水稻抗稻瘟病Pib 基因的分子标记辅助选择与应用
中国农业科学 2008,41(1):9-14 Scientia Agricultura Sinica
收稿日期：2006-10-31；接受日期：2006-12-19
基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划（IRT0453）
作者简介：刘 洋（1982-），男，四川绵阳人，硕士研究生，研究方向为水稻抗病育种研究。Tel ：028-********；Email ：lys999000@https://www.360docs.net/doc/207175260.html, 。通
讯作者吴先军（1964-），男，教授，博士，研究方向为作物遗传育种与分子生物学。Email ：wuxjsau@https://www.360docs.net/doc/207175260.html,
水稻抗稻瘟病Pib 基因的分子标记辅助选择与应用
刘 洋，徐培洲，张红宇，徐建第，吴发强，吴先军
（1四川农业大学水稻研究所，四川温江 611130；2四川农业大学/西南作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室，四川雅安 625014）
摘要：【目的】为探索抗稻瘟病Pib 基因的分子标记用于水稻抗稻瘟病辅助选育，36个四川地方稻瘟病菌株被用来检测Pib 基因的抗性。同时利用检测感病等位基因Pib 的显性标记Lys145，并结合前人报道的检测抗病等位基因Pib 的显性标记Pibdom 组成一套水稻抗稻瘟病基因Pib 显性分子标记。【方法】利用这套水稻抗稻瘟病基因Pib 显性分子标记对122个杂交稻亲本或材料进行分子鉴定，并分别采用稻瘟病菌株05-12（ZB13）和05-30（ZC15）单小种接种试验进行致病性测试。【结果】所检测的122个杂交稻亲本或材料中，只有7个杂交稻亲本或材料含抗病基因Pib ，且对稻瘟病菌菌株ZB13和ZC15表现抗病反应。此外，利用这套水稻抗稻瘟病基因Pib 显性分子标记对600个杂交F 2代单株进行早期筛选，得到185个抗病基因Pib 纯合的单株，田间抗性调查结果与抗病基因分子检测结果一致。【结论】该套显性分子标记可应用于水稻抗稻瘟病基因Pib 的分子标记辅助选育。
关键词：水稻；抗稻瘟病基因Pib ；分子标记；辅助选择
Marker-assisted Selection and Application of Blast
Resistant Gene Pib in Rice
LIU Yang, XU Pei-zhou, ZHANG Hong-yu, XU Jian-di, WU Fa-qiang, WU Xian-jun
(1Rice Research Institute, Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, Sichuan ; 2Key Laboratory of Southwest Crop Genetic
Resources and Improvement, Ministry of Education of China, Sichuan Agricultural University, Yaan 625014, Sichuan )
Abstract: 【Objective 】In order to explore the feasibility of utilization of molecular markers of rice blast resistance gene Pib in marker-assisted selection, resistance identifications of Pib gene were performed with 36 rice blast fungus strains collected in Sichuan. A set of dominant molecular markers of blast resistance gene Pib was established by dominant marker Lys145 of the susceptible alleles Pib gene, coupled with the dominant marker Pibdom as of previously reported. 【Method 】 The dominant molecular markers of the rice blast resistance gene Pib were used to identify the presence of Pib gene in 122 hybrid parents and breeding materials. 【Result 】Pathogenicity assays with the single race inoculation of rice blast fungus strains 05-12 (ZB13) and 05-30 (ZC15) indicated that only 7 of the 122 hybrid parents and materials contained the resistance gene, which also showed resistance to the both strains of rice blast fungus. In addition, a pair of dominant markers Pibdom and Lys145 was used to screen the 600 F 2 individuals at the early stage. 185 of 600 F 2 plants containing homozygous Pib gene were isolated. At the same time, the rice blast resistances in the field were investigated. 【Conclusion 】 The results demonstrated that the presences of resistant gene were consistent the resistance in the field test. Therefore, the set of dominant markers could be used in marker-assisted selection of the rice blast resistance gene Pib .
Key words: Rice (Oryza sativa L.); Rice blast resistance Pib gene; Molecular markers; Marker-assisted selection
0 引言
【研究意义】稻瘟病是由真菌 Magnaporthe grisea
（Hebert ）Barr 引起的，被公认为水稻三大病害之一[1]。目前主要还是通过传统的化学防治和种植抗性品种来控制病害。但化学防治不但加重了农民的负担而且因
10 中国农业科学41卷
为缺乏长期有效的杀菌剂，对环境也有很严重的污染。传统选育方法依赖于抗性鉴定和表型选择，不仅周期长而且受许多条件的限制，再加上病原菌小种遗传的复杂性和致病性的多样性，使得抗病新品种在推广几年内很快丧失抗性，在适宜于稻瘟病菌的环境条件下，造成大面积粮食减产。【前人研究进展】随着DNA 分子标记技术的迅猛发展，利用与抗病基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，可加速抗源筛选和抗病基因的鉴定，从而大大提高育种选择效率[2]。作物育种实践中已开发了许多种分子标记，常用的有RFLP、RAPD、AFLP和SSR等[3]。但这些分子标记都存在一些不足，在实际应用中有一定局限性。随着抗病基因的克隆，利用抗病基因序列本身来建立相应的分子标记，已成为正确选择抗病基因的更有效途径。Pib基因位于水稻第2染色体长臂末端附近的区域，属于一个很小的基因家族（Pib，PibH8，HPibH8-1，HPibH8-2）。Pib基因编码由1 251个氨基酸残基组成的含一个核苷酸结合位点（nucleotide binding site，NBS）和富含亮氨酸重复（leucine-rich reports，LRR）的蛋白质。该蛋白质N端的NBS区存在激酶1a、2和3a结构域的重复单位，LRR中部有8个成簇的胱氨酸残基[2,4]。【本研究切入点】本研究利用36个四川地方菌株对Pib基因进行抗性鉴定，检测Pib基因对四川稻瘟病菌的抗性。【拟解决的关键问题】同时，利用的感病等位基因Pib显性分子标记，并结合前人报道的抗病等位基因Pib显性分子标记，组建一套Pib 基因分子标记对122个杂交稻亲本或材料进行分子鉴定。此外，对两个以IRBLb-B和F-145-2为亲本的F2杂交群体的600个单株进行了抗病基因Pib的早期检测，并结合田间稻瘟病菌人工接种试验验证该套标记是否在水稻抗病育种辅助选择中具有应用价值。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试水稻材料为IRBLb-B、F-145-2和93-11及蜀恢363、蜀恢527、D62B等122个杂交稻亲本或育种中间材料。IRBLb-B和F-145-2是由中国农业科学院作物科学研究所雷财林博士提供； 93-11是江苏里下河农业科学研究所培育的籼稻品种。IRBLb-B和F-145-2是以丽江新团黑谷为轮回亲本选育的单抗性Pib基因材料[5,6]，而93-11不含有Pib基因。因此本试验分别以IRBLb-B和F-145-2为抗病亲本，93-11为感病亲本。
其余120个材料系四川农业大学水稻研究所近年育成的杂交稻亲本或育种中间材料。2006年3月在海南，分别以IRBLb-B和F-145-2为母本，蜀恢363、蜀恢527和D62B为父本，配制6个杂交组合，同年夏季在四川种植F1；2006年9月，每个F2代组合各选100粒种子种于四川农业大学水稻研究所试验场进行苗期抗病性测试。
1.2 供试菌株菌液制备和接种鉴定
对Pib基因进行抗性鉴定的菌株为05-7（ZA13）、05-12（ZB13）、05-3（ZB15）、05-30（ZC15）、05-16（ZD7）、05-23（ZE3）、05-2（ZF1）、05-11（ZG1）等36个；对122个杂交稻亲本材料和早期测试的600个F2单株进行单小种接种鉴定的菌株为05-12（ZB13）和05-30（ZC15）。供试菌系均由四川农业大学水稻研究所植物保护实验室提供。菌株培养和菌液制备按凌忠专介绍的方法[7]进行。
在水稻苗期，采用标准喷雾法进行接种鉴定[8]。孢子液浓度为100倍视野平均孢子数50～80个，喷雾接种后，24℃保湿培养48 h。7～10 d后，感病品种（以汕优63为对照）病情稳定时，调查病斑大小和数量。根据叶瘟鉴定标准，分为5级：0级表示无病斑；1级表示有褐点型病斑，呈过敏性反应；2级表示单个病斑长径不超过2 mm，周围褐色，中间灰白色；3级表示单个病斑长径超过2 mm，周围褐色，中间灰白色；4级表示单个病斑长径超过2 mm，周围无色或紫色，中间灰白色。其中将0，1和2级反应的植株归入抗病（R）类型，3和4级为感病。
1.3 水稻基因组DNA提取
在水稻4叶期，分别取上述亲本材料和F2群体各单株的新鲜叶片，按McCouch[9]提供的方法提取DNA。
1.4 PCR扩增
PCR扩增引物采用Concetta[10]报道的Pibdom显性分子标记，能特异性扩增出抗病等位基因Pib的相应片段序列；同时利用已测序的籼稻品种93-11且与Pib基因相对应的序列作为感病序列，与抗病基因Pib 在DNA序列上的多态性设计能特异性扩增出感病等位基因Pib的相应片段序列。用于PCR扩增反应的引物名称、序列、位置及其扩增片段预期大小见表1。引物序列由英骏生物技术有限公司合成。PCR反应体系为25 μl，含2.5 μl10×Buffer，2.0 μl dNTP，3.0 μl 4 mol·L-1正向和反向引物，0.2 μl 4 U·μl-1 Taq酶，3.0 μl 20 ng·μl-1模板DNA，14.3 μl 纯净水。PCR反应程序
1期刘洋等：水稻抗稻瘟病Pib基因的分子标记辅助选择与应用 11
表1 用于PCR反应的引物名称、序列、片段预期大小及其在Pib基因的位置
Table 1 Name, sequence, expected fragment size and its position in Pib gene of specific primers used for PCR
引物名称Primer 序列Sequence(5′-3′)*位置 Location 片段预期大小Expected size (bp)
PibdomF GAACAATGCCCAAACTTGAGA 8699～8720**
PibdomR GGGTCCACATGTCAGTGAGC 9016～8996**
365
Lys145F TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT 37285710～37285729***
Lys145R GGGAAGCGGATCCTAGGTCT 37286477～37286458***
803
乙锭染色，紫外灯下观察拍照。对122个杂交稻亲本或材料和早期测试的600个F2单株进行PCR检测时，每个样品重复3次。
2 结果与分析
2.1 Pib抗性基因的抗谱
为了验证Pib基因在四川抗病育种中是否有利用价值，用36个四川搜集的菌株喷雾接种IRBLb-B和F-145-2两个近等基因系材料，采用生产上常用感病品种汕优63作为对照（表2）。在36个供试菌株中，IRBLb-B和F-145-2分别抗26和31个菌株的侵染，抗性频率分别为72.2%和86.1%，二者抗性频率相差13.9%。
2.2 Pib分子标记在种质资源鉴定中的应用
亲本材料是培育作物新品种的基础[11]。利用两对显性分子标记Pibdom和Lys145对122个杂交稻亲本或材料进行了PCR检测。结果表明，显性分子标记Pibdom能特异性扩增出一条大小约350 bp的片段，显性分子标记Lys145能特异性扩增出一条大小约800 bp的片段。图1列出了17个在四川育种中具有代表性的杂交稻亲本和7个含Pib基因的材料。在122个杂交稻亲本或材料中，仅有7个杂交稻亲本或材料含有抗稻瘟病基因Pib，而其它115个杂交稻亲本或材料则不含Pib基因。
为了验证Pib基因分子标记与稻瘟病抗性是否一致，分别用稻瘟病菌菌株05-12（ZB13）和05-30（ZC15）对122个杂交稻亲本或材料进行单小种接种鉴定测试。结果表明，这两个稻瘟病菌株对测试杂交稻亲本或材料的抗病反应结果完全一致。在122个杂交稻亲本或材料中，94-4、HA303和05H38等7个杂交稻亲05-7（A13） R R S
56（A49） R R S 巴中-05（A5） R R S
04-25（A1） S R S
04-15（A1） S R S
04-1（A15） R R S
05-12（B13） R R S
05-3（B9） S S S 04-27（B15） S R S
04-10（B13） R R S
05-29（B31） R S S
05-30（C15） R R S
64（C5） S R S 59（C15） R R S 04-44（C16） R R S
贵州05（C11） R R S
长赤05（C7） R S S
51（C15） R R S 05-16（D7） R R S
67（D3） R S S 58（D7） R R S 04-16（D1） S R S
04-8（D5） R R S 05-23（E3） R R S 60（E3） R R S 04-18（E1） R S S 04-7（E3） R R S 05-2（F1） R R S 63（F2） S R S 04-21（F2） S R S 61（F1） R R S 04-22（F2） S R S 57（F2） S R S 05-11（G1） R R S
04-23（G1） R R S
54（G1） R R S R表示抗病; S表示感病 R: Resistant; S: Susceptible
12 中 国 农 业 科 学 41卷
抗病反应 R R S S S S R S S R S S
S S S R S S R S S R S S
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
A 为抗病等位基因Pib 显性分子标记Pibdom 扩增产物；
B 为感病等位基因Pib 显性分子标记Lys145扩增产物。抗病反应分别采用稻瘟病菌菌株05-12（ZB13）和05-30（ZC15）进行单小种接种鉴定测试，R. 抗病；S. 感病（1～24泳道分别为杂交稻亲本或材料IRBLb-B 、F-145-2、93-11、明恢63、R128、多恢1号、94-4、6078、E32、838、成恢047、成恢149、R448、江恢151、蜀恢527、HA303、乐恢188、蜀恢362、05H38、蜀恢101、蜀恢363、Pib 粳、D62B 、珍汕97B ，箭头所指的为DNA 预期片段大小）
A: Amplification products obtained with the resistant Pib dominant marker Pibdom; B: Amplification products obtained with the recessive Pib dominant marker Lys145. Resistance was determined by the single race inoculation of rice blast fungus strains 05-12(ZB13) and 05-30(ZC15), respectively, R indicated resistant; S indicated susceptible(Lanes 1-24 are hybrid parents and materials IRBLb-B,F-145-2,93-11, minghui63, R128, duohui1, 94-4, 6078, E32, 838, chenghui047, chenghui149, R448, jianghui151, shuhui527, HA303, lehui188, shuhui362, 05H38, shuhui101, shuhui363, Pib jing, D62B and zhenshan97B. The expected size of fragments showed as arrows)
图1 Pib 基因分子标记对部分供试材料的PCR 扩增结果及其抗病反应
Fig. 1 PCR amplifications and its resistance in greenhouse of some materials using Pib specific markers
本或材料都抗ZN57和ZN61，且都含有Pib 基因。表明该套分子标记能快速而准确地鉴定出含Pib 基因的水稻种质资源，为稻瘟病抗性育种的抗源亲本选择提供有效方法和科学依据。
2.3 Pib 分子标记辅助选择稻瘟病抗性育种
利用这套分子标记对来源于IRBLb-B 和F-145-2杂交的600个F 2单株进行了PCR 扩增，结果见表3。600个F 2单株中筛选出185个抗病基因Pib 纯合的
表3 600个F 2单株中Pib 基因的分子检测及其田间稻瘟病抗性
Table 3 Molecular survey and field resistance of Pib of 600 plants from 6 F 2 populations
杂交组合
Cross combination 抗病反应
Disease reaction
Pib 基因纯合植株数 No. of plants containing homozygous Pib gene
Pib 基因杂合植株数 No. of plants containing heterozygous Pib gene
无Pib 基因植株数
No. of plants not containing Pib gene
IRBLb-B/D62B 抗病R 28 46
0 IRBLb-B/D62B 感病S 0 0 26 IRBLb-B/蜀恢363 抗病R 35 44 0 IRBLb-B/Shuhui 363 感病S 0 0 19 IRBLb-B/蜀恢527 抗病R 36 40 0 IRBLb-B/ Shuhui527 感病S 0 0 24 F-145-2/D62B 抗病R 27 45 0 F-145-2/D62B 感病S 0 0 28 F-145-2/蜀恢363 抗病R 32 38 0 F-145-2/ Shuhui 363 感病S 0 0 29 F-145-2/蜀恢527 抗病R 27 41 0 IRBLb-B/ Shuhui527 感病S 0 0 32 总计Total
185
254
158
在田间抗性鉴定中，3个植株因死亡而未获得结果 No results were obtained in three plants in field
1期刘洋等：水稻抗稻瘟病Pib基因的分子标记辅助选择与应用 13
单株。同时，以600个F2单株为材料对Pib基因与田间抗病性关系进行调查。结果表明，所有抗病基因Pib 纯合单株和杂合单株均抗病，而所有无Pib基因的单株均感病。表明抗稻瘟病基因Pib存在状态与稻瘟病的田间抗性表现一致且Pib基因表现为显性性状。
3 讨论
3.1 Pib基因分子标记建立的意义
利用目标性状紧密连锁的分子标记进行辅助选择是提高育种效率的有效途径[12,13]。但是目标性状与标记间的重组率在不同的群体中是有一定的差异，且往往目标性状的定位群体不是育种群体，因此在实际应用中，要求用于辅助选择的分子标记与目标性状的重组率必须较低，所以受到很大的局限性[14,15]。因此,最好的办法是利用抗病基因本身来建立相应的分子标记[16]。抗病基因的克隆为建立这种标记提供了可能。王忠华等[16]根据已经被克隆的Pi-ta基因，建立了Pi-ta 基因分子标记。并成功的将这套分子标记运用到水稻稻瘟病抗性辅助育种中。并将该类标记进行辅助选择定义为功能基因辅助选择（function-assisted selection，FAS）本文所提到的Pib基因分子标记正是根据抗病基因Pib本身建立的。利用这类标记对目标基因能够进行准确的选择，在加速抗源筛选，抗病基因的鉴定和更快地培育出高抗水稻品种都具有重大意义。
3.2 Pib基因分子标记在辅助选择研究中的应用
以往利用显性分子标记Pibdom分子检测时仅能检测到该材料是否含有抗病基因Pib，并不能直接确定纯合的抗病基因Pib材料。如果要选择到纯合单株，还需要通过几个世代的田间抗性鉴定来区分，既费时，又易受到环境影响而得不到准确的结果。本实验利用显性分子标记Pibdom和Lys145建立一套抗病基因Pib本身的分子标记进行分子检测，并结合海南加代，一年内可在杂种分离世代F2选择出含抗稻瘟病基因Pib的纯合单株，并通过田间抗性鉴定验证，结果完全相符。说明利用这套分子标记能够在分离世代群体中快速、准确地选择出含抗稻瘟病基因Pib的纯合单株，从而可以简化繁琐的田间抗性鉴定。
目前生产上使用的大部分杂交稻亲本及其组合都不抗稻瘟病。Pib基因是个主效抗病基因，在抗病育种中是一个很好的选择。应用所建立的这套分子标记可在众多的水稻资源中快速而准确地选择出抗稻瘟病基因Pib。而且可用这套标记选择到的亲本通过常规杂交育种的方法可将Pib抗病基因转到水稻品种中从而产生抗性，同时，利用MAS技术将其它抗病基因与Pib基因一起聚合到同一优良品种中，产生持久抗性从而最大程度地维持优良品种的使用年限。陈学伟等[17]利用与抗病基因紧密连锁的序标位STS 及 SSR 标记OSR20，OSR32，RM213，RM207，RM262，跟踪筛选了抗稻瘟病基因，将Pi-d（t）1，Pib，Pi-ta2聚合于G46B中，在相对较短的时间内，培育出了抗多个生理小种的相对持久的抗病品系。笔者所在实验室正在利用此类分子标记聚合Pib和Pi-ta多个抗稻瘟病基因，从而进一步利用Pib基因培育持久抗性品种，为最终实现水稻抗病育种的目标奠定基础。
3.3 展望
目前许多水稻抗稻瘟病基因仍然没有克隆出来，因此这类分子标记还是有一定的局限性。需要通过各地工作者的信息交流、深入合作和长期不懈地努力，开发这类分子标记加速分子标记辅助选择在作物育种中的应用。同时，利用分子标记对多个基因的导入或多个性状的同步改良已成为分子标记辅助育种发展的新方向，并结合其它技术手段，例如转基因技术、花药培养技术等，以更快的速度培育出具有优良抗病性的新品种，并最终实现品种设计育种理念的新突破。
4 结论
本研究中，利用抗稻瘟病基因Pib自身序列及其等位的感病基因序列建立的分子标记结合运用，可有效地从水稻种质资源中快速而准确地选择出抗稻瘟病基因Pib，并能在分离世代群体中选择出含抗稻瘟病基因Pib的纯合单株。这为抗源筛选和快速培育高抗水稻品种提供了一种新途径。
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Marker-assisted selection and pyramiding for three blast resistance genes, Pi-d(t), Pib, Pi-ta, in rice. Chinese Journal of Biotechnology, 2004, 20(5): 708-714. (in Chinese)
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