病毒的分子流行病学监测几乎是空白。我们的研究小组目前正在分离更多的腺病毒毒株并进行测序，以期最终确定在我国特别是南方流行的腺病毒其分子进化规律。

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（收稿日期：2011－11－24编辑：王冰

櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆

）闭合复位多根克氏针内固定治疗儿童肱骨干骨折

路敏，贾斌

深圳平乐骨伤科医院创伤科（广东深圳518000）

儿童肱骨干骨折为临床常见骨折，

虽然保守治疗已取得了满意的疗效，但随着内固定物材料的发展以及手术操作的日益完善，采用手术方法治疗肱骨干骨折已得到广泛认可［1］。我院自2007年3月至2010年2月对收治的21例肱骨干骨折儿童采用逆行髓内多针内固定，疗效满意，现报告如下。

1资料与方法

1．1一般资料本组21例，男17例，女4例；年龄7 15岁。右侧12例，左侧9例；均为闭合性骨折，无血管、

神经

A：术前；B：术后

图1手术前后X线表现

损伤；骨折部位：肱骨干上1/3骨折4例，中1/3骨折15例，下1/3骨折2例；骨折类型：横断骨折14例，斜行或螺旋骨折7例；手术时间为受伤后4h 5d内。

1．2手术方法全麻或臂丛神经阻滞麻醉，患者取仰卧位，屈肘至90?，前臂置于胸前。取肘后正中切口长2 3 cm，在鹰嘴窝上约2cm处直接劈开肱三头肌，用尖锥打开髓腔，其尖端斜向肱骨近端并倾斜约30?，然后沿此开口于髓腔内沿肱骨干纵轴，插入2.0mm 克氏针3 4根，以髓腔塞紧为度，针尖抵达骨折线后暂时停止进针并进行手法复位。透视下见复位满意后，用锤子将多根克氏针继续击入，针尖尽可能穿入骨折近端，但不要穿过肱骨近端骺板。针尾折弯留0.5cm剪断，埋入皮下，无菌敷料包扎。

1．3术后处理术后患肢均用三角巾悬吊于胸前4 6周，1周后开始进行肩肘关节功能锻炼，术后定期复查X线片，了解骨折恢复情况，指导功能锻炼和力量训练，待骨折临床愈合后门诊局麻下取出克氏针。

2结果

所有患儿均获得随访，随访时间6 22个月，平均（7.0?2.5）个月。手术时间35 110min，平均（52?45）

min；出血量20 50mL，平均（45?20）

mL。骨折愈合时间3 11周，平均（6.5?

2.0）周。术后X线表现良好，见图1。

术后随访肩肘关节活动均正常。无切口

感染、骨不连、医源性血管神经损伤、内

固定失效、畸形愈合等发生。

3讨论

对儿童肱骨干骨折传统的治疗方

法是采用手法复位，石膏或小夹板外固

定，由于该方法舒适性差、需要经常调

整、儿童骨折后管理困难等原因，家属

及患儿不愿接受。切开复位钢板内固

定虽然可以避免保守治疗带来的诸多

不便，但是该手术方式产生的手术切口

瘢痕、感染、需要二次手术取内固定物

等问题也是医生和患儿难以接受的。

由此看来，通过闭合复位，经皮置入有

效的内固定物无疑是解决儿童肱骨干

骨折的最佳方法［2－3］。与钢板等髓外

固定相比，以弹性髓内针为代表的髓内

固定具有手术损伤小、负荷分布均匀、

应力遮挡少等优点，可以使骨折端产生

“内夹板”作用［4］，获得可靠的内固定。

但是因为弹性髓内针价格昂贵，故普及

率较低。鉴于以上原因，我们参照髓内

针的固定原理，以多根克氏针紧密填塞

肱骨的髓腔，起到类似于带锁髓内针的

固定作用，可以有效地避免肱骨干骨折

治疗当中经常出现的分离、旋转等移

位。采用逆行方式打入，可以有效避开

肱骨远、近端的骨骺，避免因多根钢针

穿过而导致的骨骺损伤。经本组观察：

术后骨折端无移位，骨折均顺利愈合，

说明其固定作用的可靠性。

总之，采用逆行髓内多根克氏针内

固定治疗儿童肱骨干骨折具有疗效可

靠、治疗成本低廉、损伤小、操作简单、

易于推广的特点，为儿童肱骨干骨折的

治疗提供了新的思路及治疗手段。

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（收稿日期：2011－09－26编辑：陈嘉伟）