菌种的选育

菌种的选育
菌种的选育

第一章菌种选育

第一节工业常用微生物及要求

一、常见微生物

(一)细菌(bacteria)

发酵工业中常用的细菌主要是杆菌,主要有:

醋杆菌属(Acetobacter)

乳杆菌属(Lactobacillus)

杆菌属(Bacillus):α-淀粉酶,蛋白酶,肌苷、鸟苷等核苷。其中最为重要的是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

短杆菌属(Brevibacterium):谷氨酸

棒杆菌属(Corynebacterium):谷氨酸

(二)放线菌(actinomyces)

属原核微生物(有菌丝体,无横隔,不具完整的核。)最大的经济价值在于产生多种抗生素(antibiotic)。

链霉菌(Streptomyces):红,金,土,氯,链霉素

小单孢菌属(Micromonospora):庆大霉素

(三)霉菌(mould)

亦称丝状真菌(不是分类学上的名词,凡在营养基质上形成绒毛状,网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。)

1.曲霉属(Aspergillus)

黑曲霉(A. niger)产蛋白酶,淀粉酶,果酸酶,变异菌株产柠檬酸

米曲霉(A. oryzae)产淀粉酶,蛋白酶,酿酒的糖化曲和酱油曲

黄曲霉(A. flavus)产黄曲霉毒素

米曲霉和黄曲霉均为半知菌。

2.青霉属(Penicillum):例如桔子上的绿色斑点

桔青霉(P. citrinum):产生5’-磷酸二酯酶,降解核糖核酸为四个单核苷酸。

3.根霉属(Rhizopus)接合菌

米根霉(R. oryzae)

华根霉(R. chinensis)

酒药和酒曲中含有米根霉或华根霉。

4.红曲霉属(Monascus)

淀粉酶,麦芽糖酶,蛋白酶,柠檬酸等。可生产食用红色素。

(四)酵母(yeast)

单细胞真核微生物,低等真菌。

①酵母属(Saccharomyces)

啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

②假丝酵母属(Candida)

产朊假丝酵母(Candida utilis)生产饲料酵母,其蛋白质和维生素含量都比啤酒酵母高。可利用糖蜜,土豆淀粉废液生产人畜可食用蛋白质。

③毕赤酵母属(Pichia)

产膜酵母,在液面形成白膜,是酿造物和酒类饮料的污染菌。

(五)其它微生物

1.担子菌(basidiomycetes)

即菇类(mushroom)担子菌资源的利用已经引起人们的重视。可用于多糖及抗癌药物开发。

2. 藻类(alga)是分布极广的一类自养微生物资源,许多国家把它用作人类保健

食品和饲料。从蛋白质产率看,螺旋藻是大豆的 28倍,每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20~35倍。

(六)噬菌体(phage)凡用细菌和放线菌为生长菌株的发酵工业,均存在噬菌体的危害问题。噬菌体在自然界分布极为广泛。其三大特点是:

①体积比细菌小的多,可以通过细菌滤器。

②没有细胞结构,由核酸的蛋白质构成。

③营专性活物寄生,即只能在特异性寄主细胞中增殖。

烈性噬菌体——引起寄主细胞迅速裂解。受感染的细菌称敏感性细菌。

温和噬菌体——随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。

噬菌体危害以细菌和放线菌为生产菌株的发酵工业。

二、微生物工业对菌种的要求

1.原料廉价,生长迅速,目的产物产量高。

2.易控制培养条件,发酵周期较短。

3.抗杂菌和噬菌体的能力强。

4.菌种遗传性能稳定,不易变异和退化,不产生任何有害的生物活性物质和毒素,

保证安全生产。

第二节工业微生物菌种的选育

在正常生理条件下,微生物依靠其代谢调节系统,趋向于快速生长和繁殖。

但发酵工业需要培养微生物使其积累大量的代谢产物。所以要采取种种措施打破菌的正常代谢,积累所需要的代谢产物。如青霉素的原始菌种产黄色素,经菌种选育,可使产生菌不再分泌黄色素。土霉素产生菌产生大量泡沫,经诱变处理改变遗传特性可使泡沫减少,节省大量消泡剂。菌种经诱变获得抗phage的特性。

菌种选育的目的是改良菌种的特性,使其符合工业生产的要求。

一、自然选育:从自然界分离获得菌种,根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌

㈠从自然界分离获得菌种

1.采样:取地面5~15 cm的土壤。

2.增殖培养:(富集培养enrichment) 提供有利于所需菌株生长而不利于其它菌

型生长的条件,使所需菌株大量繁殖,从而有利于分离它们。

方法:

(1)控制培养基的营养成分:如淀粉琼脂培养基用于丝状真菌增殖。

(2)控制培养条件:

细菌,放线菌:pH7.0~7.5 35~37℃

霉菌,酵母菌:pH 4.5~6.0 20~28℃

(3)抑制不需要的菌类

分离细菌:加入丙酸钠以抑制霉菌,酵母

分离厌氧菌:焦性没食子酸与氢氧化钠反应除氧

3.纯种分离

(1)划线法:简单、快速。

(2)稀释法:在培养基上分离的菌落单一均匀,获得纯种的几率大,适合分离具有蔓延性的微生物。

固体培养基四区划法接种法

步骤一

接种针先以火焰灭菌法灭菌

步骤二

轻触营养平板上无菌的琼脂处冷却

步骤三

以接种针轻触菌落,使接种针上沾有细菌。

步骤四

更换一个新的无菌营养平板

步骤五

将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区。

步骤六

重复第一步骤,将接种针以火焰灭菌法灭菌,然后轻触琼脂无菌处冷却。

步骤七

由第五步骤的第一区中划出第二区,如右上图。

步骤八

重复第六以及第七步骤,由第七步骤的第二区中划出第三区,如右上图。

步骤九

重复第六以及第七步骤,由第八步骤的第三区中划出第四区,划满剩下的空间。

完成后的营养平板,如右上图。

步骤十

在营养平板上贴好标签,标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及培养基名称。

固体培养基的稀释涂抹接种法

【目的】用来分离单一菌落或用来估计样本中微生物的数目。

需要使用的仪器——震荡机

吸取准备好欲稀释的菌液

吸取充分均匀后的菌液

取含有 9mL无菌水之试管,将试管口过火灭菌。将菌液置入,此时试管须做记号为第一次稀释。

将试管于震荡机上,使菌液混合均匀

取出试管中的第一次十倍稀释菌液1mL,加入另一个新的含9mL无菌水的试管中。重复此步骤直至所需要的稀释浓度。

从最后稀释菌液中吸取 0.1mL菌液,置入准备好的无菌琼脂内。

将三角玻璃棒浸于酒精中

将三角玻璃棒在火焰上燃烧(须注意勿使燃烧中的酒精滴入酒精瓶中,引起燃烧)

使用玻璃棒将菌液均匀涂布开来,将培养皿置于恒温培养箱中隔天观察菌落数目,再依照稀释倍数推算出菌液浓度。

4.生产性能的测定:纯种分离后得到菌株数量大,不可能一一进行性能测试。一般采用两步法:初筛,复筛。从而获得较好菌株(野生型菌株)(区别于变异菌株)。

初筛:以量为主

复筛:以质为主

㈡从自发突变体中获得菌株

微生物可遗传的特性发生变化称变异,又称突变,是微生物产生变种的根源,也是育种的基础。自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。但自发突变的频率较低,往往不能符合工业生产的要求。因此要利用诱变剂提高菌种的突变频率。

二、诱变育种

用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变。是当前菌种选育的一种主要方法。因为人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱,速度快,方法简便。但诱发突变随机性大,必须与大规模的筛选工作相配合。所以诱变育种的主要环节是:(1)以合适的诱变剂处理细胞悬浮液——诱变

(2)用合适的方法淘汰负效应变异株,选出性能优良的正变异株——筛选诱变剂:能够提高生物体突变频率的物质。

诱变剂:

物理:紫外线,快中子

化学:硫酸二乙酯,亚硝基胍

1.诱变育种的程序

选择出发菌株(parent strain)→制备菌悬液→前培养(添加嘌呤,嘧啶或酵母膏提高变异率)→诱变(物理诱变,化学诱变)→变异菌株的分离和筛选

2.突变株的筛选:

摇瓶筛选法:挑单菌落接斜面→接摇瓶→测生产能力

琼脂块筛选法:打孔器取出培养,置鉴定平板测发酵产量。

①随机筛选:传统方法,但要耗费大量的人力物力。近年来,随着遗传学,生

物化学知识的积累,人们对于代谢途径,代谢调控机制了解得更多,所以筛选方法逐渐转向理化性筛选。

②理化性筛选:介绍初级代谢产物高产菌株的筛选。根据代谢调控机理,氨基

酸、核苷酸合成途径中普遍存在反馈阻遏和反馈抑制。这对于生产菌本身是有意义的,可以避免合成过多的代谢物而造成的浪费。但在工业中,需要生产菌产生大量的氨基酸,核苷酸等产物。所以要打破微生物原有的反馈调节系统。

方法㈠降低终产物浓度

a.筛选终产物营养缺陷型

获得缺少第三个酶的突变株,需供给E才生长。限量供给E,可打破反馈调节,产生大量C。

b.筛选细胞膜透性改变的突变株

使终产物排出细胞,以降低细胞内终产物浓度,避免终产物反馈调节。

如:用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的生物素营养缺陷型(biotin deficiency)进行谷氨酸发酵。

生物素:是B族维生素的一种。又称维生素H或辅酶R。生物素是合成脂肪酸所必需的。因为脂肪酸的生物合成是:

利用糖代谢中间产物乙酰CoA(直接原料是丙二酸单酰CoA)在乙酰CoA 羧化酶(多酶复合体,辅基为生物素)催化下合成。

因此,脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。

该缺陷型在生物素处于限量的情况下,不利于脂肪酸的合成,因而使细胞膜的渗透性发生变化,有利于谷氨酸透过细胞膜分泌至体外的发酵液中。

如果使用油酸缺陷型菌株或甘油缺陷型菌株,即使在生物素过量的条件下,也可使谷氨酸在体外大量积累。

㈡筛选抗反馈突变菌株

a.筛选结构类似物抗性突变株

用代谢产物的结构类似物处理微生物细胞,可抑制或阻遏自身的合成酶类。因此细胞由于缺少这种氨基酸不能生长或者死亡。而那些对该结构类似物不敏感的突变株,仍可生长,从而可以筛选出该代谢物的抗反馈突变株。

b.利用回复突变筛选抗反馈突变菌株

出发菌株经诱变处理,获得对产物敏感的营养缺陷型。再将营养缺陷型进行第二次诱变处理得到恢复突变株。筛选的目的不是要获得完全恢复原有状态的回复突变株,而是希望经过两次诱发突变所得的回复突变株不受产物的反馈抑制。

如:谷氨酸棒杆菌的肌苷酸脱氢酶的回复突变株对其终产物鸟苷酸的反馈调节不敏感,从而提高了鸟苷酸的产量。

第三节生产菌种的改良

上述诱变育种可以获得高产菌株,缺点是工作量大,且带有相当的盲目性,不能达到定向育种的目的。

随着现代生物技术的发展,原生质体融合,DNA重组可以达到改良菌种的目的。

一、原生质体融合(protoplast fusion)

原生质体:脱去细胞壁,只有细胞膜包裹的球状体。

1.标记菌株的筛选:要求两个亲株性能稳定,并带有遗传标记(营养缺

陷型和抗药性)

2.原生质体的制备:用适当的溶壁酶除去细胞壁,得到两种不同的原生

质体

3.原生质体的融合与再生:两个亲株的原生质体在高渗条件混合,在助融剂

(融合剂)作用下融合,这是原生质体融合的先决条件。然后是细胞壁再生,即恢复完整细胞并能生长分裂(必要条件)。

4.融合子的选择:

融合后产生两种情况:

真正的融合——产生杂合二倍体或单倍重组体

暂时的融合——形成异核体

所以要获得真正融合子,必须在融合子再生后,进行几代自然分离选择,才能确定。

该方法仍属于一种半理化性筛选,因为尽管采用的两亲株的特性是已知的,但它们基因组的交换和重组是非定向的。

二、DNA重组技术(DNA recombination technology)

又称基因工程,遗传工程。是以分子遗传学的理论为基础,综合分子生物学和微生物遗传学的最新技术而发展起来的一门技术。是按人的意志,将某一生物(供体)的遗传信息在体外经人工与载体相接(重组),构成重组DNA分子,然后转入另一生物体( 受体)细胞中,使被引入的外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。

1.目标DNA片断的获得

2.与载体DNA分子的连接

3.重组DNA分子引入宿主细胞

4.从中选出所需重组DNA分子的宿主细胞

作为发酵工业的工程菌在此四步之后还需加上外源基因的表达及稳定性的考虑。

第四节菌种的衰退、复壮与保藏

一、菌种的衰退

衰退的原因:

1.菌种保藏不当

2.菌种生长条件没有得到满足

二、菌种的复壮

1. 纯种分离

2. 通过寄主体进行复壮

3. 淘汰已衰退的个体

三、菌种保藏

1.原理人工创造条件使菌体的代谢活动处于休眠状态。

低温、干燥、缺氧、缺营养物质

2. 方法

(1)斜面保藏法:用螺旋口试管防失水,尽量减少碳源含量

(2)干燥保藏法:沙土管,固体曲

(3)悬液保藏法:将微生物悬浮在不含养分的溶液中(水、生理盐水、buffer) (4)冷冻干燥保藏法:冷冻,减压蒸发除去水分,使生命活动停止

(5)低温保藏法:大多数微生物可在-20℃以下的低温中保藏,比冷冻干燥更为常用。

(6)液氮保藏法

第五节种子的扩大培养

一、微生物的培养方法

1.表面培养:是一种好氧静置培养法。如固体斜面,固体平板,液体培养表面形成的膜状物。

2.固体培养:工业上常用大米,麸皮,米糠,谷壳等,再加一些其它营养成分灭菌后制成。特点: 疏松,培养基内部充满了空气。既可静置培养,又可通风培养,是介于表面培养和深层培养之间的一种培养方式。

3.液体深层培养:又叫液体通风培养。

菌体在液体培养基中处于悬浮状态,导入培养基中的空气通过气液界面传质进入液相,再扩散进入细胞内部。在专门的发酵罐中进行。

二、菌种的扩大培养P252

由于工业生产规模的增大,每次发酵所需的种子(纯种培养物)就增多,要使小小的微生物在几十小时内完成如此巨大的发酵转化任务,必须具备数量巨大的微生物细胞才行。

菌种扩大培养的目的:

为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。

(一)种子制备的工艺流程

摇瓶

保藏菌种→试管斜面活化→茄瓶面→种子罐固体培养(一级种子)(二级种子)→摇瓶→ 种子培养→ 发酵培养

(二)斜面菌种的培养P247

1.不宜多次移种。一般只移接三次,防自然变异。

2.活化斜面中加0.1%葡萄糖。

培养基特点:原料较精细。

(三)一级种子培养(摇瓶)

用三角瓶进行,液体恒温振荡,即摇瓶。

有些发酵产品(如谷氨酸),一级种子培养不用摇瓶,而是用大型斜面(茄瓶),优点是可一次制备一批大型斜面,置于冰箱中,比液体斜面培养物易于保存,不必每天制备液体一级种子。

培养基特点:使用的原料基本接近于发酵培养基。

(四)二级种子培养(种子罐)

种子罐大小根据发酵罐大小和接种量确定。培养基组成与发酵罐培养基基本一致,但所含的配比量可有差异。

培养基的特点:和一级种子相似,其中葡萄糖用水解糖代替,更接近于发酵培养基。

大量地接入培养成熟菌种的优点:

1.可以缩短生长过程的延缓期,因而缩短了发酵周期,提高了设备利用率。

2.节约了发酵培养的动力消耗。

3.并有利于减少染菌机会。

(五)种子罐级数:制备种子需逐级扩大培养的次数。

①对于生长快的细菌(如谷氨酸),种子罐→发酵罐——二级培养(一级种子罐扩大培养)

②对于生长较慢的菌种(如青霉素生产菌),利用:种子罐→种子罐→发酵罐——三级培养(二级种子罐扩大培养)

(六)接种龄与接种量P253

①种龄:种子培养时间称种龄。

生产中,一般选在生命力极为旺盛的对数生长期。

种龄过于年轻:前期生长缓慢,发酵周期延长

种龄过于年老:导致生产能力衰退

最适种龄通过实验确定。

②接种量

接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。

发酵罐的接种量大小与菌种特性,种子质量和发酵条件等有关。

一般细菌接种量在1%左右,霉菌接种量在10%左右(7%-15%)

接种量过大:菌种生长快,培养基过稠,溶氧不足。

接种量过小:发酵前期菌体生长缓慢,发酵周期延长。

近年来,谷氨酸生产中,以大接种量和丰富培养基作为高产措施。如:高生物素,大接种量,添加青霉素的工艺。

为了加大接种量,有些品种的生产利用双种法,即两个种子罐的种子接入一个发酵罐。

微生物菌种的选育方法

微生物菌种的选育方法 菌种选育Loremreferentibus(英语:Strain selection 日语:ひずみの选択法语:la sélection des souches 俄语:Штаммвыбор 德语:Stammselektion )微生物菌种是决定发酵产品的工业价值以及发酵工程成败的关键,只有具备良好的菌种基础,才能通过改进发酵工艺和设备以获得理想的发酵产品。菌种用途广泛涉及食品、医药、工农业、环保等诸多领域。 自然选育

自然选育的菌种来源于自然界、菌种保藏机构或生产过程,从自然界中选育菌种的过程较为复杂,而从生产过程或菌种保藏机构得到菌种的自然选育过程较为简单。 自然选育的步骤主要是:采样,增长培养,培养分离和筛选等。采样筛选的菌种采集的对象以土壤为主,也可以是植物、腐败物品和某些水域等。土壤是微生物的汇集地,从土壤中几乎可以分离到任何所需的微生物,故土壤往往是首选的采集目标。微生物的营养需求和代谢类型与生长环境有很大关系。富集培养由于采集样品中各种微生物数量有很大差异,若估计到要分离的菌种数量不多时,就要人为增加分离的概率,增加该菌种的数量,称为富集培养。纯种培养尽管通过增长培养的效果很好,但是得到的微生物还是处于混杂状态,因为样品中本身含有许多种类的微生物。所以,为了取得所需的微生物纯种,增殖培养后必须进行分离。平板分离法由接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料,在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线,微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少,并逐步分散开来。如果划线适宜的话,微生物能一一分散,经培养后,可在平板表面得到单菌落。分离方法有三种:即划线分离法、稀释法和组织分离法。稀释分离法在溶液中再加入溶剂使溶液的浓度变小。亦指加溶剂于溶液中以减小溶液浓度的过程。浓溶液的质量×浓溶液的质量分数=稀溶液的质量×稀溶液的质量分数生产能力考察初筛一般通过平板稀释法获得单个菌落,然后对各个菌落进行有关性状的初步测定,从中选出具有优良性状的菌落。例如,对抗生素产生

第二章 微生物菌种选育(笔记类)

第二章工业微生物基础 ●知识要点和教学要求 1)、了解微生物的特点 2)、了解常见的工业微生物 3)、掌握工业微生物菌种的分离和选育 4)、掌握工业微生物菌种的改良 5)、掌握工业微生物菌种的保藏 6)、掌握工业微生物菌种的扩大培养 ●能力培养要求 通过本章节的学习,学生能掌握工业微生物菌种的分离和选育、改良和保藏方法,以及菌种扩大培养的基本工艺。 ●教案内容 2.1微生物的特点 (1)种类多,分布广 目前已发现的微生物在10万种以上。不同种类的微生物具有不同的代谢方式,能分解各式各样的有机物质和无机物质,当前国内外积极利用微生物来防治公害,分解三废中许多毒性强、结构复杂的物质。另一方面,不同微生物在生化过程中积累不同的代谢产物,所以发酵工业上常利用各种微生物来生产各种产品,如酒类、酒精、丙酮丁醇、抗生素、酶制剂、有机酸、氨基酸、核酸、维生素、菌体蛋白、医药产品和化工产品等到。 (2)高面积-体积比,代谢能力强 (3)生长迅速,繁殖快 (4)适应性强,容易培养 (5)易变性

2.2常见的工业微生物 广义的微生物包括病毒、立克次氏体、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、单细胞藻类、原生动物和支原体等。在发酵工业中经常遇到的是细菌、放线菌、酵母菌、霉菌及危害、放线菌生长的噬菌体。 微生物工业的范围 微生物工业越来越深地同国民经济各部门发生关系,涉及的范围十分广泛,而且越来越大,大致可分为下列14类: (1)酿酒工业(啤酒、葡萄酒、白酒等) (2)食品工业(酱、酱油、食醋、腐乳、面包、酸乳等) (3)有机溶剂发酵工业(酒精、丙酮、丁醇等) (4)抗生素发酵工业(青霉素、链霉素、土霉素等) (5)酶制剂发酵工业(柠檬酸、葡萄糖酸等) (6)酶制剂发酵工业(淀粉酶、蛋白酶等) (7)氨基酸发酵工业(谷氨酸、赖氨酸等) (8)核苷酸类物质发酵工业肌苷酸、肌苷等) (9)维生素发酵工业(维生素B2、维生素B12等) (10)生理活性物质发酵工业(激素、赤霉素等) (11)微生物菌体蛋白发酵工业(酵母、单细胞蛋白等) (12)微生物环境净化工业(利用微生物处理废水、污水等) (13)生物能工业(沼气、纤维素等天然原料发酵生产酒精、乙烯等能源物质) (14)微生物冶金工业(利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等)

菌种的选育

第一章菌种选育 第一节工业常用微生物及要求 一、常见微生物 (一)细菌(bacteria) 发酵工业中常用的细菌主要是杆菌,主要有: 醋杆菌属(Acetobacter) 乳杆菌属(Lactobacillus) 杆菌属(Bacillus):α-淀粉酶,蛋白酶,肌苷、鸟苷等核苷。其中最为重要的是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 短杆菌属(Brevibacterium):谷氨酸 棒杆菌属(Corynebacterium):谷氨酸 (二)放线菌(actinomyces) 属原核微生物(有菌丝体,无横隔,不具完整的核。)最大的经济价值在于产生多种抗生素(antibiotic)。 链霉菌(Streptomyces):红,金,土,氯,链霉素 小单孢菌属(Micromonospora):庆大霉素 (三)霉菌(mould) 亦称丝状真菌(不是分类学上的名词,凡在营养基质上形成绒毛状,网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。) 1.曲霉属(Aspergillus) 黑曲霉(A. niger)产蛋白酶,淀粉酶,果酸酶,变异菌株产柠檬酸 米曲霉(A. oryzae)产淀粉酶,蛋白酶,酿酒的糖化曲和酱油曲 黄曲霉(A. flavus)产黄曲霉毒素 米曲霉和黄曲霉均为半知菌。 2.青霉属(Penicillum):例如桔子上的绿色斑点 桔青霉(P. citrinum):产生5’-磷酸二酯酶,降解核糖核酸为四个单核苷酸。 3.根霉属(Rhizopus)接合菌

米根霉(R. oryzae) 华根霉(R. chinensis) 酒药和酒曲中含有米根霉或华根霉。 4.红曲霉属(Monascus) 淀粉酶,麦芽糖酶,蛋白酶,柠檬酸等。可生产食用红色素。 (四)酵母(yeast) 单细胞真核微生物,低等真菌。 ①酵母属(Saccharomyces) 啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) ②假丝酵母属(Candida) 产朊假丝酵母(Candida utilis)生产饲料酵母,其蛋白质和维生素含量都比啤酒酵母高。可利用糖蜜,土豆淀粉废液生产人畜可食用蛋白质。 ③毕赤酵母属(Pichia) 产膜酵母,在液面形成白膜,是酿造物和酒类饮料的污染菌。 (五)其它微生物 1.担子菌(basidiomycetes) 即菇类(mushroom)担子菌资源的利用已经引起人们的重视。可用于多糖及抗癌药物开发。 2. 藻类(alga)是分布极广的一类自养微生物资源,许多国家把它用作人类保健 食品和饲料。从蛋白质产率看,螺旋藻是大豆的 28倍,每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20~35倍。 (六)噬菌体(phage)凡用细菌和放线菌为生长菌株的发酵工业,均存在噬菌体的危害问题。噬菌体在自然界分布极为广泛。其三大特点是: ①体积比细菌小的多,可以通过细菌滤器。 ②没有细胞结构,由核酸的蛋白质构成。 ③营专性活物寄生,即只能在特异性寄主细胞中增殖。 烈性噬菌体——引起寄主细胞迅速裂解。受感染的细菌称敏感性细菌。 温和噬菌体——随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。

第二章 生产菌种的选育

第二章生产菌种的选育 工业化菌种的要求 ?能够利用廉价的原料,简单的培养基,大量高效地合成产物 ?有关合成产物的途径尽可能地简单,或者说菌种改造的可操作性要强 ?遗传性能要相对稳定 ?不易感染它种微生物或噬菌体 ?产生菌及其产物的毒性必须考虑(在分类学上最好与致病菌无关) ?生产特性要符合工艺要求 生产菌种的育种方法 第一节工业微生物的分离筛选 (Separation and screening) 一、菌种的来源 ?根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买;?从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 二、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 从自然界中分离筛选菌种的目的是高效地获取一株高产目的产物的微生物。 具体步骤如下: 1.采样:有针对性地采集样; 2.富集培养:让目的微生物在种群中占优势,使筛选变得可能; 3.纯种分离:纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落; 4.菌落的选择:利用筛选模型,选择具有目的产物合成能力相对高的菌株;

5.生产性能测定:测定代谢产物或其它目的性状。 采样 1、采样对象 以采集土壤为主。 根据微生物营养类型。 根据微生物的生理特性。 极端环境条件下。 ?2、采样季节:以温度适中,雨量不多的秋初为好。 ?3、采土方式: 在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,盛 入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件 等,以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化,宜将样品逐步分 批寄回,以便及时分离。 富集方法(enrichement) 物理方法:加热、膜过滤等 等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段,培养(固体、液体;分批连 续)后使目的微生物在种群中占优势。 纯种分离 1.稀释分离法 2.平板划线分离法 ⑴涂菌: ⑵划线分离: 菌株分离(seperation)就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开,并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进 行分离、筛选,进而得到所需的微生物的过程。

微生物菌种选育方式(一)

微生物菌种选育方式(一) 关键词:地衣芽孢杆菌诺卡氏菌 ATCC 北京标准物质网 微生物菌种选育技术在现代生物技术中具有十分重要的地位,经历了自然选育、诱变育种、杂交育种、代谢控制育种和基因工程育种五个阶段,各个阶段并不孤立存在,而是相互交叉,相互联系的。新的育种技术的发展和应用促进了生产的发展。 1.自然选育 随着微生物学的发展,特别是在发明微生物的纯培养技术之后,出现了微生物纯种的自然选育。以基因自发突变为基础选育优良性状菌株的这种方法,是最早应用微生物遗传学原理.进行育种实践的一个实例。由于微生物体内存在光复活、切补修复、重组修复、紧急呼救修复等修复机制以及DNA聚合酶的校正作用,使得自发突变几率极低,一般为10-6~10-10这样低的突变率导致自然选育耗时长、工作量大,影响了育种工作效率。在这种情况下,就出现了诱变育种技术。 2.诱变育种 1927年,Miller发现X射线能诱发果蝇基因突变。之后,人们发现其他一些因素也能诱发基因突变,并逐渐弄清了一些诱变发生的机理,为工业微生物诱变育种提供了前提条件。1941年,Beadle 和 Tatum 采用X射线和紫外线诱变红色面包霉,得到了各种代谢障碍的突变株。在这之后,诱变育种得到了极大发展。 诱变育种是以诱变剂诱发微生物基因突变,通过筛选突变体,寻找正向突变菌株的一种诱变方法。诱变剂包括物理诱变剂、化学诱变剂和生物诱变剂。其中,物理诱变剂包括紫外线、X射线、射线、快中子等;化学诱变剂包括烷化剂(如甲基磺酸乙酯、硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝基乙基脲、乙烯亚胺及氮芥等)、天然碱基类似物、脱氨剂(如亚硝酸)、移码诱变剂、羟化剂和金属盐类(如氯化锂及硫酸锰等);生物诱变剂包括噬菌体等。物理诱变剂因其价格经济,操作方便,所以应用最为广泛;化学诱变剂多是致癌剂,对人体及环境均有危害,使用时须谨慎;生物诱变剂应用面窄,其应用也受到限制。 现今,诱变育种已取得了显著的成果,如青霉素生产菌的青霉素产量在40年内增加了近万倍,达到lO万u/ml左右;谷氨酸产生菌经紫外诱变处理,产酸率提高了3l%;用亚硝酸钠、紫外线等物化方法诱变产碱性蛋白酶的地衣芽

食用菌菌种选育的一般方法

食用菌菌种选育的一般方法 导言 3-1自然选育 定义: 自然突变的结果: 自然选育的特点:简单易行,可以纯化菌种,防止菌种退化,稳定产量。但自然选育的效率低,应该经常跟诱变选育交替使用,提高育种效率。 自然选育的一般程序: 3-2诱变选育 导言 3-2-1诱变育种的原理 诱变育种的理论基础是基因突变,突变包括染色体畸变和基因突变两大类。 染色体畸变指的是,染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等。 基因突变指的是,DNA中的碱基发生变化,即点突变。 过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。 常用的诱变剂包括物理、化学、生物的三大类。表3-1所示。 3-2-2诱变育种的基本方式 导言 3-2-2-1出发菌株的选择 进行诱变的出发菌株的性能,对提高诱变效果和效率十分重要。 选择出发诱变菌株的注意事项: 诱变育种的程序: 3-2-2-2诱变剂的使用方法 |------单一诱变剂处理:对野生菌株处理有效。 诱变方法| |------复合诱变剂处理:对经过多次诱变处理的老菌株。 复合诱变剂处理|----同一诱变剂多次处理 |----两种以上诱变剂先后分别处理 |----两种以上诱变剂同时或多次处理 举例:青霉菌的选育。 3-2-2-3诱变剂的剂量选择 诱变剂的剂量与致死率有关,而致死率又与诱变率有关。 因此,可用致死率作为诱变剂剂量的选择依据。 关系:诱变率随诱变剂剂量的增加而提高,但达到一定程度后,反而下降。 近年来处理剂量控制在致死率70-80%。 高剂量诱变的好处:A形成较纯的菌株。(引起一些细胞核变异,同时引起另外一些细胞核被破坏,细胞死亡。) B促使变异菌株稳定,不易产生回复突变。(高剂量会引起细胞遗传物质发生难以恢复的巨大损伤。) 3-2-3突变菌株的筛选 3-2-3-1营养缺陷型突变菌株的筛选 营养缺陷型突变菌株的诱变育种具有重要的理论研究和工业应用价值。

菌种选育与培养

第三章菌种选育与培养 教学目的:1、熟悉工业发酵常用微生物种类;2、掌握菌种分离、筛选和选育的方法;3、掌握种子扩大培养方法和质量控制方法;4、掌握常规的菌种保藏方法。 教学方法:讲授 教学手段:使用多媒体课件 教学内容: 第一节重要工业微生物的分离及菌种要求 1、微生物资源非常丰富,广泛分布于土壤、水和空气中,尤以土壤中最多。 2、有的微生物从自然界中分离出来就能被利用,有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变,得到突变株才能被利用。 3、当前发酵工业所用的菌种总趋势是从野生菌转向变异菌,自然选育转向代谢育种,从诱发基因突变转向基因重组的定向育种。 4、由于生物工业本身的发展以及遗传工程的介入,藻类、病毒等也正在逐步变为工业生产用的微生物。 一、工业生产常用的微生物 1、细菌(bacteria):枯草芽胞杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等,用于生产淀粉酶、乳酸、醋酸、氨基酸和肌苷酸等; 2、酵母菌(yeast):啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等,用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等; 3、霉菌(mould):根霉、毛霉、犁头霉、红曲霉、曲霉、青霉等,用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等; 4、放线菌(actinomycetes):链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等,常用菌种来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等; 5、担子菌(basidiomycetes):通常所说菇类(mushroom)微生物,用于多糖、橡胶物质和抗癌药物的开发; 6、藻类(algae):用作人类保健食品和饲料,如螺旋藻、栅列藻;可通过藻类将CO2转变为石油,或获取氢能。 二、微生物工业对菌种的要求 目前,随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现,势必要求开拓更多新品种。尽管微生物工业用的菌种多种多样,但作为大规模生产,对菌种有下列要求: 1、原料廉价、生产迅速、目的产物产量高; 2、易于控制培养条件,酶活性高,发酵周期较短; 3、抗杂菌和噬菌体的能力强; 4、菌种遗传性能稳定,不易变异和退化,不产生任何有害的生物活性物质和毒素,保证安全生产。 三、重要工业微生物的分离 分离是指从含微生物的样品(如土壤、水等)中获得纯的或混合的培养物,是筛选具有潜在工业应用价值的微生物的第一个阶段,接着才能从以上分离物中筛选出那些能产生所需产物或具有某种生化反应的菌种。

第二章 菌种选育

第二章菌种选育 带图象分析系统的微生物菌种 显微观察装置 一、菌种的来源 ?根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买; ?从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 1、分离思路 ?新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性,采用各种筛选方法,快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 ?实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌,也必须重新进行分离纯化。 ?有了优良的菌种,还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。 2、新种分离与筛选的步骤 3、具体方法 ?1)采样 ?2)样品的预处理 ?3)纯种分离 ?4)生产性能的测定 1)采样 (1)采样对象 以采集土壤为主。一般田园土和耕作过的沼泽土中,以细菌和放线菌为主,富含碳水化合物的土壤和沼泽地中,酵母和霉菌较多,如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物,腐败物品,某些水域等。 从自然界筛选 ?(2)采样季节:以温度适中,雨量不多的秋初为好。 ?(3)采土方式:在选好适当地点后,用小铲子除去表土,取离地面5-15cm处的土约10g,

盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采样时间、地点、环境条件等,以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化,宜将样品逐步分批寄回,以便及时分离。 2)样品的预处理 ?在分离之前,含微生物材料的标本首先进行预处理,可大大提高菌种分离的效率。 3)纯种分离 ?在自然界获得的标本,是很多种类微生物的混杂物,一般采用平板划线或平板稀释法进行纯种分离。 ?由于土壤或其它样品中所含的各种微生物数量有很大差别,若估计到要分离的菌种的数量不多时,就得设法增加分离的机率,可通过富集培养增加该菌种的数量。 ?利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同,如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等,人为控制这些条件,使之利于某类或某种微生物生长,而不利于其他种类微生物的生存,以达到使目的菌种占优势,而得以快速分离纯化的目的,这种方法又被称为施加选择性压力分离法。 平板划线分离 稀释分离 分离的培养条件--控制营养成分 ?各种微生物对营养物质的要求是有差异的。控制分离培养基的营养成分对提高分离效果是有好处的。 ?用淀粉作为唯一碳源,则具有淀粉酶类的微生物就能很好生长。在一般情况下,也可以按照各大类微生物常用的培养基进行分离,例如分离细菌常用蛋白胨牛肉膏琼脂培养基,分离放线菌常用淀粉琼脂培养基,分离酵母、霉菌常用麦芽汁或米曲汁培养基等。 分离的培养条件--培养基酸碱度 ?微生物生长繁殖的适宜酸碱度是不同的。细菌和放线菌一般要求中性或偏碱性的培养基(pH7.0或稍高),酵母和霉菌一般要求偏酸性(pH4.0~6.0)。所以,结合一定的营养,将培养基调至一定的pH值,更有利于排除不需要的微生物类型。

工业微生物菌种的选育——诱变选育(1)

工业微生物菌种的选育——诱变选育(1) 工业微生物菌种的选育——诱变选育(1) 诱变选育 诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞,提高基因突变频率,再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。诱变育种具有速度快、方法简便等优点,是当前菌种选育的一种主要方法,使用普遍。诱变育种的理论基础是基因突变,所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。 诱变育种的步骤与方法 (一)、工业育种的一般步骤(图) (二)、诱变育种方案设计 诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。 1、出发菌株的选择 工业上用来进行诱变处理的菌株,称为出发菌株。出发菌株

选择目前主要依据实际经验,总结如下:①以单倍体纯种为出发菌株;②采用具有优良性状的菌株;③选择对诱变剂敏感的菌株;④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程,才变得明显,所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株,进行多步育种,确保高产菌株的获得。 2、出发菌株的纯化 为什么要对出发菌株进行纯化呢?这是因为微生物容易发生变异和染菌,同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。生产菌在不断移代过程中,菌丝间接触、吻合后,易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。这些都会造成细胞内遗传物质的异质化,使遗传性状不稳定。通过纯种分离,从中挑选所需的优良菌株。常用划线分离和稀释分离法,并结合显微镜操纵器分离单孢子。 3、单孢子悬液的制备 诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞,并且是均匀状态的单细胞悬液。 首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响,如细菌在对数期诱变处理效果较好;霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态,所以培养时间的长短对孢子影响不大,但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。

2020年(生物科技行业)第二章微生物菌种选育(笔记类)

(生物科技行业)第二章微生物菌种选育(笔记类)

第二章工业微生物基础 ●知识要点和教学要求 1)、了解微生物的特点 2)、了解常见的工业微生物 3)、掌握工业微生物菌种的分离和选育 4)、掌握工业微生物菌种的改良 5)、掌握工业微生物菌种的保藏 6)、掌握工业微生物菌种的扩大培养 ●能力培养要求 通过本章节的学习,学生能掌握工业微生物菌种的分离和选育、改良和保藏方法,以及菌种扩大培养的基本工艺。 ●教案内容 2.1微生物的特点 (1)种类多,分布广 目前已发现的微生物在10万种之上。不同种类的微生物具有不同的代谢方式,能分解各式各样的有机物质和无机物质,当前国内外积极利用微生物来防治公害,分解三废中许多毒性强、结构复杂的物质。另壹方面,不同微生物在生化过程中积累不同的代谢产物,所以发酵工业上常利用各种微生物来生产各种产品,如酒类、酒精、丙酮丁醇、抗生素、酶制剂、有机酸、氨基酸、核酸、维生素、菌体蛋白、医药产品和化工产品等到。 (2)高面积-体积比,代谢能力强 (3)生长迅速,繁殖快

(4)适应性强,容易培养 (5)易变性 2.2常见的工业微生物 广义的微生物包括病毒、立克次氏体、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、单细胞藻类、原生动物和支原体等。在发酵工业中经常遇到的是细菌、放线菌、酵母菌、霉菌及危害、放线菌生长的噬菌体。 微生物工业的范围 微生物工业越来越深地同国民经济各部门发生关系,涉及的范围十分广泛,而且越来越大,大致可分为下列14类: (1)酿酒工业(啤酒、葡萄酒、白酒等) (2)食品工业(酱、酱油、食醋、腐乳、面包、酸乳等) (3)有机溶剂发酵工业(酒精、丙酮、丁醇等) (4)抗生素发酵工业(青霉素、链霉素、土霉素等) (5)酶制剂发酵工业(柠檬酸、葡萄糖酸等) (6)酶制剂发酵工业(淀粉酶、蛋白酶等) (7)氨基酸发酵工业(谷氨酸、赖氨酸等) (8)核苷酸类物质发酵工业肌苷酸、肌苷等) (9)维生素发酵工业(维生素B2、维生素B12等) (10)生理活性物质发酵工业(激素、赤霉素等) (11)微生物菌体蛋白发酵工业(酵母、单细胞蛋白等) (12)微生物环境净化工业(利用微生物处理废水、污水等)(13)生物能工业(沼气、纤维素等天然原料发酵生产酒精、乙

工业微生物菌种开发的一般过程

1、工业微生物菌种开发的一般过程 自然界含菌样品极其丰富,土壤、水、空气、枯枝烂叶、植物病株、烂水果等都含有众多微生物,种类数量十分可观。土壤样品的含菌量最多。菌株的分离和筛选一般可分为采样、富集、分离、产物鉴别几个步骤。 (1)采样 注意事项 1、采样时应尽可能保持相对无菌; 2、所采集的样本必须具有某种代表性; 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等; 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素,因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的; (2)富集培养 目的微生物含量较少时,根据微生物的生理特点,设计一种选择性培养基,创造有利的生长条件,使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖,数量增加,由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种,以利分离到所需要的菌株。富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制。 例如控制培养基的营养成分的富集培养,如要分离水解酶产生菌,可在富集培养基中以相应底物为惟一碳源,加入含菌样品,给目的微生物以最佳的培养条件(pH、温度、营养、通气等)进行培养。能分解利用该底物的菌类得以繁殖,而其他微生物则因得不到碳源无法生长,菌数逐渐减少。 (3)分离筛选 经富集培养以后的样品,目的微生物得到增殖,占了优势,其他种类的微生物在数量上相对减少,但并未死亡。富集后的培养液中仍然有多种微生物混杂在一起,即使占了优势的一类微生物中,也并非纯种。因此,经过富集培养后的样品,也需要进一步通过分离纯化,把最需要的菌株直接从样品中分离出来。 例如划线分离法,用接种环取部分样品或菌体,在事先已准备好的培养基平板上划线,当单个菌落长出后,将菌落移入斜面培养基上,培养后备用。该分离方法操作简便、快捷,效果较好。 (4)产物鉴别 经典微生物分类鉴别 现代的分子生物学分类鉴别 2、分子生物学分类方法(微生物分类鉴定的经典和现代方法)

菌种诱变方法

介绍了几种常用的物理诱变和化学诱变育种方法的原理、特点以及成功案例等,为微生物诱变育种提供了一个总体的方法框架。 诱变; 微生物育种 微生物与酿造工业、食品工业、生物制品工业等的关系非常密切,其菌株的优良与否直接关系到多种工业产品的好坏,甚至影响人们的日常生活质量,所以选育优质、高产的微生物菌株十分重要。微生物育种的目的就是要把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导,或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状,人为地使某些代谢产物过量积累,获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。作为育种途径之一的诱变育种一直被广泛应用。目前,国内微生物育种界主要采用的仍是常规的物理及化学因子等诱变方法。 1 1.1 紫外线照射是常用的物理诱变方法之一,是诱发微生物突变的一种非常有用的工具。DNA和RNA的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰260nm,因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。紫外辐射的作用已有多种解释,但比较确定的作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体[1]。二聚体的形成会阻碍碱基间正常配对,所以可能导致突变甚至死亡[2]。 马晓燕[3]等以紫外诱变原生质选育法筛选发酵乳清高产酒精菌株马克斯克鲁维酵母菌株ZR-20,比优化前的酒精产率提高10.5%,较出发菌株提高了68%。顾蕾[4]等通过紫外诱变红酵母ns-1原生质体,获得类胡萝卜素产量明显提高的突变株,其生物量、色素产量分别为6.15g/L、6.41mg/L,分别比原始菌株提高了67.6%、54.1%。 紫外照射诱变操作简单,经济实惠,一般实验室条件都可以达到,且出现正突变的几率较高,酵母菌株的诱变大多采用这种方法。 1.2 γ-射线是电离生物学上应用最广泛的电离射线之一,具有很高的能量,能产生电离作用,可直接或间接地改变DNA结构。其直接效应是可以氧化脱氧核糖的碱基,或者脱氧核糖的化学键和糖-磷酸相连接的化学键。其间接效应是能使

第三章、优良菌种的选育

第三章、优良菌种的选育 导言 优良生产菌种应具备的基本特性: (1)生产菌种应具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力。 (2)在发酵过程中不产生或少产生与目标产品相近似的副产物及其它产物。 (3)生长繁殖能力强,有较快的生长速率,产生孢子的菌种应该具有较强的产生孢子能力。 (4)能高效地将原料转化为产品。 (5)具有利用广泛来源原料的能力,并对发酵原料成分的波动敏感性较小。 (6)对需要添加的前体物质有耐受能力,并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。(前体:)(7)在发酵过程中产生的泡沫要少。 (8)具有抗噬菌体感染的能力。 (9)遗传特性稳定。 3-1自然选育 定义: 自然突变的结果: 自然选育的特点:简单易行,可以纯化菌种,防止菌种退化,稳定产量。但自然选育的效率低,应该经常跟诱变选育交替使用,提高育种效率。 自然选育的一般程序: 3-2诱变选育 导言 3-2-1诱变育种的原理 诱变育种的理论基础是基因突变,突变包括染色体畸变和基因突变两大类。 染色体畸变指的是,染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等。 基因突变指的是,DNA中的碱基发生变化,即点突变。 过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。 常用的诱变剂包括物理、化学、生物的三大类。表3-1所示。 3-2-2诱变育种的基本方式 导言 3-2-2-1出发菌株的选择 进行诱变的出发菌株的性能,对提高诱变效果和效率十分重要。 选择出发诱变菌株的注意事项: 诱变育种的程序: 3-2-2-2诱变剂的使用方法 |------单一诱变剂处理:对野生菌株处理有效。 诱变方法| |------复合诱变剂处理:对经过多次诱变处理的老菌株。 复合诱变剂处理|----同一诱变剂多次处理 |----两种以上诱变剂先后分别处理 |----两种以上诱变剂同时或多次处理 举例:青霉菌的选育。 3-2-2-3诱变剂的剂量选择

优良菌种选育

第三章工业微生物优良菌种选育从自然界分离所得的野生菌种,不论在产量上或质量上均不适应微生物工程的要求,因此从自然界存在的产生某种代谢产物的菌种,经筛选分离和优良菌选育,已成为微生物工程菌种管理上的必要程序。故优良菌种的选育是为生产提供各种类型的突变株,大幅度提高菌种产生利用价值代谢产物特别是基因工程,细胞工程和蛋白质工程等较为定向技术的发展,促进菌种选育技术不断更新,进而研制出众多有价值的微生物工程产品。 微生物工程优良菌种的选育方法包含自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种的选育、杂交选育、原生质体融合技术、基因工程技术等等。 微生物工程评价生产菌种优劣的标准和菌种选育工作的研究目标是实现工业化生产。也就是说,选育的菌种特性能否满足工业化生产的实际需要,是否具有工业化生产价值和实际利用价值。因此,一株优良的生产菌种应该具备如下的特性: ①菌种的生长繁殖能力强,具较强的生长速率,产生孢子的菌种应具有较强的产孢子能力。这样有利于缩短发酵培养周期,减少种子罐的级数,最终得以减少设备投资和运转费用。同时,还可以减少菌种在扩大生产过程中可能发生的生产下降,或杂菌污染的可能性。 ②菌种的培养基和发酵原料来源广泛、价格便宜、尤其对发酵原料成分的波动敏感性较小。 ③对需要添加的前体物质具有耐受能力,且不能将这些前体物质作为一般碳源利用。 ④菌种应具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力,高产菌株的应用,可以在不增加投资的情况下,大幅度提高企业的生产能力。 ⑤能高效地将原料转化为产品,这样可以降低生产成本,提高产品的市场竟争力。 ⑥在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产物及其它产物,这样不但可以提高营养物质的有效转化率,还会减少分离纯化的难度,降低成本,提高产品质量。 ⑦在发酵过程中产生的泡沫要少,这对提高装料系数,提高单罐产量,降低成本具有重要意义。 ⑧具有抗噬菌体感染的能力。 ⑨菌株遗传特性稳定,以保证发酵能长期、稳定地进行,有利于实施最佳的工艺控制。 ⑩菌种纯粹,不易变异退化,不产生任何有害的生物活性物质和毒素,以保证安全。 这些都是对优良菌株特性的基本要求,也是菌种选育工作研究和需要解决的问题。 微生物菌种改良是微生物资源利用的关键步骤。为生产目的产物,一般对所筛选出来的菌种都要进行菌种改良以提高其产率和改善其工艺性能。推动工业菌株改良的主要动力是经济原因,发酵工程力求采用最经济、最有效的方式来取得最大的效益。 微生物工程菌种选育、改良的目的: ⑴提高产量 对微生物菌种进行选育改良,以过量生产(overproduction)或超量生产(super - production , hyper-production)目的产物。产量效益是一切商业发酵过程所追求的首要目标,经济是菌种选育的主要推动力,是菌种选育不变的目的。 表征菌种经济性能的重要指标包括: ①浓度(concentration) ,指发酵终了产物的浓度,单位是g/L ,得率越高,产品越浓,带来的好处是下游处理也相对容易; ②转化率(yield) ,指每单位质量的底物转化为目的产物的质量数值,单位是g/g ,或者以百分率(%)表示,这一数值越高,表示菌种对原料的利用越有效,底物效率(Substrate efficiency)就越高; ③生产强度(发酵强度、生产率、生产能力,productivity) ,单位是g/(L·h) , 表示每升发酵液中每小时所得产物的质量(g)。生产强度越大,达到相同产量所花费的发酵时间就越短。

菌种选育

作业课题:菌种选育有哪些技术? 菌种选育 菌种选育是一门应用科学技术,其理论基础是微生物遗传学、生物化学等,而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良菌种,从而促进生产发展。 所以,育种工作者要充分掌握微生物学、生物化学、遗传学的基本原理和国内外有关的先进科学技术,灵活而巧妙地将其运用到育种中去,使菌种选育技术不断更新和发展。 目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方法,带有一定的盲目性,尚属于经典育种的范畴。随着微生物学、生化遗传学的发展,出现了转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法。 經過本人搜尋網絡資源,得出下面4方面的育種方法: (1)自然选育 在生产过程中,不经过人工处理,利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。 所谓自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。一般认为引起自然突变有两个原因:即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。所谓多因素低剂量的诱变效应,是指自然突变实质上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应。所谓互变异构效应是指四种碱基的第六位上的酮基和氨基,胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)可以酮式或烯醇式出现,胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)可以氨基式或亚氨基式出现。平衡一般倾向于酮式和氨基式。碱基对发生自然突变的机率约为10-8一10-9。 自然选育是一种简单易行的选育方法,它可以达到纯化菌种,防止菌种衰退、稳定生产、提高产量的目的。但是自然选育的最大缺点是效率低、进展慢。因此,经常把自然选育和诱变育种交替使用,这样可以收到良好的效果。 自然选育(自然分离)的一般程序,是把菌种制备成单孢子悬浮液,经过适当的稀释以后,在固体平板上进行分离,挑取部分单菌落进行生产能力的测定,经反复筛选,以确定生产能力更高的菌株代替原来的菌株。 (2)诱变育种的基本原理 诱变育种的理论基础是基因突变,所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。突变主要包括染色体畸变和基因突变二大类。 染色体畸变是指染色体或DNA片断的缺失、易位、逆位、重复等。基因突变是指DNA分子结构中的某一部位发生变化(又称点突变)。根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变。 自然突变是指在自然条件下出现的基因突变。 诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。诱变因素的种类很多,有物理的、化学的和生物的三大类,见表6-1。经诱变处理后,微生物的遗传物质、DNA和RNA 的化学结构发生改变,从而引起微生物的遗传变异。 诱发突变敏感菌株先经诱变因素处理,然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上,经诱变后的存活孢子中,如存在抗性变异菌株就能在此平板上生长。这种菌落生长的速度一般与正常菌落的生长速度相近,诱变可以提高抗性菌株的频率。 除上述方法外,还可将敏感菌孢子经诱变后接入种子培养基,待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继续培养几天,再加入噬菌体反复感染,使敏感菌被噬菌体所裂解,最后取再生菌丝进行平板分离,从中筛选抗性菌株。 (3)杂交育种 发酵工业的优良菌种的选育主要采用诱变育种方法。但是,一个菌种长期使用诱变剂处

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