石蜡组织DNA提取SOP

提取石蜡包埋组织基因组DNA标准操作规程

1. 目的：由石蜡包埋组织中提取出基因组DNA，以保证后续检测的正常进行。

2. 操作者：病理科负责取材的技术员、病理医师以及分子病理技术员。

3. 准备工作：

3.1 56℃和90℃水浴锅

3.2二甲苯或无毒脱蜡液(Deparaffinization Buffer)

3.3无水乙醇

3.4蛋白酶K溶液：每管干粉状的蛋白酶K中加入1.1ml蛋白酶K溶解液，颠倒让蛋白酶K充

分溶解，分装保存于-20℃。

3.5洗涤液GW1使用前，须加入17ml无水乙醇进行稀释。

3.6洗涤液GW2使用前，须加入80ml无水乙醇进行稀释。

4. 步骤：

4.1标本接收：分子病理技术员负责核对送样登记表所记录的病理号与标本编号是否一致，要求10um肿瘤组织病理石蜡切片不少于4张，可以是已经切好并放在载玻片上的切片；所有切片均应是未经染色的白片。

4.2脱蜡(可按以下方案A或方案B去除石蜡）：

方案A：二甲苯去除石蜡(经典方案)

A1：石蜡蜡卷

A1-1：将石蜡切片置于1.5ml离心管中，加入1ml二甲苯，盖紧涡旋振荡10s，13000r/min 离心2min，吸去上清，保留沉淀；如脱蜡不完全，可重复该步骤一次。

A1-2：向离心管中加入1ml无水乙醇，涡旋振荡混匀，13000r/min离心2min，吸弃上清，用移液器吸头小心将组织摊开粘附于管壁，置于恒温加热器（预先设置为37℃）10min晾干，直到乙醇完全挥发，之后按4.3步骤进行操作。

A2：石蜡切片

A2-1：将组织切片置于二甲苯浸泡10分钟，两次；

A2-2：无水乙醇浸泡5分钟，一次；

A2-3：蒸馏水中浸泡，刮取肿瘤区域到1.5ml离心管中，之后按4.3步骤进行操作。

方案B：无毒脱蜡液(Deparaffinization Buffer)去除石蜡

B1-1：加入0.5ml Deparaffinization Buffer至样品中，剧烈涡旋10s。

B1-2：短暂离心让样品浸泡到脱蜡液中，56℃水浴3~5min，剧烈涡旋20s。

B1-3： 14,000 x g离心2min，彻底吸弃上清液，不要吸到沉淀，之后按4.3步骤进行操作。4.3消化：

4.3.1 向脱蜡的组织中加入200ul裂解液 ATL，再加入20ul蛋白酶K溶液，吹打混匀。

4.3.2 取一小条保鲜膜将离心管缠绕封口（以防后续高温管盖爆开），56℃温浴1-3h或直

到样品完全消化，其间需颠倒混匀数次。样品也可以消化过夜，过夜消化对提取结果无负面影响。

4.4孵化：标本消化完全后置于90℃水浴孵化1h。

4.5（可选）若液体仍存在明显不消化的杂质，10,000 x g 离心3min去除杂质。转移上清

液至新的离心管。

4.5吸附洗涤：

4.5.1 离心收集管壁上的液体，待温度降至室温，加入200ul 变性液AL和200ul无水乙醇，

涡旋混匀15s。

4.5.2 转移混合液至吸附柱。10,000 x g离心30~60s。

4.5.3 倒弃滤液，把柱子装回收集管中，加入500μl洗涤液GW1(已用乙醇稀释)至吸附柱

上，10,000 x g离心30~60s。

4.5.4 倒弃滤液，把柱子装回收集管中，加入650μl洗涤液GW2(已用乙醇稀释)吸附柱中，

10,000 × g离心30~60s。（可选，重复操作此步骤1次，有助于提高核酸纯度。）。

4.5.5 倒弃滤液，把吸附柱装回收集管中，10,000 × g离心空柱3min。

4.6洗脱：将吸附柱转移至新的1.5ml离心管中，加入15~100μl 洗脱液EB至柱子的膜中

央。放置1分钟，10,000 × g离心1min。（如有需要可吸取滤液重复洗脱一次）。

4.7定量：对提取好的基因组DNA定量，操作方法参照Thermo超微量紫外可见分光光度计使用操作规程，记录数据。

4.8提取完成的基因组DNA应尽快完成后续实验，如暂时不安排实验，长时间保存须将

DNA置于-20℃或-80℃。

5. 清场：将移液器，吸头等设备耗材归位，维护；并做好相关记录。

6. 质量控制：操作技术员应控制好消化时间，加试剂时核对试剂名称，多个标本同时进行

提取时要做好记号，严格要求操作的每一步，防止标本间的污染。