中药复方三妙丸中化学成分的HPLC_TOF_MS分析_李祥

★成分分析★

中药复方三妙丸中化学成分的HPLC －TOF /MS 分析

*

李祥1，2，吕磊3，窦幼萌4，洪战英1，柴逸峰1＊

＊

（1．第二军医大学药学院，上海200433；2．中国人民解放军62380部队，北京100071；

3．第二军医大学东方肝胆外科医院药材科，上海200438；4．中国人民解放军总医院南楼心血管一科，北京100853）摘要

目的：采用高效液相色谱－飞行时间质谱（HPLC －TOF /MS ）联用技术分析中药复方三妙丸中的主要化学成分。方法：

色谱分离采用SHISEIDO CAPCELL PAK C 18色谱柱（3.0mm ?100mm ，3μm ），流动相为乙腈（A ）－0.1%甲酸水溶液（B ），梯

度洗脱，流速0.6mL ·min －1

，柱温25?。质谱定性鉴别采用TOF /MS 正离子模式扫描，电压4kV ，雾化气压力275.85kPa ，干燥气流速10L ·min －1，干燥气温度350?。结果：在优化的液质联用条件下，通过飞行时间质谱以及碎片离子裂解分析，鉴

定了三妙丸中23个化学成分，包括3组同分异构体。结论：所建立的HPLC －TOF /MS 联用法，可为鉴定三妙丸中的化学成分提供一种快速、

高效的方法。关键词：复方；三妙丸；高效液相色谱；电喷雾离子源－飞行时间质谱；化学成分；同分异构体；鉴别中图分类号：R917

文献标识码：A

文章编号：0254－1793（2013）05－0788－06

Identification of chemical components in Sanmiao pills by HPLC －TOF /MS *

LI Xiang 1，2，L Lei 3，DOU You －meng 4，HONG Zhan －ying 1，CHAI Yi －feng 1＊

＊

（1．School of Pharmacy ，Second Military Medical University ，Shanghai 200433，China ；2．No.62380PLA Troop ，Beijing 100071，China ；3．Department of Pharmacy ，Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital ，Second Military Medical University ，Shanghai 200438，China ；

4．Department of Cardiovasology ，The South Tower ，The General Hospital of the PLA ，Beijing100853，China ）

Abstract Objective ：To identify the main chemical components in compound Sanmiao pills by high performance

liquid chromatography –time －of －flight mass spectrometry （HPLC －TOF /MS ）．Methods ：A SHISEIDO CAP-CELL PAK C 18column （3.0mm ?100mm ，3μm ）was used for separation and identification of chemical compo-nents in Sanmiao pills with a mobile phase of acetonitrile （A ）and 0.1%formic acid in water solution （B ）with gradient elution．The flow rate was set at 0.6mL ·min －1and the column temperature was set at 25?．Time －of －flight mass spectrometer （TOF /MS ）was applied for qualitative analysis under positive ion mode．The capillary volt-age was set to 4kV ，

the nebulizer gas pressure was 275.85kPa ，the drying gas flow rate was set to 10L ·min －1at a temperature of 350?．Results ：Under optimized LC /MS conditions ，23chemical constituents of Sanmiao pills in-cluding 3pairs of isomers were identified through analyses of time －of －flight mass spectrometer and fragment ion splitting．Conclusion ：A rapid and efficient HPLC －TOF /MS approach has been established for studying the chem-ical constituents in Sanmiao pills．

Key words ：compound preparation ；Sanmiao pills ；HPLC ；ESI －TOF /MS ；chemical constituent ；isomers ；identifica-tion

*

国家自然科学基金资助（No．81072614）

＊＊通讯作者

Tel ：（021）81871201；E －mail ：yfchai@smmu．edu．cn

三妙丸收载于中国药典（2010年版）一部，由苍

术、黄柏、牛膝3味中药组成，具有清热燥湿之功效，

主治湿热下注所致的痹病，症见足膝红肿热痛、下肢

沉重、小便黄少等病症［1］

，并可用于治疗痛风和高

尿酸血症［2］。三妙丸中3味中药所含化学成分不同，其中黄柏主要成分为4价的异喹啉生物碱类化合物，包括小檗碱、药根碱、巴马汀等［3－4］；苍术主要成分为β－桉叶醇、苍术酮、苍术素及榄香醇等［7－8］；牛膝中的化学成分包括植物蜕皮激素、三萜皂苷等［9－10］。近年来，对三妙丸中单味药材的化学成分鉴别和含量测定方面有了一定程度的研究［3－10］，但是对三妙丸中多组分的同时鉴别研究尚未见报道。因此，本文采用HPLC－TOF/MS方法，对三妙丸的化学成分进行分离鉴别和结构解析，为进一步研究该制剂的体内动态过程与作用机制等提供可借鉴的分析方法。

1仪器和试药

1.1仪器安捷伦1100系列液相色谱仪（Agilent Technologies Inc．，USA），包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、二极管阵列检测器；安捷伦6210高分辨飞行时间质谱仪，配有标准电喷雾离子源（ESI），MassHunter色谱工作站和Qualitative Analysis质谱分析软件。

1.2试剂和药材黄柏、苍术、牛膝均购自上海雷允上药业有限公司，经第二军医大学药学院生药教研室孙莲娜副教授鉴定。HPLC级甲醇（Honeywell，USA）和乙腈（Darmstadt，Germany），HPLC级甲酸（Buchs，Switzerland），水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。

2方法

2.1色谱和质谱条件

2.1.1色谱条件色谱柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C

18

柱（3.0mm?100mm，3μm）；流动相：乙腈（A）－0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0 25min，10%A→25%A；25 30min，25%A→40%A；30 45 min，40%A→70%A；45 50min，70%A→90%A）；流速0.6mL·min－1；柱温：25?；进样量：5μL。2.1.2质谱条件采用ESI正离子模式扫描，柱后分流比为3?1。检测参数设置如下：毛细管电压4 kV，干燥气流速10L·min－1，雾化气压力275.85 kPa，干燥气温350?，在160 380V范围内调节碎片电压（160V，250V，380V），质量扫描范围m/z 100 1200，参比离子m/z121.0509和m/z 922.0098。实验数据采用Qualitative Analysis软件处理。

2.2供试品溶液的制备将黄柏、苍术、牛膝药材粉碎，过4号筛，精密称取苍术0.6g、黄柏0.4g、牛膝0.2g，置于100mL具塞锥形瓶中，加入50%甲醇40mL超声（50kHz，120W）提取40min，放至室温，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.3三妙丸中化学成分数据库的建立根据三妙丸各组方药材的化学成分研究文献，收集了生物碱类、倍半萜类及三萜皂苷类等化学成分信息，并通过“Formula－Database－Generator”软件（美国Agilent 公司），建立了三妙丸各组分药材中已知化学成分数据库。

3结果与讨论

3.1实验条件的优化

3.1.1提取方法的优化

根据中国药典（2010年版）一部三妙丸的制法，三妙丸为水丸［1］。考察提取方法，比较了回流法和超声法，发现2种方法所得图谱峰容量差异不大，于是选择了较为简单的溶剂超声法。

对于提取溶剂，考察了纯水、50%甲醇以及70%乙醇，发现采用50%的甲醇提取获得的峰容量最大，故采用50%的甲醇为提取溶剂超声提取。3.1.2色谱与质谱条件的优化

由于中药复方化学成分复杂，因此本实验中对色谱柱和流动相体系进行了较为详细的考察。色谱柱分别考察了SHISEIDO CAPCELL PAK C18色谱柱（3.0mm?100mm，3μm）、Agilent ZORBAX Ex-tend－C

18

色谱柱（3.0mm?100mm，3.5μm）和Ag-

ilent ZORBAX SB－C

18

色谱柱（3.0mm?100mm，

3.5μm），结果发现SHISEIDO CAPCELL PAK C

18

色谱柱（3.0mm?100mm，3μm）能较为全面地反映三妙丸中的化学成分，分离效果佳，因此采用此色谱柱进行分析。对流动相体系进行了优化，考察了甲醇－水、乙腈－水、乙腈－0.1%甲酸水溶液等体系，发现乙腈－0.1%甲酸水的体系能使三妙丸中各成分得到更好的分离效果，因此采用乙腈－0.1%甲酸水溶液作为流动相体系。

质谱鉴别实验中分别采用了正、负离子模式进行全扫描检测，发现在正离子模式下，峰容量更大，质谱响应更强，一些响应较弱的化合物仅在正离子模式下能够被检测到，所以最终采用正离子模式进行检测。三妙丸提取液HPLC－TOF/MS总离子流图见图1。

3.2三妙丸化学成分的鉴别分析

3.2.1利用精确质量数及同位素分布鉴别三妙丸成分

应用Qualitative Analysis质谱分析软件，通过比

图1三妙丸样品溶液的HPLC－TOF/MS总离子流图

Fig1The total ion chromatogram of Sanmiao pill sample solution obtained by HPLC－TOF/MS

较TOF/MS所测得的精确分子量和计算所得的理论值，结合三妙丸化学成分数据库，对图1中的色谱峰进行分析，初步鉴别了23个成分，结果如表1所示。实验中发现，三妙丸的多数化学成分在160V的碎片电压下时，分子离子峰有很好的响应，并且很少裂解。从表1中可见，一些来源于黄柏的4价异喹啉生物碱类化合物，在正离子模式低碎片电压（160 V）下产生分子离子峰［M］+，这与文献报道［3］一致。

表1三妙丸化学成分鉴定分析结果

Tab1Identification results of chemical constituents of Sanmiao pills

峰号（peak No．）保留时间

（retention

time）/min

化合物

（compound）

分子式

（molecular

formula）

实测值

（measured

value）m/z

M+

［M+X］+

理论值

（theoretical

value）m/z

误差

（error）

/10－6

来源

（source of

herb）*

1 2.97色氨酸（tryptophane）C11H12N2O2205.0969

227.0801［M+X］+

［M+Na］+

205.0977

227.0796

1.03

－4.41

N

2 4.093，5－二甲氧基－4－葡糖基氧苯基－拉里醇（3，

5－dimethoxy－4－glucosyloxypheny－lallylalcohol）

C17H24O9395.1320［M+Na］+395.1318－2.01C

3 5.57黄柏碱（phellodendrine）C20H24NO4342.1701M+342.1705－0.56H 47.25木兰花（magnoflorine）C20H24NO4342.1702M+342.1705－0.60H 58.36四氢小檗碱（tetrahydroberberine）C20H21NO4340.1547M+340.1549－1.14H 69.01异莲心碱（lotusine）C19H24NO3314.1750M+314.17510.11H 79.71litcubine C19H22NO4328.1534M+328.1543 2.86H 810.29蝙蝠葛林（menisperine）C21H26NO4356.1853M+356.1862 1.14H

912.70蜕皮甾酮（ecdysterone）C27H44O7481.3171

503.2978［M+H］+

［M+Na］+

481.3165

503.2985

－2.47

－3.05

N

1012.97四氢巴马汀（tetrahydropalmatine）C21H25NO4356.1870［M+H］+356.1862－3.60H

1113.95牛膝甾酮（inokosterone）C27H44O7481.3153

503.2978［M+H］+

［M+Na］+

481.3165

503.2985

1.56

0.36

N

1215.69N－methylphoebine C22H26NO5384.1817M+384.1805－3.25H 1316.86非洲防己碱（columbamine）C20H20NO4338.1396M+338.1387－2.71H 1417.27药根碱（jatrorrhizine）C20H20NO4338.1393M+338.1392－1.83H 1519.099－去甲小檗碱（berberrubine）C19H16NO4322.1079M+322.1079－1.54H 1619.85巴马汀（palmatine）C21H22NO4352.1523M+352.1549－4.68H 1720.51小檗碱（berberine）C20H18NO4336.1253M+336.1236－4.98H 1829.16N－坎迪辛（N－candicine）C11H18NO180.1387M+180.1388－2.43H 1932.23黄柏内（obaculactone）C26H30O8471.2016［M+H］+471.2019－0.52H 2032.83乙酸冰片酯（bornyl acetate）C12H20O2219.1361［M+Na］+219.1361－2.65C

2136.80黄柏酮（obacunone）C26H30O7455.2054

477.1855［M+H］+

［M+Na］+

455.2070

477.1889

2.31

6.32

H

2239.493－羟基苍术（3－hydroxyatractylone）C15H20O2233.1527［M+H］+233.1542 3.89C 2344.38selina－4（14），7（11）－dien－8－one C15H22O219.1746［M+H］+219.1749－1.12C *H：黄柏（Phellodendri Chinensis Cortex）；C：苍术（Atractylodis Rhizoma）；N：牛膝（Achyranthis Bidentatae Radix）

在数据库匹配的基础上，根据同位素分布情

况进行验证。以19号峰黄柏内酯和21号峰黄柏酮为例，采用Qualitative Analysis 软件的“同位素匹配功能”分别对这2个化合物离子的同位素峰进行匹配，匹配结果见图2。从图中可以看出，这2个离子理论上计算的（由方框表示）同位素峰强度比、出峰位置与实际测得的（由框内的峰表示）结果吻合良好，更进一步说明推导结果的准确可信

。

图2黄柏内酯（A ）和黄柏酮（B ）分子离子峰的理论同位素峰强度与实际同位素强度匹配结果Fig 2

Isotopic distribution mass －spectrogram of obaculactone （A ）and

obacunone （B ）

3.2.2

三妙丸中同分异构体的鉴别从表1中可见，三妙丸中含有3组同分异构体，

本实验采用调节TOF －MS 碎片电压，获得离子碎片，推导出化合物的裂解规律，并根据文献报道

［3－4］

，对其进行鉴别。在正离子模式下记录了不

同的碎片电压（160V ，250V 和380V ）下获得的分子离子以及确证的高灵敏度碎片离子。当电压达到

250V 和380V 时，能够产生与化合物结构相关的碎片离子，因此，选择250V 和380V 用于同分异构

体的区分。

以组Ⅰ（峰3和峰4）为例，说明同分异构体成分的鉴别过程，见图3。在160V 碎片电压下，峰3、42个物质具有相同的分子离子峰，分子式为C 20H 24NO 4，根据数据库中的信息，初步鉴定两者为黄柏碱和木兰花碱。当电压升高到250V 时，2个成分的碎片离子质谱图有一定的区别。峰3分子离子峰［

M ］+（m /z 342.170）在250V 电压下产生的碎片离子为Retro Diels －Alder 裂解碎片［M －150］+（m /z 192.102）和［M －150－CH 3］+（m /z

177.078），峰4产生［M －CH 3NHCH 3］+

（m /z

297.111）和［M －CH 3NHCH 3－CH 3OH ］+（m /z 265.085），见图3。通过碎片离子信息推断其裂解

途径，并结合文献报道［3－4］

，最终确定峰3为黄柏

碱，峰4为木兰花碱。采用类似的方法，对组Ⅱ（峰

13和峰14）也进行了区分，根据数据库匹配，初步确定2个化合物的分子式为C 20H 20NO 4。在250V

电压下均产生了相同的［M －CH 3］+

（m /z

323.1144）和［M －CH 3－H －CO ］+（m /z

294.1140）碎片离子，根据文献报道

［11－12］

，2个峰分别为药根碱和非洲防己碱。最后通过与药根碱对

照品保留时间比较，可以确定峰13为非洲防己碱，峰14为药根碱。

而组Ⅲ（峰9和峰11）在160V 碎片电压下，

2个物质具有相同的分子离子峰，分子式为C 27H 44O 7，根据数据库中的信息，初步鉴定两者为牛膝甾酮和蜕皮甾酮。当电压升高到250V 和380V 时，二者产生了同样的碎片离子，无法通过碎片离子加以区分，采用ACD /Chemdraw 软件计算的牛膝甾酮（ino-kosterone ）和蜕皮甾酮（ecdysterone ）的Log P 值分别为0.88和0.6，表明2个化合物中牛膝甾酮疏水性

更强，根据化合物在反相液相色谱上的保留原则，疏

水性越强，

出峰越晚，结合其保留时间可判断出峰9为蜕皮甾酮，峰11为牛膝甾酮。

4结论

本实验采用HPLC －TOF /MS 技术，结合数据

库匹配和碎片离子分析，

实现了对三妙丸中化学成分的分离和鉴别，共鉴别出23个成分，主要是

来源于黄柏的生物碱类。并且通过调整碎片电压，对在不同碎片电压下能够产生不同碎片离子的同分异构体进行鉴别。这为三妙丸的定性分析提供了一种有效、可靠的方法，为进一步研究三妙丸的作用机制与体内过程提供可借鉴的分析方法。

图3黄柏碱（a）和木兰花碱（b）的TOF－MS图及可能裂解途径

Fig3TOF－MS spectra and fragmentation elucidation of phellodendrine（a）and magnoflorine（b）

参考文献

1ChP（中国药典）.2010．VolⅠ（一部）：454

2Wang Xing，Wang Cai－ping，Hu Qing－hua，et al．The dual actions of Sanmiao wan as a hypouricemic agent：Down－regulation of hepat-ic XOD and renal mURAT1in hyperuricemic mice．J Ethnopharma-

col，2010，128（1）：107

3Hu Yong－mei，Su Guang－hai，Stephen Cho－Wing Sze，et al．Quality assessment of Cortex Phellodendri by high－performance liq-uid chromatography coupled with electrospray ionization mass spec-trometry．Biomed Chromatogr，2010，24（4）：438

4Li Yu－bo，Zhang Tie－jun，Zhang Xiao－lan，et al．Chemical fin-gerprint analysis of Phellodendri Amurensis Cortex by ultra perform-ance LC/Q－TOF－MS methods combined with chemometrics．J Sep Sci，2010，33（21）：3347

5WANG Jin（王瑾）．RP－HPLC determination of berberine，palma-tine and jatrorrhizine in Huangbo（RP－HPLC法测定黄柏中小檗碱、巴马汀和药根碱的含量）．Chin J Pharm Anal（药物分析杂志），2007，27（4）：610

6NAN Yang（南洋），JIA Ling－yun（贾凌云），LI Qian（李倩），et al．RP－HPLC simultaneous determination of atractylodin and atrac-tylenolide H in Rhizoma Atractylodis（RP－HPLC法同时测定苍术中苍术素和白术内酯Ⅱ的含量）．Chin J Pharm Anal（药物分析杂志），2010，30（1）：17

7ZHAO Sen－miao（赵森淼），WANG Rui（王瑞），CHOU Gui－xin （侴桂新），et al．Study on qualitative and quantitative analysis of Rhizoma Atractylodis（苍术的定性定量分析方法研究）．Chin J Pharm Anal（药物分析杂志），2010，30（5）：954

8Chen Qin－hua，Li Peng，Yang Han－dong，et al．Identification of volatile compounds of Atractylode lancea Rhizoma using supercritical fluid extraction and GC－MS．J Sep Sci，2009，32（18）：3152

9Li Juan，Qi Hui，Qi Lian－wen，et al．Simultaneous determination of main phytoecdysones and triterpenoids in Radix Achyranthis Bident-atae by high－performance liquid chromatography with diode array－evaporative light scattering detectors and mass spectrometry．Anal Chim Acta，2007，596（2）：264

10Li Juan，Li Ping，Li Hui－jun，et al．Simultaneous qualification and quantification of eight triterpenoids in Radix Achyranthis Bidentatae by high－performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection and mass spectrometric detection．J Sep Sci，2007，30（6）：843

11Ren Ling－ling，Xue Xing－ya，Zhang Fei－fang，et al．High per-formance liquid chromatography－mass spectrometry analysis of protoberberine alkaloids in medicine herbs．J Sep Sci，2007，30（6）：833

12Chen Jun－hui，Wang Feng－mei，Liu Jie，et al．Analysis of alka-loids in Coptis chinensis Franch by accelerated solvent extraction combined with ultra performance liquid chromatographic analysis with photodiode array and tandem mass spectrometry detections．Anal Chim Acta，2008，613（2）：184

（本文于2012年6月19日收到）

（上接第787页）

参考文献

1Sigita L，Audrius S，Elona J，et al．Safety and efficacy study of the re-combinant granulo－cytecolony－stimulating factor for prevention of neutropenia and neutropenia－related complications in women with metastatic breast cancer receiving docetaxel/doxorubicin．Medicina （Kaunas），2009，45（8）：600

2SFDA（国家食品药品监督管理局）．Drug（药品）/National Drug （国产药品）/Biological Products（生物制品）/Recombinant Human Granulocyte Colony Stimulating Factor（重组人粒细胞刺激因子）［DB/OL］．［2009－02－10］．http：//app1．sfda．gov．cn

3YANG Xin（杨欣），LIU Bo（刘波），PENG Ru－hui（彭如惠），et al．Protein determination of recombination human granulocyte colony stimulating factor in finished products（重组人粒细胞集落刺激因子

成品蛋白质含量测定方法的研究）．Chin J Biochem Pharm（中国生化药物杂志），2004，25（5）：308

4ChP（中国药典）.2005．VolⅢ（三部）：Appendix（附录）58

5SHI Xin－chang（史新昌），HAN Chun－mei（韩春梅），LUO Li－jun（罗立骏），et al．The possibility of direct protein content determi-nation by UV－HPLC without standard reference（紫外－可见光检测器的高效液相色谱无标准品直接测量蛋白含量的可能性）．Chin J Pharm Anal（药物分析杂志），2010，30（9）：1684

6ZHANG Yi（张翊），HAN Chun－mei（韩春梅），GAO Kai（高凯），et al．Study on methods and requirements for quality control of pegy-lated recombinant human G－CSF（聚乙二醇化重组人粒细胞集落刺激因子的质量标准和质控方法研究）．Drug Stand China（中国药品标准），2004，5（2）：1

（本文于2012年8月15日收到）