食品科学工程毕业论文 -

论文题目：复合添加三种天然抑菌剂的乳清蛋白膜抑菌效果的研究

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摘要

乳清蛋白具有良好的营养特性以及成膜的能力，它可以形成透明、柔软、有弹性、不溶于水的薄膜，且具有优良的氧气、芳香物质和油脂的阻隔性。本研究以乳清浓缩蛋白（WPC80）为主要成膜物质，通过添加天然抑菌剂制成乳清蛋白抗菌膜。

先测定nisin、丁香精油和纳他霉素的最小抑菌浓度，再与乳清蛋白溶液复合，通过单因素试验，以抑菌圈的大小为测定指标研究复合膜的抑菌效果。最后将三种抑菌剂和乳清蛋白溶液复合，通过正交试验，仍以抑菌圈的大小为测定指标确定三种天然抑菌剂的最佳加入量。研究表明：当Nisin、丁香精油和纳他霉素联合作用时，复合膜的抑菌效果较单独使用时显著增强。300IU/ml Nisin、1.5%丁香精油和60ppm的纳他霉素三者联合作用效果显著强于其他八组。乳清蛋白复合抗菌膜三种抑菌剂的最佳加入量为：Nisin 300IU/ml、纳他霉素60ppm、丁香精油1.5%。

关键词：乳清蛋白抗菌膜抑菌性；

Subject: Study on the antimicrobial properties of edible whey protein composite film supplemented with three natural antibacterial agents College and Specialty: College of Food & Bioengineering

Food Science & Engineering 061

Name:

Supervisor:

ABSTRACT

Whey protein, which has good nutritional properties, as well as the ability of film, can form a transparent, bland, flexible，insolubility films and possess excellent oxygen, aroma and lipid barrier properties. In this paper, it takes WPC80 as the main film-forming material to make whey protein natural anti-bacterial film by addition of natural antimicrobial agents.

First determinating the minimum inhibitory concentration of nisin, natamycin , clove essential oils , and then combined with the whey protein solution, last determination of the antibacterial effect of composite films through single factor test taking the size of inhibition zone as index . Finally, combining three kinds of antimicrobial agents and whey protein solution and determining the best dosage of the three kinds of antimicrobial agents through orthogonal test, still taking the size of inhibition zone as indicator .The results show that: the effects of the composite membrane significantly enhanced when Nisin, Natamycin clove essential oils are combined compared the antibacterial effect of when they used alone. when 300IU/ml Nisin, 1.5% clove oil and 60ppm of natamycin combined ,the effect was stronger than the other eight groups. When making whey protein antimicrobial complex film, the best addition of three antimicrobial agents is: Nisin 300IU/ml, natamycin 60ppm, clove oil 1.5%.

Key words: whey protein Antibacterial film Antimicrobia

前言 (1)

第一章文献综述 (2)

1.1国内外同类研究的概况综述 (2)

1.1.1蛋白可食性包装膜 (2)

1.1.2多糖可食性包装膜 (3)

1.1.3蛋白质、脂肪酸、多糖复合型可食性包装膜 (4)

1.1.4微生物共聚聚酯可食性包装膜 (5)

1.1.5以脂持为载体的抗菌活性膜 (5)

1.2天然抗菌剂 (5)

1.2.1丁香简介 (5)

1.2.2 Nisin简介 (6)

1.2.3 纳他霉素简介 (7)

1.3可食性抗菌膜 (7)

1.3.1可食性抗菌膜 (7)

1.3.2可食性抗菌膜的抗菌机理 (8)

1.4本课题的研究目的、意义和内容 (9)

第二章三种天然抑菌剂最小抑菌浓度的测定 (10)

2.1 材料与设备 (10)

2.2 实验方法 (10)

2.2.1NISIN效价的测定 (10)

2.2.2丁香精油最低抑菌浓度(MIC)的测定 (11)

2.2.3纳他霉素最低抑菌浓度(MIC)的测定 (11)

2.3 结果与分析 (11)

2.3.1 NISIN效价 (11)

2.3.2丁香精油最低抑菌浓度 (12)

2.3.3纳他霉素最低抑菌浓度 (13)

第三章复合抗菌膜抑菌性能的研究 (15)

3.1实验材料与仪器 (15)

3.1.1 材料 (15)

3.1.2仪器和设备 (15)

3.2实验方法 (15)

3.2.1WPC/NISIN复合膜研究 (16)

3.2.2WPC/丁香精油复合膜研究 (16)

3.2.3 WPC/纳他霉素复合膜研究 (16)

3.2.4WPC/丁香精油、NISIN、纳他霉素复合膜研究 (16)

3.2.5乳清蛋白抗菌膜抑菌效果的测定 (17)

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3.3 结果与分析 (17)

3.3.1 三种抑菌剂分别与WPG复合的抑菌性研究 (17)

3.3.2 正交试验结果及分析 (20)

第四章结论 (26)

参考文献 (27)

致谢 (29)

前言

我国食品行业包装发展趋势在食品消费趋向功能化、健康化、方便化、营养化的今天，食品工业对食品包装不断提出新的需求。人们对食品包装的需求已经从过去的保证卫生、视觉、味觉的要求转向保护食品内在营养成分、延长货价期、消除潜在污染与危害深层要求。这就为具有抑菌功能、保鲜功能等的特殊包装材料创造了巨大的市场。因此，如何抑制代谢过程，减少营养物质的消耗，保持食品的风味质量，延长食品的保存期是食品包装的重要课题。

特殊功能包装材料和包装技术，如防光污染包装材料、除菌包装材料、可食性包装材料、化学污染及重金属消除包装技术、环境（温、湿度）自适应包装技术、纳米包装材料等包装技术和材料也成为包装材料和气技术的研发重点，且在国内外都有所突破。

随着人类生存与社会发展之间的矛盾越来越突出，环保问题已经成为世界性重大课题，迫使人们不断寻找对人类生存无害，对资源消耗小的包装材料以及与之相匹配的包装技术。聚乙烯、聚苯乙烯、聚酰胺等这些传统的塑料薄膜包装材料残留期长，且不能被生物降解，环境污染严重，面对环境污染及安全性等问题，各国都在努力寻找一种“绿色包装”材料来代替塑料包装。所谓“绿色包装”是指对生态环境和人体健康无害，且能重复使用或再生利用，符合可持续发展原则的包装[1]。在众多的环保材料研究中，可食用膜已引起世界各国越来越多的重视，大有取代塑料包装、纸包装材料之趋势。

可食用抗菌膜技术是将抗菌剂添加到可食用材料中，通过浸涂和喷涂等方法，在食品表面形成一层涂膜，实现贮藏保鲜、改良品质、强化营养和延长保质期的目的。蛋白质可食用抗菌膜有高营养，易消化，机械性能好，透明性强，且外观及口感均较理想等优点，特别是具有较高的阻气性，日益受到研究者的重视。目前人们对以蛋白质为基质的可食用抗菌膜的研究大多集中在大豆蛋白、面筋蛋白等，对于乳清蛋白这种高生理活性、高营养价值的优质蛋白质膜的研究还不多。乳清蛋白具有良好的营养特性以及形成膜的能力，它以形成透明、柔软、有弹性、不溶于水的薄膜，并且此膜在较低的湿度下具有优良的氧气、芳香物质和油脂的阻隔性，还可以作为食品风味料、营养强化剂、抗氧化剂、抗微生物制剂。

第1章文献综述

部分食品，如肉品、水产品、果蔬类产品腐败变质的重要原因在于其表面微生物的生长和繁殖，另外一些食品在加工过程中虽然己经有过灭菌处理，但是在贮藏、运输或开封后仍然容易被微生物污染。为了避免这些情况的发生，人们通常在食品中或者在食品的表面添加大量的抗菌剂。但经实验研究和生产应用发现，直接将抗菌物质应用于食品的保鲜效果很有限，一方面在抗菌剂与食品的接触中，抗菌剂很容易与食品中的成分发生相互作用而失效，另一方面抗菌剂很快渗透到食品内部，在食品表面这个微生物最易滋生和繁殖的部位不能保持足够的抗菌浓度。可食性抗菌膜应运而生，它具备可食性膜的优点又兼抗菌性，膜保护了食品的外观，并且对外界的气体、水分和微生物起到阻隔作用；此外，在食品加工生产过程中能减少抗菌剂的添加量，大大减少了消费者摄入化学试剂的量，而且由于抗菌剂的缓慢释放，对食品还能起到持久抑菌作用，延长保质期。如今，可食性抗菌膜成为了当今食品保鲜的研究热点。

1.1国内外同类研究的概况综述

1.1.1蛋白可食性包装膜

以蛋白质为基质的可食用膜主要有大豆分离蛋白膜、玉米醇溶蛋白膜、小麦面筋蛋白膜和乳清蛋白膜等。

1.1.1. 1大豆分离蛋白可食性包装膜.这种包装膜是由美国农业研究局南部地区研究中心研究开发成功的。它具有许多优点，如既能保持水分，又能阻止氧气进入，还能确保脂肪类食品的原味。食用后营养价值高，同时易于处理，完全符合环保要求。经试用，效果良好。利用大豆提炼的蛋白质，制造出类似塑料的薄膜基料，与甘油、山梨醇等对人体无害的增塑剂相混合，可制成有着多种用途的可食性包装膜用于食品包装，它们具有良好的强度、弹性和防潮性，有的还具有一定的抗菌消毒能力。

1.1.1.2小麦面筋蛋白可食性包装膜. Wall、Okamoto、Krull等对小麦面筋成膜基础和工艺进行了深入的研究。Aydt和Weller使小麦面筋蛋白溶于乙醇，加入甘油、氨水等作为增塑剂制得可食性包装膜。该类膜韧性较强、半透明，具有

良好的隔绝氧气和CO2能力，但防潮、防湿性能较差。

1.1.1.3玉米醇溶蛋白可食性包装膜

醇溶蛋白是由平均分子量为25 000～45 000的蛋白质组成的混合物，由于醇

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溶蛋白的氨基酸末端带有亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸等非极性憎水基团，增加了其疏水能力。Aydt和Kanig等将醇溶蛋白溶于乙二醇或异丙醇溶液，以甘油、丙二醇或乙酰甘油作增塑剂制得可食性包装膜。醇溶蛋白可食性包装膜具有成膜速度快、高温高湿下贮藏稳定、可靠的安全性、对氧气和CO2隔绝性和防潮性极好等特点。日本农林水产省食品综合研究所和国内徐丽萍、张根生等的研究也取得类似的结果。

1.1.1.4乳清蛋白可食性包装膜

乳清蛋白最近几年才被用作可食性包装膜的基质材料。乳清蛋白中含量最多的α－乳白蛋白和β－乳球蛋白分散度高、水合力强，呈典型的高分子溶液状态。McHugh与Krochta等以乳清蛋白为原料，甘油、山梨醇、蜂蜡、CMC等为增塑剂研制的各种乳清蛋白可食性包装膜具有透水、透氧率低，强度高的特点。

1.1.2多糖可食性包装膜

以植物多糖或动物多糖为基质的可食用膜主要有淀粉膜、改性纤维素膜、动－植物胶膜、壳聚糖膜和葡甘聚糖膜等。

1.1.

2.1.淀粉可食性包装膜

淀粉可食性包装膜是可食性包装膜中研究开发最早的类型。近年来，在成膜材料与工艺和增塑剂研究应用方面都取得了重要进展。Austin H.Yang、王淑珍、李志达等以淀粉，特别是直链淀粉(普通淀粉可用异淀粉酶脱支改性，提高直链淀粉含量)为基质，多元醇(如甘油、山梨醇、甘油衍生物及聚乙二醇)及脂类物质(如脂肪酸、单甘油脂、表面活性剂等)为增塑剂，少量动－植物胶为增强剂研制的各种淀粉可食性包装膜具有拉伸性、透明度、耐折性、水不溶性良好和透气率低的特点。

1.1.

2.2改性纤维素可食性包装膜

近年来世界各国对改性纤维素可食性包装膜的研究开发极为重视。日本最近推出以豆渣为原料的可食包装膜，用于快餐面调味料的包装。其特点是用热水一泡便溶化，不用撕开包装，不仅方便，而且还有一定的营养价值。我国刘邻渭、陈宗道等以甲基纤维素、羧甲基纤维素为原料，硬脂酸、软脂酸、蜂蜡和琼脂为增塑剂、增强剂制得半透明、柔软、光滑、入口即化的可食性包装膜，它具有较高拉伸强度，较小透湿、透气性的特点。同时，我国在蔗渣纤维素可食性包装膜的研究开发上也取得较好的进展。

1.1.

2.3动－植物胶可食性包装膜

这类可食性膜以动物胶如明胶、骨胶、虫胶，植物胶如葡甘聚糖、角叉胶、果胶、海藻酸钠、普鲁蓝等为基质，甘油、多元醇、山梨酸酯等为增塑剂，制得

第1章文献综述

各种用途的可食性包装膜。日本在动－植物胶可食性包装膜的开发应用上一直处于世界领先水平，四国工业技术试验所、林源生物化学研究所、大阪化学合金公司、三菱人造丝公司先后开发出的多种动－植物胶可食性包装膜均具有透明、强度高，印刷性、热封性、阻气性、耐水耐湿性较好的特点，已用于调味品、甜味料、汤料、油脂等食品的包装。国内阚建全、陈永红等对明胶可食膜机械强度和热封强度，李洪军、贺稚非等对海藻酸钠成膜特性及膜的物理机械性能，罗学刚等对葡甘聚糖可食膜的成膜基础和工艺等的研究，为可食膜的工业生产和应用奠定了基础。

1.1.

2.4壳聚糖可食性包装膜

壳聚糖是虾、蟹、昆虫等甲壳的提取物。这种包装膜是由美国农业研究所、加州农业技术研究中心研制开发成功的，主要用于果蔬类食品的包装。将壳聚糖与12个碳原子月桂酸结合在一起，便可生成一种均匀的可食薄膜，厚度仅为0.2～0.3毫米。因此，透明度很大，用于去皮或者切片水果的保鲜包装，有很好的保鲜作用。

1.1.3蛋白质、脂肪酸、多糖复合型可食性包装膜

复合膜将亲水胶质膜和脂质膜的优点集于一身，是活性包装膜今后的发展方向，如蛋白质／脂质，多糖／脂质复合膜不同属性的载体相互混合，由于彼此之间产生的交互作用就可以达到取长补短的效果，进一步完善膜的包装功能。例如，通过在亲水胶质中添加蜂蜡、棕榈酸、硬脂酸和月桂酸等，可使制成的膜对水的阻隔能力大大加强。Bertana等人在白明胶中加入巴西榄香脂，乙酸甘油酯、硬脂酸和榈酸而制成的复合膜。其阻湿性明显提高，可以改善包装内微环境的湿度，使不耐干燥的某些微生物无法生存，从而达到间接抑菌的目的，保证食品安全性.美国威斯康星大学食品工程系在研究开发可食性包装材料中，将不同配比的蛋白质、脂肪酸和多糖结合在一起，制造成一种可食用的包装薄膜。这种包装薄膜，脂肪酸分子越大，其缓阻水分逸失的性能越佳，同时由于复合膜中蛋白质、多糖的种类、含量不同，膜的透明度、机械强度、印刷性、热封性、阻气性、耐水耐湿性表现不同，可以满足不同食品包装的需要。我国研制成功的复合包装膜以玉米淀粉为基料，分别加入海藻酸钠或壳聚糖，再配以一定量的增塑剂、增粘剂、防腐剂，经特殊工艺加工组成，可用于果脯、糕点、方便面汤料和其它多种方便食品的内包装。其主要特点是，具有较强的抗张强度和延伸率，以及有很好的水性。

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1.1.4微生物共聚聚酯可食性包装膜

这类膜是以自然资源糖蜜、油脂等为原料，通过微生物发酵产生的3－羟基丁酯、3－羟基戊酯、4－羟基丁酯、已内酯等通过聚酯制成可食性包装膜。当前微生物共聚聚酯研究开发的产品有英国ICI公司3－羟基丁酯和3－羟基戊酯(90％)的共聚聚酯膜及3－羟基丁酯和4－羟基丁酯共聚聚酯膜以及美国麻省理工大学开发的脂肪族共聚聚酯膜。这类膜既具有普通塑料薄膜光学性能好、透明有光泽、物理性能优良、质轻密度小、化学性能稳定、易成形加工和广泛的代用性等优点，又具有可食性和完全生物分解性，因此受到各国的重视

1.1.5以脂持为载体的抗菌活性膜

据CaUegarin等人的研究，以脂质为载体的膜，最大的优势在于对水有很高的阻隔性能。他们还指出，影响脂类膜水阻隔性能的因素主要包括脂质的结构饱和度，链长、存在状态，晶型、晶体的大小以及分散率等。可以作为脂质抗菌活性膜载体的有蜡，脂肪酸和酰基干油，其中蜡是用得最多的，在欧盟，蜂蜡，蜡拖鞋花蜡、巴西棕榈蜡和虫漆都可以用做食品表面的膜制剂，这些天然的蜡质膜可以很好的减少苹果中水分和香气损失，烂果率和被霉菌感染的机会，保证苹果良好的口感和外形，延长了储藏时间，保证消费者在非时令期也可以吃到同样有质量保证的苹果。

1.2天然抗菌剂

可食性抗菌膜常用的天然抗菌剂有：有机酸（醋酸，乳酸，丙酸、苯甲酸、山梨酸等）及其盐类、抗菌素（乳酸链球菌素，纳他霉素）等，以及一些其他具有抑菌效果的天然成分（丁香精油，大蒜精油）等也可被添加到成膜材料中。

1.2.1丁香简介

丁香(Syzygium aromaticum)为桃金娘科植物丁香( Syzygium aromaticum) 的干燥花蕾，是调味品中常用的香辛料之一，其水提取液、醇提取液及挥发油对多种细菌、真菌具有抑制和杀灭作用[2]，其抗菌物质主要是挥发油[3]，有效成分为丁香酚，化学名称为2-甲氧基-4-烯丙基苯酚，有芳香环，芳香环上有极性基团，能与微生物的某些酶活性基团结合，破坏正常的代谢功能，从而影响了微生物的生长[4]，属理想的天然抑菌防腐保鲜剂。

王春梅、张杰[5]等研究表明，在室内离体条件下丁香酚对灰霉病菌茵丝生长和茵丝形态有很大影响，当其使用浓度为200㎎/mL时，茵丝干重仅为对照菌丝的

第1章文献综述

11．56％。丁香酚的抑茵效果不受pH值(5—9)的影响。当丁香酚浓度为500—200㎎/mL时，其保护作用防效为81．63％一100％，治疗作用防效为28．45％一59．41％。光镜和电镜观察发现丁香酚处理导致茵丝发生一系列变化：茵丝内部出现空泡化，茵丝表面沉积大量外渗物，茵丝呈不规则缢缩，茵丝内部各细胞器结构紊乱。吕世明、陈杖榴、陈建新[6]等用微量稀释法对丁香酚体外抑菌活性进行了研究，结果表明，丁香酚对12种常见细菌具有较好的抑菌作用，其中对大肠ATCC25922(质控菌)的效果最好，其最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)分别为5μg／ml和10μg／ml；对蜡状芽孢杆菌作用较差，MIC和MBC分别为32μg／ml和640μg／ml：其余菌株的MIC和MBC分别在20～80μg／m1和40～160μg／m1之间。而时间．杀菌曲线法实验结果表明，丁香酚抑茵作用特性表现为较强的浓度依赖性，其良好的抑菌活性可作为潜在的天然食品防腐剂进一步研究和开发。

1.2.2 Nisin简介

nisin是由Lactococcus Lactic在代谢过程中合成和分泌的具有很强杀菌作用的小分子肽，能有效地抑制引起食品腐败的大部分革兰氏阳性菌。Nisin食用后在消化道内很快被蛋白酶水解为氨基酸，不影响肠道内的正常菌群，是唯一一种可作为防腐剂应用于食品的细菌素。1969年FAO/WHO确认Nisin为安全、高效、可靠的食品防腐剂。自1951年首次应用以来，至今已在五十多个国家得到广泛应用[7]。

Nisin能有效抑制许多革兰氏阳性细菌的生长繁殖，如乳杆菌、明串珠菌、小球菌、葡萄球菌、李斯特菌等，特别是对产芽孢的细菌如芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌有很强的抑制作用。通常，产芽孢的细菌耐热性很强，如鲜乳采用135℃、2秒钟超高温瞬时灭菌，非芽孢细菌的死亡率为100％，芽孢细菌的死亡率90％，还有10％的芽孢细菌不能杀灭。若鲜乳中添加0.03-0.05g/kg Nisin就可抑制芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌孢子的发芽和繁殖。郭良辉、许巧倩[8]等研究了冷藏条件下用nisin与几种溶菌酶符合生物保鲜剂对三角帆蚌的保险效果。结果表明nisin与溶菌酶单独使用或者混合添加都具有明显的保险效果，混合添加保鲜效果更佳，再其他条件相同的情况下，可延长保质期约一倍或更长。试验还得出，nisin对于抑制脂肪的酸败具有明显的效果。张百刚、高华[9]采用琼脂扩散法测定温度和pH分别作用和联合作用对nisin的抑菌效果的影响。结果表明在pH小于4时nisin的稳定性较高，温度对其活性几乎无影响，并随着pH降低，nisin的抑菌作用增强；当pH大于4时，温度对其活性影响较大，随着pH的增大，抑菌作用下降，在中性及碱性中nisin的活性几乎完全丧失。在相同的处

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理条件下，nisin对枯草杆菌等革兰氏阳性菌的抑菌效果最好。

1.2.3 纳他霉素简介

纳他霉素是由纳塔尔链霉菌等微生物产生的，是能有效抑制和杀死霉菌、酵母菌和丝状真菌的天然生物防腐剂。纳他霉素可有效地降低真菌对食品的污染及真菌毒素对人类的危害。与其他抗菌成分相比，纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低，可以广泛应用于由真菌引起的疾病。另外，纳他霉素的溶解度低，可用于对食品表面的处理，延长食品的保质期，却不影响食品的风味和口感。目前纳他霉素已作为一种天然的食品生物防腐剂，被许多国家广泛应用于乳制品、肉制品、果制品和粮食等的生产和保藏过程中。

李东、杜连祥[10]等通过研究表明，作为天然、高效、低毒、实用型防霉剂———纳他霉素已广泛用于食品、饮料、水果、肉制品中。孙启华、崔树玉[11]等研究采用琼脂稀释法和试管稀释法分别对纳他霉素的防腐抑菌效果进行的研究结果表明,纳他霉素对所试黄曲霉菌、青霉菌和酵母菌具有较强的抑制作用。研究发现,应用琼脂稀释法测定的纳他霉素对大多数真菌的最低抑菌浓度1.25 ～5. 0mg/L,试管稀释法测定的最低抑菌浓度为0. 62 ～1. 25 mg/L。结果提示,在食品生产中应用纳他霉素作为防腐剂时,应控制流质食品和非流质食品的使用剂量,流体食品的使

用剂量应不低于1. 25 mg/L,非流质食品应不低于5. 0 mg/kg。研究结果证明,不同接种菌量和培养时间对纳他霉素抑菌效果存在影响,提示纳他霉素防腐效果随污染菌量的增加而降低;对食品的防腐效果随时间延长而降低。故在选择纳他霉素防腐剂量时应考虑被防腐食品的原料污染状况、产品性质、加工工艺、消毒除菌、储存条件、保质时间和产品包装等因素的影响,合理使用纳他霉素,达到最佳防腐效果和最经济的使用浓度,尽可能延长食品的保质期。

1.3可食性抗菌膜

1.3.1可食性抗菌膜

抗菌性食品保鲜膜是指在保鲜膜中添加抗菌剂，通过抗菌剂的缓释和光催化等作用达到抗菌、保鲜目的的一种功能薄膜[12]。可食性抗菌膜具有以下特点：(1)明显的阻水性，可延缓食品中水和油及其它成分的迁移和扩散；(2)可选择的透气性和抗渗透能力，阻止食品中风味物质的挥发；(3)较好的物理机械性能，可提高食品表面机械强度使其易于加工处理；(4)可以作为食品色、香、味、营养强化和抗氧化物质等的载体；(5)可与被包装食品一起食用，并且有较好的抑菌作用，对食品和环境无污染，因而在食品工业方面具有广阔的应用前景。近年来，在西欧

第1章文献综述

发达国家，过去风行一时的塑料食品包装袋已逐渐被淘汰，被新型的纸质包装袋和可食性包装袋所代替。美国已有50％的传统塑料食品包装袋由新型纸质食品包装代替。同时，美国新泽西州的全国淀粉及化学公司的科研人员正利用玉米为原料研制一种新型食品包装材料。世界食品出口大国意大利已明确宣布完全禁止使用塑料食品包装袋包装食品；英国从1991年开始使用一种可食用、薄而透明的薄膜保鲜果蔬；德国、瑞士、澳大利亚等国正逐渐淘汰塑料食品包装袋[13]；我国也在“九五”期间实施了“绿色包装”工程，即通过控制包装行业的投资方向，逐步发展易挥发、可再利用的包装材料。目前，国内外可食性包装膜的研究进展迅速。

抗菌性食品保鲜膜是在成膜材料中加入天然抗菌剂，膜中抗菌剂缓慢释放，在较长的时间内逐渐作用于食品，从而持久的抑制或防止微生物的生长[14]。可食性抗菌膜主要有4种形式:

1、将抑菌性物质直接添加到成膜材料中，制成抗菌膜；

2、通过特殊处理使抗菌性物质附着在膜表面；

3、通过化学键的形式将抗菌性物质与成膜物质固定在一起；

4、选择天然具有抗菌性的成膜材料，如壳聚糖等

1.3.2可食性抗菌膜的抗菌机理

可食性抗菌膜应用于食品时主要有两种方式，一是食品与可食性抗菌膜直接接触，这通常是指直接用于浸渍或喷涂食品的膜液，添加到成膜溶液中的抗菌剂一般是非挥发性的，抗菌剂通过在膜材料与食品之间的扩散而不断进入食品中，起到持久的抑菌作用；二是食品与可食性抗菌膜之间存在缝隙，这主要是指经过制膜工艺制备的独立的膜，混入膜材料中的抗菌剂具有挥发性并且耐热性比较好，在这种方式下，抗菌剂主要通过在缝隙、膜材料和食品中的蒸发和迁移达到平衡分布，在食品外部形成一个抑菌的环境[15]。

可食性抗菌膜主要通过直接抗菌或间接抗菌两种途径实现其对食品的保鲜功能。直接抗菌是将某些具有抗菌功能的物质直接添加在载体内制成薄膜，这类薄膜会不断地向与其接触的食品表面释放抗菌物质而实现对食品的防腐；间接抗菌是在载体中添加一些能够调节包装内微环境的物质或利用包装膜的选择透过性来调节包装内微环境而不利于微生物生长和繁殖，从而实现抗菌目的[16]。直接抗菌常用的抗菌剂包括食品防腐剂、抗生素和溶菌酶等，这类抗菌包装膜研究和使用较为广泛；间接抗菌则常通过调节包装内气体组成和湿度等实现其抗菌功能。

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1.4本课题的研究目的、意义和内容

随着社会的发展，对环境的保护也使人们更加关注食品安全，而食品包装材料的使用是一个重要的方面。关注食品安全从食品包装开始。降低食品包转的成本，能重复使用，减少污染，可持续发展，成为21世纪我们必须面对的重要课题。

在我们生活的环境中，塑料造成的白色污染到处可见，我们城市将会被塑料等包装废弃物所包围。所以，面对这严峻的事实，我们应尽量在设训食品包装时，解决好产品和包装的合理定位，尽量采用高性能包装材料和高新包装技术，在保证商品质量的同时，尽量减少包装用料和提高重复使用率，降低综合包装成本，注重生态环境保护，使产品包装与人及环境建立一种共生的和谐关系，不断开发可控生物降解、光降解及水溶性的包装材料，把包装对生态环境的破坏降低到最低的程度。在大力推广绿色食品即无污染、安全、优质、营养类食品的同时，绿色包装的新概念也不断地被人们所重视，它是指有利于人类生存环境的包装，有利于环境保护和资源保护的包装。研究和开发绿色包装是社会发展的必然趋势，也是未来包装市场的竞争热点。绿色包装的技术系统，应该解决包装在使用前后的整个过程中对生态环境的破坏问题，研究和寻找理想的绿色包装技术，对不同的商品要开发研究相应的绿色包装制品和方法。

采用生物可降解食品包转材料是解决包装材料的环境污染问题的一个行之有效的方法。乳清蛋白是由干酪生产过程中所产生的副产品乳清，并经过特殊工艺浓缩精制而成，具有很高的营养价值、生物利用价值，并且具有良好的营养特性以及成膜的能力，经过处理可以形成透明、柔软、有弹性、不溶于水的薄膜，而且这种膜在较低的湿度下具有优良的对氧气、芳香物质和油脂的阻隔性。本研究旨在以乳清蛋白和天然抑菌剂为原料，分析比较了不同抑菌剂的不同水平和不同组合对乳清蛋白复合抗菌膜抑菌效果的影响；以抑菌圈的大小为测量指标，确定复合抗菌膜的天然抑菌剂的最佳加入量，开发集防腐抑菌、保健等功能为一体的复合抗菌膜。

本文主要的研究内容有：⑴三种乳清蛋白复合抑菌膜的制备⑵ nisin、聚赖氨酸、丁香精油最小抑菌浓度的测定⑶测定复合抑菌膜的抑菌效果，通过单因素和人正交试验确定不同抑菌剂的最佳加入量。

第2章三种天然抑菌剂最小抑菌浓度的测定

2.1 材料与设备

材料

丁香精油（主要成分丁香酚，上海生物化学有限公司）、Nisin（106IU，洛阳市华健生物工程有限公司）、纳他霉素（浙江银象生物工程有限公司）：以上均为分析纯。

菌种：

细菌：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus；大肠杆菌Escherichia coli；沙门氏菌Salmonella；

霉菌：黑曲霉Aspergillus niger；绿色木霉Trichoderma viride

酵母：粘红酵母Rhodotorula glutinis

以上菌种均由本院微生物教研室提供

培养基：

营养肉汤琼脂培养基（北京奥博星生物技术有限公司，批号：20080712）；

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) （北京奥博星生物技术有限公司，批号：20081006）；

麦芽汁琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：20080912）；

MRS琼脂培养基（北京奥博星生物技术有限公司，批号：20080816）

仪器和设备

JJ-1型电动搅拌器：金坛市正基仪器有限公司；202型电热恒温干燥箱：北京市永光明医疗仪器厂；精密电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；HH-S恒温水浴锅：金坛市亿通电子有限公司；移液枪：上海荣泰生化工程有限公司；YSQ. SGH. 280型手提式压力蒸汽灭菌锅：上海华线医用核子仪器有限公司；SW-CJ-1F 型单人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；自制有机玻璃皿；烧杯；纱布；滤纸；玻璃棒；涂布棒；接种环；酒精灯；玻璃试管；玻璃培养皿；三角瓶

2.2 实验方法

2.2.1NISIN效价的测定

混合培养法：首先配制浓度为250IU/ml、500IU/ml、1000IU/ml、2000IU/ml、4000IU/ml的nisin溶液备用，然后分别取溶液1mL分别注入无菌培养皿中与倒入的9 mL培养基混合均匀，得nisin浓度分别为25IU/ml、50IU/ml、100IU/ml、200IU/ml、400IU/ml的培养基；等其凝固后，将菌悬液均匀涂抹于培养基表面。

河南科技大学本科生毕业论文

适温适时培养，观察结果，以完全没有菌生长的最低浓度为nisin的最低抑菌浓度(MIC)，并且用无菌水与培养基混合做对照。

2.2.2丁香精油最低抑菌浓度(MIC)的测定

不同浓度(V/V) 挥发油的制备[17]，取丁香精油2ml，加1ml吐温-80 溶解，加无菌水至10 ml，得浓度为2ml/10ml，再用无菌水稀释，得浓度分别为15%，10%，5%，2.5%，1.25%备用。然后将各稀释液1mL分别注入无菌培养皿中与倒入的9 mL 培养基混合均匀，得浓度分别为1.5%，1.0%，0.25%，0.5%，0.25%，0.125%；等其凝固后，将菌悬液均匀涂抹于培养基表面。适温适时培养，观察结果，以完全没有菌生长的最低浓度为丁香油的最低抑菌浓度(MIC)。同时用无菌水和10%吐温-80作对照。

2.2.3纳他霉素最低抑菌浓度(MIC)的测定

将各种供试菌种用无菌生理盐水制成1011 ~1012 cfu/ L 均匀的菌(孢子)悬液。纳他霉素用蒸馏水制备成不同浓度的悬浮液后分别与细菌和霉菌培养基混合，形成浓度梯度平板，将菌种接种其上，霉菌和酵母放于28℃的培养箱中培养，细菌放在37℃的培养箱中培养，观察结果，并设立空白对照组。

2.3 结果与分析

2.3.1 NISIN效价

表2-1 Nisin对不同菌种效价

Tab. 2-1 The minimal inhibiting concentration of the Nisin

浓度(IU/ml)

供试菌种Pathogenic fungi

枯草芽孢杆菌

大肠杆

菌

金黄色葡萄球

菌

沙门氏菌

粘红酵母菌

黑曲霉绿色木霉

400 –+++ –+++ +++ +++ +++ 200 –+++ –+++ +++ +++ +++ 100 + +++ + +++ +++ +++ +++ 50 ++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ 25 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ CK1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 注：以上数据均为3 次试验重复。“CK1”为无菌水，“-” 表示无菌生长，“+” 表示菌体生长弱，“+ + ”表示菌体生长较强，“+ + +”表示生长很强。

第2章三种天然抑菌剂最小抑菌浓度的测定

Nisin主要抑制大部分革兰氏阳性菌,特别是细菌的芽孢。Nisin能抑制葡萄球菌属、链球菌属、小球菌属和乳杆菌属的某些菌种;抑制大部分梭菌属和芽孢杆菌属的芽孢[19]。例如能有效抑制肉毒梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等引起的食品腐败。从表2-1可以看出，不同浓度的nisin对大肠杆菌，沙门氏菌，粘红酵母菌，黑曲霉，绿色木霉没有抑菌效果；而一定浓度的Nisin对枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌有一定的抑菌效果；Nisin对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为200IU/ml。

早期的研究认为,Nisin一般对霉菌、酵母菌和革兰氏阴性菌是无效的,但近期的研究表明,在一定条件下(如冷冻、加热、降低ph和EDTA处理)。一些革兰氏阴性菌(如沙门氏菌、大肠杆菌、假单胞菌等)对Nisin敏感。Nisin对革兰氏阳性菌营养细胞和芽孢有不同的抗菌机理。Nisin对营养细胞的抗菌机理有不同的看法。一种观点认为，Nisin吸取于细胞膜上,可以抑制细胞壁中肽聚糖的生物合成，使细胞膜和磷脂化合物的合成受阻，导致细胞内物质外泄，引起细胞裂解[20]。另一观点认为Nisin的抗菌机理与DHA和DHB密切相关，因为Nisin中的DHA和DHB能够与敏感菌株细胞膜中某些酶的巯基发生作用，释放细胞质，造成敏感细胞裂解。Nisin对芽孢的作用是在其萌发前期及膨胀期破坏其膜，以抑制其发芽过程。

2.3.2丁香精油最低抑菌浓度

表2-2 丁香精油的最低抑菌浓度测定

Tab. 2-2 The minimal inhibiting concentration of the clove oil

浓度(%)

供试菌种Pathogenic fungi

枯草芽孢

杆菌

大肠杆菌c

金黄色葡萄球

菌

沙门氏菌

Salmonel

粘红酵母

菌

黑曲霉

绿色木霉

0.40 －––––––

0.20 –––––––

0.10 –––––––

0.05 ––+ ++ + ––

0.025 + + ++ +++ ++ + +

CK1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ CK2 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 注：以上是各浓度做3次平行实验。“CK1”为无菌水，“CK2 ”为吐温80，“-” 表示无菌生长，“+” 表示菌体生长弱，“+ + ”表示菌体生长较强，“+ + +”表示生长很强。

河南科技大学本科生毕业论文

研究表明，丁香的乙醇提取液对酵母、青霉、黑曲霉、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌有很强的抑菌作用[21]。丁香抑菌效力强、抗菌谱广，可抑制细菌、酵母及霉菌，对食品污染菌有广谱抑菌作用，最低抑菌质量浓度低，特别是抑制真菌作用强，这在植物抑菌材料中是比较少见的。表2-2也表明，在一定的时间和条件下，一定浓度的丁香精油对供试的细菌、酵母和霉菌具有良好的抑制效果。丁香精油对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿色木霉、黑曲霉抑菌效果较好，最低抑菌浓度均为0.05%；对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、粘红酵母菌，的最低抑菌浓度较大，均为0.10%。孙卫青[22]采用平板法测定辣椒、花椒、生姜、大蒜、黑胡椒、丁香油树脂对几种霉菌、细菌、酵母菌的最低抑菌浓度，丁香的抗菌性最强，其次是丁香油树脂抑菌范围较广，pH4．2～8．5，与此相比，苯甲酸钠抗菌活性pH范围就狭窄多了，只有在pH4．5以下效果才较好，其抗菌效力随pH会值升高而减弱。周建新等[23]研究也认为，丁香对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌有较大的杀伤作用。顾仁勇等[24]研究表明在具有抑菌作用的植物材料中，多数是对细菌的抑制力较强而对真菌(酵母及霉菌)的抑制力较差，丁香的突出优点是抑制真菌作用强，这说明丁香精油作为天然食品防腐剂具有独特的优势。

2.3.3纳他霉素最低抑菌浓度

表2-3 纳他霉素最低抑菌浓度

Tab. 2-3 The minimal inhibiting concentration of the natamycin

浓度(ppm)

供试菌种Pathogenic fungi

枯草芽孢杆菌

大肠杆

菌

金黄色葡萄球

菌

沙门氏菌

粘红酵母菌

黑曲霉绿色木霉

50 +++ +++ +++ +++ ﹣﹣﹣

40 +++ +++ +++ +++ ﹣﹣﹣

30 +++ +++ +++ +++ + ﹣+

20 +++ +++ +++ +++ ++ ﹣++ 10 +++ +++ +++ +++ +++ + ++ CK1 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 注：以上数据均为3 次试验重复。“CK1”为无菌水，“-” 表示无菌生长，“+” 表示菌体生长弱，“+ + ”表示菌体生长较强，“+ + +”表示生长很强。

纳他霉素是26种多烯烃大环内酯类抗真菌剂之一，它对所有的霉菌和酵母菌几乎都有极强的抑制力，但对细菌、病毒等其他微生物则无效。这是由于纳他霉素分子的疏水部分即大环内酯的双键部分以范德华力和整个甾醇分子结合，形

第2章三种天然抑菌剂最小抑菌浓度的测定

成抗生素一甾醇复合物，破坏细胞质膜的渗透性；分子的亲水部分即大环内酯的多醇部分则在膜上形成水孔，损伤膜的通透性，从而引起菌内氨基酸、电解质等重要物质渗出而死亡[25]。但细菌细胞膜缺乏甾醇(麦角固醇)类结构，所以纳他霉素对其抑制效果不明显。当最小抑菌浓度MIC>10000 ug／mL时才显示出抑制细菌作用。表2-3也表明纳他霉素对细菌几乎不起作用，但对霉菌和酵母抑制作用非常明显。它对粘红酵母菌和绿色木霉的最小抑菌浓度均为40ppm,对黑曲霉的最小抑菌浓度为20ppm。

第3章复合抗菌膜抑菌性能的研究

3.1实验材料与仪器

3.1.1 材料

乳清浓缩蛋白（WPC-80）(新西兰恒天然乳业公司)、丁香精油（主要成分丁香酚，上海生物化学有限公司）、Nisin（106IU，洛阳市华健生物工程有限公司）、纳他霉素（浙江银象生物工程有限公司）、甘油、氢氧化钠：以上均为分析纯。3.1.1.2 菌种：

细菌：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis；金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus；大肠杆菌Escherichia coli；沙门氏菌Salmonella；

霉菌：黑曲霉Aspergillus niger；绿色木霉Trichoderma viride

酵母：粘红酵母Rhodotorula glutinis

以上菌种均由本院微生物教研室提供

3.1..1.3培养基：

营养肉汤琼脂培养基（北京奥博星生物技术有限公司，批号：20080712）；

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) （北京奥博星生物技术有限公司，批号：20081006）；

麦芽汁琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司，批号：20080912）；

MRS琼脂培养基（北京奥博星生物技术有限公司，批号：20080816）

3.1.2仪器和设备

JJ-1型电动搅拌器：金坛市正基仪器有限公司；202型电热恒温干燥箱：北京市永光明医疗仪器厂；精密电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；HH-S恒温水浴锅：金坛市亿通电子有限公司；笔试酸度计：上海宇隆仪器有限公司；移液枪：上海荣泰生化工程有限公司；YSQ. SGH. 280型手提式压力蒸汽灭菌锅：上海华线医用核子仪器有限公司；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；自制有机玻璃皿；烧杯；纱布；滤纸；玻璃棒；涂布棒；接种环；酒精灯；玻璃试管；打孔器；玻璃培养皿；三角瓶。

3.2实验方法

3.2.1WPC/NISIN复合膜研究

分别配制蛋白质浓度为12%、Nisin含量为200IU/ml、250IU/ml、300IU/ml、350IU/m、400IU/ml 的WPC/Nisin混合溶液，搅拌15min使其充分溶解，将溶液的pH值调节到8，放入一定温度的水浴锅中加热一段时间，冷却后加5%的甘油搅拌均匀，超声波除去气泡，吸取5mL的成膜液倒入有机玻璃皿(直径80mm)中，在60℃的干燥箱中干燥3h成膜，待测。

3.2.2WPC/丁香精油复合膜研究

配制蛋白质浓度为12%的WPC溶液，搅拌15min使其充分溶解，用1mol/LNaOH溶液将溶液的pH值调节到8，放入一定温度的水浴锅中加热一段时间，同时用甘油将丁香精油稀释成为30%，20%，10%，5%，2.5%的混合溶液，待WPC溶液冷却后分别加5%的不同浓度甘油/丁香精油混合液，并高速分散均质机10000 rpm下搅拌1min，超声波除去气泡，吸取5 mL的成膜液倒入有机玻璃皿(直径80mm)中，在60℃的干燥箱中干燥3h成膜，待测。

3.2.3 WPC/纳他霉素复合膜研究

分别配制蛋白质浓度为12%、纳他霉素含量分别为20ppm、30ppm、40ppm、50ppm、60ppm 的WPC/纳他霉素混合溶液，搅拌15min使其充分溶解，将溶液的pH值调节到8，放入一定温度的水浴锅中加热一段时间，超声波除去气泡，吸取5mL的成膜液倒入有机玻璃皿(直径80mm)中，在60℃的干燥箱中干燥3h成膜，待测。

3.2.4WPC/丁香精油、NISIN、纳他霉素复合膜研究

分别配制乳清蛋白含量为12%，Nisin含量为分别为300IU/ml、350IU/ml、400IU/ml，纳他霉素含量分别为40ppm、50ppm、60ppm的溶液，搅拌15min使其充分溶解，将溶液调节到pH为8，放入一定温度的水浴锅中加热一段时间，同时用甘油将丁香精油稀释成为30%、20%、10%的混合溶液，待WPC溶液冷却后加5%的甘油/丁香精油混合液，按三因素三水平做九个试验点。最后用蒸馏水配制并在高速分散均质机10000 rpm下搅拌1min，超声波除去气泡，吸取5mL的成膜液倒入有机玻璃皿(直径80mm)中，在60℃的干燥箱中干燥3h成膜，待测。