真菌基因组学研究进展

真菌基因组学研究进展

真菌为低等真核生物，种类庞大而多样。据估计，全世界约有真菌150万种，已被描述的约8万种。真菌在自然界分布广泛，存在于土壤、水、空气和生物体内外，与人类生产和生活有着非常密切的关系。许多真菌在自然界的碳素和氮素循环中起主要作用，参与淀粉、纤维素、木质素等有机含碳化合物及蛋白质等含氮化合物的分解。有些真菌如蘑菇、草菇、木耳、麦角、虫草、茯苓等可直接供作食用和药用，或在发酵工业、食品加工业、抗生素生产中具有重要作用。然而，也有些种类引起许多植物特别是重要农作物的病害，如水稻稻瘟病、小麦锈病、玉米腥黑穗病、果树病害等。少数真菌甚至是人类和动物的致病菌，如白色假丝酵母Candida albicans等。因此，合理利用有益真菌，控制和预防有害真菌具有重要意义。

本文整理了已完成基因组序列测定的真菌的信息，并对真菌染色体组的历史、测序策略及其基因组学的研究进展进行了评述。

1真菌染色体组的研究历史和资源

1986年美国科学家Thomas Rodefick提出基因组学概念，人类基因组计划带动了模式生物和其它重要生物体基因组学研究。阐明各种生物基因组DNA中碱基对的序列信息及破译相关遗传信息的基因组学已经成为与生物学和医学研究不可分割的学科。由欧洲、美国、加拿大和日本等近百个实验室六百多位科学家通力合作，1996年完成第一个真核生物酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae的基因组测序，这对于酵母菌类群来说是一个革命性的里程碑，并且激起了真核基因功能和表达的第一次全球性研究(Goffeau etal，1996)。随后粟酒裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe(Wood etal.2002)和粗糙脉孢霉Neurospora crassa(Galagan etal.2003)染色体组的完成显露出酿酒酵母作为真菌模式生物的局限性。尽管如此，真菌染色体组测序的进展最初是缓慢的。为加快真菌染色体组研究的步伐，2000年由美国Broad研究所与真菌学研究团体发起真菌基因组行动(fungal genome initiative，FGI)，目的是促进在医药、农业和工业上具有重要作用的真菌代表性物种的基因组测序。2002年2月FGI发表了第一份关于测定15种真菌基因组计划的白皮书。2003年6月，真菌基因组行动发表了第二份白皮书，列出了44种真菌作为测序的目标，强调对其中10个属即青霉属Penicillium、曲霉属Aspergillus、组织胞浆菌属Histoplasma、球孢子菌Coccidioides、镰刀菌属Fusarium、脉孢菌属Neurospora、假丝酵母属Candida、裂殖酵母属Schizosaccharomyces、隐球酵母属Cryptococcus和柄锈病菌属Puccin&的物种优先进行测序。之后，经过FGI、法国基因组学研究项目联(G6nolevures Consortium)、美国能源部联合基因组研究所(The DOE Joint Genome Institute，JGI)DOE联合基因组研究所、基因组研究院(The Institute for Genomic Research，TIGR)、英国The Wellcome Trust Sanger InstimteSanger和华盛顿大学基因组测序中心等共同努力；得到包括美国国家人类染色体研究所、国家科学基金会、美国农业部和能源部等的资助，也有来自学术界和产业集团如著名的Monsanto、Syngenta、Biozentrum、Bayer Crop Science AG和Exelixis等公司的持续合作，在最近的几年里，真菌基因组学研究取得重大突破。至2008年6月1日，共有3734种生物的全基因组序列测定工作已经完成或正在进行，公开发表812个完整的基因组，其中，70余种真菌基因组测序工作已经组装完成或正在组装，分别属于子囊菌门、担子菌门、接合菌门、壶菌门和微孢子虫(Microsporidia)的代表。此外，还有Ajellomyces dermatitidis和Antonospora locustae等20余种真菌基因组序列正在测定中(Bemal etal．2001)。这些真菌都是重要的人类病原菌、植物病原菌、腐生菌或者模式生物，基因组大小为2．5—81．5Mb，包含酵母或产生假菌丝的酵母、丝状真菌，或者具有二型性(或多型性)生活史的真菌，拥有与动物和植物细胞一样的的细胞生理学和遗传学特征，包括多细胞性、细胞骨架结构、生长发育、有性生殖、细胞周期、细胞间信号

传递、牛理规律、DNA甲基化和遗传修饰等，充分体现具有9亿年进化史的真菌生物多样性。由于真菌基因组较其他的真核生物而言相对简单，更容易被测序和注解，易于遗传操作和基因修饰，因而成为真核生物基因组研究的最佳模式生物。真菌基因组学的研究特别是真菌比较基因组学的研究有利于生物进化、系统发生学、药物靶基因、基因发现以及基因功能等方面的研究(Hsiang&Baillie 2006；Xu

etal.2006)。

2真菌基因组测序策略

目前基因组测序主要有两种方法。第一种是全基因组鸟枪测序法(WGS)。Sanger(1977)首先采用这个方法对噬菌体φX174进行了测序，其基本原理是提取基因组DNA并进行酶切，然后将片断亚克隆至2kb 的小嵌件库和10-20kb的大嵌件库中。从两端开始对克隆进行测序(即正义链和负义链)，然后组装成连续的叠连群(contigs)，最终形成完整的基因组。第二种方法是分级鸟枪测序法，跟WGS不同的是基因组DNA提取后被分解并亚克隆至100-500kb的BAC库中。与此同时，也生成小一些的大小约为50kb的黏粒库或者。2-10kb的质粒库。这种分级策略所采用的叠连群最终被映射到已知的染色体位置上，序列的装配只需关注一个小范围内的基因组即可(Pevsner 2003)。这种方法被广泛应用于基因组较大的真核生物基因组测序中，包括真菌基因组和已测序的人类基因组，同时由于Fosmids和BAC技术的应用，使高质量、连续的长片段序列组合成为可能。比如在禾谷镰刀菌Fusarium graminearum的序列草图组合时，使用的框架序列长度达到了5．4Mb，甚至有的框架序列直接原封不动地来自于染色体(Galagan etal．2005b)。

尽管基因组测序取得很大进步，但仍存在一些技术挑战。重复序列是装配WGS序列数据中存在的最大困难。重复序列的适度水平改善了大多数真菌的装配问题。然而，与端粒、着丝点和rDNA阵列关联的高度重复序列仍然是一个难题。通常，这些区域在细菌库中是不被克隆的，然而在另外一些情况下这些区域被克隆和测序但是不能正确地装配。虽然示踪分析(follow up analyzes)能准确地重建端粒，但是用于估计这些高度重复序列区域大小和位置的独立作图方法是必需的(Farman&Leong 1995；Li etal.2005)。重复序列的一个特殊情况是二倍体。在二倍体中，杂合子的范围可能横跨两个不同的染色体区域，在装配过程中低多形性区域不能正确合并，而高多形性区域通常是分离的，结果等位基因的差异很难与明显的旁系同源区分开来。尽管这些复杂问题可以通过测序单倍体来避免，或通过测序一个紧密相联的辅助单倍体使之最小化，但在多数情况下，例如白色假丝酵母Candida albicans，测序一个二倍体是必不可少的(Jones etal.2004；Braun etal.2005)。目前，科学家们正在研究新的装配法则，以便更精确地装配二倍体甚至多倍体的全基因组序列(Vinson etal.2005)。面对真菌基因组测序的挑战，新的作图和测序技术应运而生。至少HAPPY作图法(HAPPY mapping)和光学作图法(optical mapping)提供了无需克隆、将序列定位于染色体特定位点的染色体装配验证。前者是随机地打断基因组DNA，经高通量筛选和PCR检测确定DNA标记的新技术，方法操作简单且不会产生大克隆库(Dear&Cook 1993)。后者是最近研发的适用于染色体装配的技术，其方法是根据巨碱基长度的单一DNA分子图象产生的染色体范围内的限制性内切酶图谱，通过比较silico限制性酶切位点的顺序和距离，提供一个独立的装配验证(Zhou etal．2004)。

测序技术的改进也为进一步地加速真菌基因组学研究提供了保障，如粗糙链孢霉Neurospora crassa 的基因组富含AT，不能利用细菌文库进行有效地克隆，由454生命科学实施的pyrosequencing方法成功地解决传统测序方法所不能产生的基因组序列(Galagan etal2005b)。此外，先进仪器的使用导致大量廉价基因组数据的产生，单一基因组测序的当前成本降低至使其能够测定5-100多个种或菌株的全基因组序列。早期的基因组测序目标是产生高质量的个别菌株或种的参考序列，而现在新的测序技术促使科学家们描述更多亲缘关系菌株的分子多样性。

3真菌基因注释和真菌基因预测

真菌基因注释是借助生物体中相似的线性基因结构分析完成的。真菌基因组编码密度范围为37％

-61％，与其他真核生物一样，真菌基因密度与基因组大小成反比。真菌基因编码序列长度平均在1．3-1．9kb。尽管真菌显示出基因结构的显著多样性，但相对后生动物而言，真菌基因几乎不被内含子所间隔。真菌内含子密度范围多样，担子菌如新型隐球酵母Cryptococcus neoformans的每个基因含5-6个内含子(Loftus etal.2005)；许多最近测序的子囊菌平均每个基因含1-2个内含子(Borkovich etal．2004；Dean etal．2005)；而半子囊菌啤酒酵母中总共不到300个内含子(Goffeau etal.1996)。另外，真菌内含子很小，许多子囊菌的内含子平均只有80-150bp，而担子菌类的新型隐球酵母的内含子较为例外，平均大小为68bp且拥有许多小至35bp的内含子(Loftus etal.2005)。真菌内含子的结构多样性为其进化研究提供了独特的机会。

大多数真菌相对简单的基因结构促进了基因的准确预测。然而，许多真菌种类缺乏重要的EST数据库，使真菌基因预测依赖于de novo基因预测。假使真菌种问的外显子和内含子特征有很大区别，那么关于生物体特征性数据库的基因预测工具的研发是非常重要的，de nOVO基因预测工具为基因预测提供了条件，这些工具包括GenelD(Guigo etal. 992)，FGenesh和FGenesh+(Salamov&Solovyev 2000)，SNAP(Korf2004)，Augustus(Stanke鲥以2004)和GlirnmerM(Salzberg etal. 1999)。除了这些工具之外，GeneWise工程和Exonerate使基因预测能够独立地根据同源蛋白或编码序列的比对而进行(Slater& Birney 2005)。

真菌比较基因预测是一个特别有吸引力的策略，它可以预测相关染色体群，其实用性已经在相关酵母种类的比较注释(Kellis etal.2003)和新型隐球酵母Cryptococcus neoformans的TWINSCAN预测算法中被证实(Tenney etal.2004)。后者是一种运用参考染色体与未知染色体同源性比对的de noVO基因预测算法(Korf etal.2001)。TWINSCAN以新型隐球酵母血清型A作为参考染色体，成功地预测新型隐球酵母血清型D的染色体序列。用已知基因或RT-PCR的结果证实该预测结果中60％-72％是完全正确的。如果利用新型隐球酵母相对复杂的染色体来比较预测其他真菌，其结果将是令人鼓舞的。

多重染色体的比较分析结果表明真菌在基因组水平上存在很大分歧。例如，人们普遍认为相关的子囊菌在大约2亿年以前是同一个祖先(Taylor etal.1999)，然而，将Magnaporthe grisea和粗糙脉孢霉Neurospora crassa的染色体进行对照后发现，相似性47％的氨基酸事实上是没有保守相似性，仅113个区域含有四个或更多的保守共线性基因(Dean etal.2005)。一般认为，完整真菌染色体的分析在一个相对较短的进化时间范围内会迅速打破之前的保守相似性，即使是同属真菌在基因水平上也显示出显著的分歧。通过对Aspergillus nidulans，A．fumigatus 和A oryzae三种曲霉菌的比较，结果表明任意两种曲霉平均仅68％的氨基酸是一致的(Galagan etal. 2005a)，其进化时间间隔与人类和鱼类之间的进化时间间隔相当(Dujon etal. 2004)。在这段进化时间里，大概有70％的A．nidulans可以映射到A．fumigatus或A．orzyae共线群(syntenic block)中，同时A．nidulans中约50％的保守共线群在三种曲霉中都有保留(Galagan etal．2005a)。在这些共线群中，有大量的微小重组片段。这些片段包括许多小的插入片段，是真核生物中的一种共同的重组模式(Aparicio etal.2002；Kellis etal.2003)。但其他的重组方式也相当地普遍，包括转座、部分插入、缺失和复制等。正在进行的试验进化研究证明酵母菌普遍重组方式是复制和转座(Koszul etal．2004)，这些结果有助于真菌基因组的长期进化研究。Wolfe&Shields(1997)预言酵母菌完整的基因组复制伴随着大量的基因缺失，已经被比较基因组分析证实(Duion etal，2004；Kellis etal.2004)，同时揭示这对酵母菌的碳源发酵有重大的影响。同样，在其他真核生物中也证实存在空间重组模式，相当普遍地在近端粒处并伴随重复序列成分的存在(Kellis etal.2003；Lepha etal.2005)。

4生物系统发生的进化关系分析

生物最本质的特征是进化。比较基因组学以进化理论作为理论基石，同时其研究结果又前所未有地丰富和发展了进化理论。完整的全基因组分析可以为生物系统发生学提供更多权威性的答案。Wolf etal.(2001)在全基因组信息的基础上构建了与传统的细菌分类方法不同的进化树，认为原核生物主要分

两个域。在系统发生学的分析研究中，分析对象的基因组信息越多，结果就越可靠。尽管全基因比较研究似乎可以解决分类学上的很多问题，但是还有问题需要考虑并作进一步研究。Soltis etal.(2004)研究表明尽管当整个基因组都研究了，如果跟分类有关的基因数量极低，可能会产生错误的系统发生学结论。

在真菌基因组的研究过程中，人们惊奇地发现，真菌比植物和低等动物与人类亲缘关系更近。Zeng etal etal以(2001)发现约有1000个人类蛋白质与真菌的同源性高于其它动物如线虫或果蝇等，他们推断认为人类基因组的功能基因跟酵母及高等真菌的亲缘关系更近。Cliflen etal.(2003)比较了6个酵母的基因组发现有功能的如调节元件的非编码序列都非常小，一般很难辨认，与它所调控的基因较远。通过寻找这些系统发生学足迹，据此Cliften等(2003)修正了酵母的未知基因的框架，进而发现编码调节蛋白基因。Schoch etal.(2003)详细编录了三个丝状真菌Botryotinia fuckeliana、Cochliobolus heterostrophus和Gibberella moniliformis的kinesin基因家族，并把它们与Saccharomyces cerevisiae和Schizosaccharomyces pombe相比较，结果发现9个亚科的丝状真菌都含有10个kinesin 基因，而酵母kinesin基因则较少。Kellis“etal.(2004)比较了S. cerevistae和Kluyveromyces waltii 基因组，推断s. cerev&iae是最古老生物全基因组的复制品。Zelter etal.(2004)采用比较基因组学的方法在Neurosporacrassa和Magnaporthegrisea基因组中寻找到酵母编码钙信号传导途径的同源基因，且在丝状真菌中编码各种钙信号传导蛋白的同源基因要比酵母多，由此推测可能与丝状真菌具有复杂的细胞结构和在自然环境中接受更广范围的外部信号有关。

虽然在三十年前发现内含子并对其展开深入的研究(Gilbert 1978)，但仍存在许多问题，如内含子的起源、扮演的角色和进化动力学等(Lynch&Richardson 2002)。由于内含子存在于真菌和其他真核细胞基因组内，且真菌染色体的基因密度大、基因结构相对简单，有利于准确预测内含子的界限，加上真菌平均内含子密度的变化，因而有关真菌内含子的研究具有普遍意义，同时为内含子进化研究提供机遇。最近关于真菌内含子的研究为内含子的进化模型和机制提供了新的见解。

Nielsen etal.(2004)研究Aspergillus nidulans、Fusarium graminearum、Magnaporthe gr&ea 和Neurospora crassa四种跨度约3亿3千万年真子囊菌基因组的内含子进化模式，发现内含子在动力学模式上的差异明显，在M. grisea和F. gramm‘earum中，获得与丢失内含子的数量是接近平衡的，但在N.crassa中，丢失的内含子大概是增加内含子的两倍，而且在基因家族之间，内含子获得的速率也是变化的。新增的真菌基因组序列为更长进化间隔的内含子动力学研究提供机会。Stajich etal.(2005)以人和拟南芥Arabidopsis thalmna作为外群，通过对24种真菌内含子的获得和丢失模式进行研究开发出一种估算内含子获得和丢失的最大可能方法，从而计算真菌进化树中在不同节点内含子的密度。

内含子的一个有趣的特征是在目前所有完成序列测定的真核生物中，内含子的密度与位置偏差之间存在相关性，即在内含子较丰富的生物体内，内含子平均地分布在基因的编码序列内，而在内含子贫乏的生物体内，内含子偏向地分布在基因的5'端(Mourier&Jeffares 2003)。这种偏向可能是通过一种来自3’多聚腺嘌呤尾端反转录传递的同源重组剪切机制导致内含子丢失而引起(Roy&Gilbert 2005b)，且已在含有内含子的酵母菌Ty因子中得到证实(Boeke etal.1985)。Nielsen etal.(2004)研究结果显示，内含子丢失是单独的，至少在隐球菌和真子囊菌的最近演变历史上并没有足够的证据说明内含子丢失存在5’位置偏向。同样，对四个密切相关的隐球菌种类的内含子丢失研究标明，内含子丢失并不能用基因转化来解释，推测内含子丢失是通过RNA重组形成的，更有趣的是，内含子丢失全部发生在基因中间，完整无缺的内含子则留在在3'末端(Staiich&Dietrich 2006)。

根据现有数据库信息，内含子丢失在某些真菌的进化分支中占优势，这与利用植物、动物、原生动物以及两种真菌Saccharomyces cerevisiae和Schizosaccharomyces pombe等8个基因组的研究结果一致(Roy&Gilbe 2005a)。随着更多真菌基因组序列被测序，有关内含子进化的神秘面纱将被揭开。

5真菌致病性与抗真菌药物研发

真菌感染威胁人类的健康(Swartz 1994)。真菌对与爱滋病和白血病有关的免疫抑制或治疗性抑制免疫患者是致死性的。在美国每年由曲霉菌引起的患者超过一万，致死率达20％(Dasbach etal.2000)。酵母感染则更为普遍，例如2002年在加拿大新型隐球酵母Cryptococcus neoformans至少感染59例，引起两例死亡(Hoang etal.2004)。由球苞菌Coccidioides immit&引起的谷热病仅在美国每年就超过100000个案例发生(Chiller etal.2003)。植物病原真菌对农业也具有破坏性影响。真菌感染所有主要庄稼，并通过真菌毒素的产生导致食物污染(Strange&ScoR2005)。仅在美国，估计每年因植物病害损失330亿美元(Madden&Wheelis 2003)。由Magnaporthe grisea引起的稻瘟病估计每年毁坏的稻米足够养活60万人口(Zeigler etal.1994)。

科学家们试图用比较基因组学的方法来分辨病原菌和非病原菌。Hsiang&Goodwin(2003)采用植物的全基因组和病原真菌的比较进而从被真菌感染的植物组织中获得起源ESTs。由于目前研究的植物基因比真菌基因多，他们认为这种方法比起比较GenBank中NR数据要更容易定位那些与分类有关的序列。在GenBank中发现与其匹配的植物基因序列不能保证就是起源基因。Xu etal.(2003)采用相似的方法去设计32个非配对的序列探针，从非感染组织中找到了22个序列，从感染组织中找到了10个序列。当宿主和病原菌的基因组信息都完全被测序时，将很大程度上有利于人类疾病的研究。对于植物病理来说，目前宿主和病原菌被测序的还比较少。此外，植物的真菌性疾病，宿主和病原菌都是真核生物，它们的序列就更难区分。

由于真菌是真核生物，针对真菌开发的治疗药物比起细菌性病原微生物治疗药物更加困难，目前有效的抗真菌药物很少。大多数现有的药物有严重的副作用，对这些化合物的抗药性是一个新增的问题(Georgopapadakou 1998)。对医疗上重要真菌基因组分析有可能解决上述临床问题，特别是几个致病性真菌的基因组已经被完全测序，这样与人类不存在同源性且为真菌生长所必须的基因的预测成为可能，而且成为研究弱毒副作用的杀真菌药物的一个靶标。这种方法已被用于研究抗白色假丝酵母Candida albicans药物(Jones etal.2004)。在白色假丝酵母的基因组序列中发现了228个基因，这些基因都存在于其它5个被测序的真菌基因组中，但在人或老鼠基因组中缺乏同源性(Braun etal.2005)。这些基因是利用小分子物质抑制白色假丝酵母的潜在靶标。Hsiang&Baillie(2005)比较了14个真菌与动物、植物以及细菌的基因组，发现了17个真菌特有的基因。他们指出其中7个基因可以用于抗真菌药物的靶基因研究。Kessler etal.(2002)比较了Aspergillus fumigatus与Saccharomyces cerevisiae，Schizosaccharomyces pombe和Candida albicans三种酵母的3000个cDNA序列，结果发现49％的cDNA 序列E值≤10-5，认为这些序列可能是A.fumigatus的特有基因，可以作为研究抗A.fumigatus类真菌的靶基因。

真菌中病原真菌给人类健康带来了极大危害，但有些真菌的次生代谢产物在药物的生产和发展方面有非常重要的作用，这些次生代谢产物包括Lovestatin和抗生素如青霉素，头孢霉素和环孢霉素。丝状真菌基因组揭示了令人意想不到的次生代谢产物的编码基因的普遍性(Yu & Keller 2005)。越来越多的基因组资源给人类利用真菌提供了更深层次的认识。

6真菌基因组学的未来

真菌种类庞大而多样，分布广泛，甚至在某些海洋环境和极端环境下也有真菌存在。完整真菌基因组的测序为真核界乃至整个生物界进化研究提供了空前的机会，重要的人类病原菌、植物病原菌和腐生菌基因组序列的测定，不仅推动繁殖方式的选择、顶端生长、致病机制、宿主-真菌相互作用等基础研究，还能更好地寻找抗菌药物靶点，促进疫苗和抗菌药物的开发研制。应用比较基因组学方法研究真菌基因组有助于人们理解不同生境下真菌的生理特性、形态差异、进化和代谢多样性。但是，序列只是真菌基因组学的冰山一角。基因组序列的公开已经推动了全基因组范围内针对不断增加的真菌物种功能研究的发展，最终这些研究将形成一种新的方法——生物系统方法，使之能够解释真菌生物学和进化，尤其是以生物学为基础的医学、农业及真菌对环境的影响。相信随着迅速发展的高通量方法应用于真菌基因组

学研究，将会大大地推动此研究领域的快速进展。