电化学发光免疫检测技术研究进展_张军瑞(1)
D O I :10.3724/S P .J .1096.2010.01219
电化学发光免疫检测技术研究进展
张军瑞
1,2 陈健＊1 刘仲明21(华南理工大学轻工与食品学院,广州510640) 2(广州军区广州总医院医学实验科,广州510010)
摘 要 本文介绍了电化学发光的发展状况和最新研究方向,综述了近年来电化学发光免疫检测技术的应
用和研究进展,并展望了电化学发光免疫检测技术的发展前景。
关键词 电化学发光免疫检测;抗原;抗体;综述
2009-12-17收稿;2010-03-12接受
本文系国家科技支撑计划(N o .2006B A D 27B 04)资助
＊E -m a i l :f e j c h e n @s c u t .e d u .c n 1 引 言
免疫检测法具有快速、灵敏、选择性好等特点,被广泛应用于临床诊断、法医学、药物学和环境科学等领域[1～6]。近年来,随着对免疫传感器的深入研究,发展了多种检测技术,包括电化学、光学、压电检测、放
射免疫分析法和电化学发光检测法等[7～12]。其中较常用的放射免疫分析法涉及环境污染问题,酶免疫分
析法受到酶保存和检测灵敏度的限制;时间分辨荧光免疫法有光的散射和杂光的干扰等问题,限制了其在免疫方面的应用。电化学发光是一种由于电化学反应引起的化学发光现象。1960年,研究者初次详细报道了红荧烯和类缘化合物电化学发光[13～15],近年来也发表了多篇关于电化学发光的综述[16～25]。电化学
发光因检测范围宽、灵敏度高、信号干扰低、操作简单等优点已在免疫检测领域得到广泛应用[26～30]
。2 电化学发光免疫检测的研究
2.1 鲁米诺及其衍生物做标记
2.1.1 鲁米诺及其衍生物电化学发光的研究 鲁米诺在一定条件下可被一些氧化剂氧化,发生化学发光反应,辐射出最大发射波长为425n m 的化学发光。鲁米诺的衍生物主要有异鲁米诺、4-氨基已基-N -乙基异鲁米诺、N -(4-氨基已基)-N -乙基异鲁米诺(A H E I )和N -(4-氨基丁基)-N -乙基异鲁米诺(A B E I )等。虽然目前对于鲁米诺电化学发光反应机理尚未形成统一的认识,但鲁米诺及其衍生物是电化学发光最常用的发光标记物质之一,已得到广泛研究[31]。Y a n g 等[32]研究了A B E I 在+1.0V(A g /A g C l )氧
化电位的碱性溶液中可以发光,加入H 2O 2可以显著增强其化学发光的强度,溶液的p H 值、H 2O 2的浓度和工作电位都对电化学发光的响应度产生影响。在最佳条件下,A B E I 的检测范围为1.3×10
-6～6.5×10-12m o l /L ,在信噪比(S /N )为3时,A B E I 的检出限为2.2×10-12m o l /L 。最近,C h u 等[33]研究
了中性溶液中反应氧对鲁米诺电化学发光强度的影响,结果显示,反应氧无论是溶解于溶液中还是固定在常规的电极表面,都可以显著增强鲁米诺的化学发光信号。
近年来,人们通过各种方法提高电化学发光的检测灵敏度,包括使用新的或多种标记物[34,35]、探索
新的电极材料[36～39]。D o n g 等[38]的研究结果表明,在中性溶液中,鲁米诺在纳米金修饰的电极上可以
产生强烈的化学发光。发光强度不仅和纳米金有关,还受电极的影响,金电极和玻璃碳电极是比较好的电极,而且纳米金修饰的金电极和玻璃碳电极还具有良好的稳定性和重复性,并且不需要对电极做预处理。电化学发光强度还受纳米金颗粒大小的影响,用直径为16n m 的纳米金修饰电极可以产生较强烈的电化学发光。W a n g 等[39]用银纳米修饰金电极,将其作为工作电极,研究了鲁米诺在中性和碱性溶液中的电化学发光,结果表明,无论在中性还是碱性溶液中,鲁米诺在银纳米修饰的金电极上都可以产生很强烈的发光,并且重复性良好。
2.1.2 鲁米诺及其衍生物做标记的电化学发光免疫检测 早期,T a n a k a 等
[40]依据结合的抗原可以抑
第38卷2010年8月 分析化学(F E N X I H U A X U E ) 评述与进展C h i n e s e J o u r n a l o f A n a l y t i c a l C h e m i s t r y 第8期1219～1226
制鲁米诺电化学发光的原理建立了一种电化学发光免疫分析方法检测人免疫球蛋白(h I g G )。首先将鲁米诺标记在抗体上,当加入抗原时,抗原与抗体结合,抑制其化学发光,加入的抗原的浓度和电化学发光强度减弱的程度相一致,据此可以得知加入抗原的量。此方法的检测范围是10-12～10-8g /m L 。但该方法的免疫反应达到平衡的时间较长(数小时)。此后他们又改进了方法,即优化免疫反应的条件,利用同样的原理检测了血清中的肿瘤标志物甲胎蛋白(A F P )[41],检出限为10
-8g /L ,抗原-抗体的结合时间缩短到5m i n 。由于标记后的鲁米诺其发光效率明显降低,研究者对适用于作标记的鲁米诺衍生物进行了研究。庄惠生等[42]用自制的异硫氰酸异鲁米诺(I T C I )标记A F P 抗体,包被板上进行双抗夹心免疫反应,形成免疫复合物,在电化学发光反应介质K O H -K C l -H 2O 2中检测发光信号,测定A
F P 的线性范围为5.0～100.0μg /L ,检出限为2.0μg /L ,相对标准偏差为6.2%。此方法与放射免疫法相比,相关性良好。A B E I 是异鲁米诺的一种衍生物,是比较好的电化学发光标记物。A r a i l 等[43]报道了检测h I g
G 的灵敏方法,以A B E I 标记h I g G 抗体,h I g G 和A B E I -h I g G 抗体进行免疫反应形成刚硬结构,可以显著增强电化学发光的强度。在此基础上可以检测加入的h I g G 的浓度,检出限为8.0n g /L (S /N=2),这种检测方法的灵敏度和准确性远超过了当时常规的检测方法。Q i 等[44]用A B E I 标记人免疫球蛋白,固定在
纳米金修饰的石墨电极上,然后加入抗原,因加入的抗原与其可以形成A B E I 的刚性结构,可以显著增强电化学发光的强度,加入的抗原的浓度与化学发光强度的增加一致,其检测线性范围为3.0×10
-11～1.0×10-9g /m L ,检出限为1×10-18g /L (S /N=3)。此研究结果表明,以纳米金修饰电极的均质免疫检
测是提高标记物和免疫检测灵敏度的有效方法。2009年,T i a n 等[45]也以纳米金修饰金电极,A B E I 标记
人免疫球蛋白的第二代抗体,将羊抗人免疫球蛋白固定在纳米金修饰的电极上,先加入人免疫球蛋白进行免疫反应,再加入用A B E I 标记的第二代抗体,在金电极上形成夹心式免疫复合物,电解池中加入含有H 2O 2的碳酸盐缓冲液进行检测,其检测线性范围为5.
0～100μg /L ,检出限1.68×10-6g /L (S /N=3),相对标准偏差在为3.79%(60μg /L ,n =9)。此方法简单并且灵敏度高,已成功应用于血清中h I g G 的检测。尽管此方法的检测灵敏度低于同样条件下均质的免疫检测方法[43,44],但目前均质的免疫检测方法在临床上的应用还易受到其它物质的干扰,而此方法可以通过简单的清洗电极将干扰物质除去,同时以纳米金修饰的电极作为固相载体,显著提高了检测灵敏度,因此它可以成功应用于实际血清样品中人免疫球蛋白的检测。
2.2 联吡啶钌及其衍生物做标记
2.2.1 联吡啶钌电化学发光的研究 1966年,H e r c u l e s 等
[46]最早发现联吡啶钌(R u (b p y )2+3)的化学发光现象,在R u (b p y )2+
3溶液中加入胺,观察到橘红色的发光。T o k e l 等[47]首次用电化学方法使R u (b p y )2+
3转为激发态,并观察到R u (b p y )2+3的电化学发光现象。这些开创性的工作为R u (b p y )2+3电化学分析在分析科学中的应用奠定了基础。R u (b p y )2+3及其衍生物是电化学发光应用最
为广泛的发光物质,由于它具有灵敏度高、稳定性好、发光效率高等特点,所以被广泛用于实际生物样品的分析检测[48,49]。目前,最常用的电化学发光体系为R u (b p y )2+3
/T P r A ,其反应机理如下:R u (b p y )2+3-e -※R u (b p y )3
3+T P r A -e -※T P r A
+·T P r A +·※T P r A ·
+H +T P r A ·+R u (b p y )33+※[R u (b p y )2+3]
+T p r A 氧化产物[R u (b p y )2+3]＊
※R u (b p y )2+3+h v 近年来,人们对R u (b p y )2+3
/T P r A 体系进行了深入的研究,C h e n 等[50]研究了T P r A +·在经过电化学预处理的玻璃碳电极表面存在时间的长短对电化学发光强度的影响,当电极上的氧化物促使T P r A
+·失去质子生成自由基T P r A ·时,会极大地抑制电化学发光的强度。他们认为当T p r A 在电极上较快的被氧化时,其氧化产物T P r A +·会更多的停留在电极表面,而T P r A +·失去质子的产物T P r A ·易于被电极破
坏掉,从而使其不能参与电化学发光的反应,导致电化学发光强度降低。最近,J i a n g 等
[51]在R u (b p y )2+
3/T p r A 体系的电解质溶液中加入嘧啶或其类似物(如喹啉)。研究表明,加入嘧啶或其类似
1220 分析化学第38卷
物可以增强发光强度,主要原因是嘧啶或其类似物可以吸附在金属电极表面,抑制电极表面被氧化。以铂电极为工作电极,电解质溶液中加入嘧啶时,其电化学发光强度至少提高了5倍;以金电极为工作电极时,可以在低电位下产生电化学发光,并且其发光强度也明显增加。尽管R u (b p y )2+3
/T P r A 共反应体系得到广泛应用,但使用T P r A 有一定的缺点[20,52～54],如有毒、易挥发、氧化速度慢,并且R u (b p y )2+3/T P r A 的电化学发光强度在很大程度上依赖于电极的材料。因此,人们在研究能替代T P r A 的物质。L i u
等[55]研究了R u (b p y )2+3/D B A E (2-(二正丁氨基)乙醇的电化学发光,结果表明,R u (b p y )2+3
/D B A E 体系具有明显的优越性,它可以弥补R u (b p y )2+3
/T p r A 体系存在的不足,在免疫检测中D B A E 具有广泛的应用前景。X u e 等
[56]用R u (b p y )2+3/D B A E 体系检测了多巴胺,其检测线性范围为5×10-10～7×10-7m o l /L ,检出限4.0×10-11m o l /L 。Y i n 等
[57]将三级胺(如三乙烯四胺:T E T A ;N ,N ,N ′,N ′-四甲基-1,4-丁二胺)作为R u (b p y )2+3的共反应物,研究了影响其电化学发光的因素,并得到了与传统的电化学发光不同的结论,对于R u (b p y )2+3/T
p r A 体系,由于T p r A 溶解度较低,需在电解质溶液中加入离子液体或表面活性剂,并用硫醇修饰电极,以提高其电化学发光的灵敏度,而对三级胺,其分子结构影响电化学发光的灵敏度,如六次甲基四胺(H M T A )的分子结构会抑制自由基的形成,使其发光效率较低,而含有羟基和羧基的共反应物可以通过改变N 的去质子化和自由基的稳定性影响电化学发光效率,这些结论可以很好地促进研究者寻找一种高效、稳定、安全、大众化的R u (b p y )2+3共反应物。Y
i n 等[58]分别以3种氨基乙酸、乙二胺四乙酸(E D T A )、氮三乙酸(N T A )和羟乙基乙二胺三乙酸(H E D T A )作为R u (b p y )2+3
的共反应物,研究其电化学发光,此3种共反应物对钌的检出限分别为1,60和680f m o l /L 。在最佳条件下N T A 激发钌的电化学发光效率显著高于T P A ,并且与T P A 相比,N T A 毒性小、腐蚀性低、不易挥发,可以得到广泛地应用。C h e n 等[59]研究电极表面的疏水性对R u (b p y )2+3
/三乙胺体系电化学发光的影响,结果表明,电极表面的疏水基团越多,R u (b p y )2+3的共反应物越易被氧化,并且在大多数情
况下,电化学发光强度越高,然而疏水环境会促使胺正离子失去质子,导致电化学发光效率降低。此研究对于建立高效的电化学发光免疫检测体系具有重要意义。
2.2.2 R u (b p y )2+3
衍生物作标记的电化学发光免疫检测 目前,钌衍生物中最常用的电化学发光标记物是R u (b p y )2+3,因为它的电化学发光可在溶液中与适当的共反应物反应而产生,发射强度高且相当稳定,成为当前的研究热点。在早期,X u 等[60]用R u (b p y )2+
3标记前列腺特异性抗原(P S A )进行电化学发光。研究表明:发光强度和P S A 的浓度成正比,而与其质量和大小成反比。当加入P S A 抗体与其免疫反应后,由于形成的免疫复合物使其质量和大小增加,发光强度降低,据此可以得到不同类型的P S A 抗原与抗体的结合力,然后由结合力的大小可对抗原进行筛选。M i a o 等[29]将金电极表面自组装成单分
子层作为载体,生物素化的抗体固定在其表面,加入C -反应蛋白抗原,再加入用R u (b p y )2+3
标记的C -反应蛋白抗体,形成夹心式免疫复合物,组装好的金电极作为工作电极,可直接适用于未知C -反应蛋白样品的测定,其线性范围为1～24m g /L 。云雯等
[61]将兔抗人I g G 固定在金电极上,加入h I g G 和用R u (b p y )2+
3标记的羊抗人免疫球蛋白抗体反应2h ,在自制的石英皿检测池进行检测,其检测线性范围
是0.05～2m g /L ,检出限为20μg /L (3σ)。此方法操作简单、耗时少、固定效率高、易于控制,不但能用于人I g G 的检测,还能应用于其它抗原抗体的免疫检测。
纳米材料以其独特的性质为开发新型的电化学发光生物传感器提供了一种新思路。由于碳纳米管是与适当的生物分子、酶、氧化还原媒介物结合,可提高其选择性和灵敏度,在生物传感器的应用研究中得到人们的重视。W o h l s t a d t e r 等[62]用自制的含碳纳米管作为工作电极,他们将生物素化的甲胎蛋白抗体固定在自制的含碳纳米管片状物表面,加入甲胎蛋白和标记有发光物质的甲胎蛋白抗体,进行免疫反应,形成免疫复合物,此方法检测A F P 的线性范围为0.1～100n m o l /L 。该研究为定量检测系列生物相关分析物提供了一个完整的分析体系,可用于基本研究、药物分析、大样本的检测及医学诊断等。
磁微球因其独特的性质也在电化学发光免疫检测中得到了广泛的应用。如有较大的表面积,可以固定较高浓度的抗体、易于分离等。早期,N a m b a 等[63]用磁微球作为固相载体检测了血清中的肿瘤标志物A F P ,首先将抗体固定在磁微球上面,加入A F P 和标记有发光物质的A F P 抗体,形成免疫复合体,1221第8期张军瑞等:电化学发光免疫检测技术研究进展
在电解池中由于磁力的作用使磁微球吸附到工作电极表面进行电化学发光,A F P 的浓度和电化学发光强度成比例。当免疫反应15m i n 后,检测A F P 的灵敏度可达到5n g /L 。此方法简单、快速、灵敏度高。
Y u 等[64]也使用磁微球作为固相载体进行电化学发光免疫检测生物标志物,进一步证明了使用磁微球进行检测不仅速度快,而且灵敏度高,可以在相关领域得到广泛地应用。这些研究采用带有磁性的聚苯乙烯微粒技术,构建了免疫反应在类似液相的均匀悬浮状态进行的方法和技术,不仅反应速度快,并且实现了游离和结合标记物的分离。
M i a o 等[65]将R u (b p y )2+3的衍生物包被在聚苯乙烯微球体内部,C
-反应蛋白抗体分别固定在磁微球和聚苯乙烯微球体表面,加入C -反应蛋白,形成磁微球-抗体[抗原]抗体-聚苯乙烯微球体复合物。在检测池中由于磁力的作用使磁微球吸附在工作电极上,加入含有T P A 的缓冲液进行电化学发光,线性范围宽(10.0～10000μg /L )。此方法的检出限低于当时常规检测C -反应蛋白的自动化仪器,但由于将发光物质包被在聚苯乙烯微球体内部,在检测液中需加入有毒性的有机溶剂,使聚苯乙烯微球体溶解,将发光物质释放出来,使其在实际应用中受到限制。Y a n 等[66]将磁铁固定在工作电极上,磁微球作为免疫复合物的载体吸附在工作电极表面,检测血清中P 53抗体,检测的线性范围0.01～1000μg /L ,每次定量检测只需要50μL 的样品,免疫反应时间为30m i n ,简单,快速,灵敏度高,并且可重复利用。但此方法在临床应用中还受到限制,因它不能对血清中的其它物质进行检测。H o r n i n g e r 等[67]也用磁微球作为固相载体,对血清中的T N F α抗体进行了检测,此方法准确,精密,可重复,可以作为物质药代动力学的研究,它也为检测复合基质中的生物大分子提供了一种新方法。
2007年,Z h a n 等[30]提出一种新的电化学发光免疫分析方法,检测人血清中的C -反应蛋白。将发
光物质R u (b p y )2+3注入脂质体内部,合成包被有发光物质的脂质体,C
-反应蛋白抗体分别结合在磁微球和包被有发光物质的脂质体表面,然后将C -反应蛋白、磁微球、脂质体混合,进行免疫反应,形成磁微球-抗体[抗原]抗体-脂质体免疫复合物,将复合物溶解于含有三丙胺、N a C l 和T r i t o n X -100的缓冲溶液中,然后在电化学发光检测池进行检测,其检测线性范围0.1～10m g /L 。此方法与文献[65]相比不需要有毒的有机溶剂使发光物质释放出来,但其检测灵敏度还有待提高。2008年,F a n g 等[68]提出一个新的免疫模
式对蛋白进行定量检测。他们将玻璃碳电极亲和素化,蛋白用R u (b p y )2+3标记并生物素化,通过亲和素和
生物素的相互作用,将R u (b p y )2+3标记的蛋白固定在玻璃碳电极上,组装好的玻璃碳电极作为工作电极,在电解池中加入含有三丙胺的缓冲溶液进行电化学发光,检测牛血清蛋白的线性范围是0.015～
7.5μm o l /L 。为了进一步验证此方法的有效性和其适合蛋白的定量检测,他们又对溶菌酶进行了检测,其线性范围为0.001～0.1g /L ,检出限为0.1m g /L 。此方法将玻璃碳电极亲和素化,既有利于固定生物活性材料,又应用了生物素亲和素的放大技术,方法简单易行,可节约成本,有待进一步的发展。
2.3 其他金属鳌合物做标记
2.3.1 其他金属鳌合物电化学发光的研究 其它金属鳌合物,如T b ,E u ,C r ,R e 等,都可以产生电化学
发光,近年来已有很多人对它们的电化学发光进行研究。2005年,H a k a n s s o n 等[69]通过阴极脉冲极化
研究了T b (Ⅲ)鳌合物在M g O 电极和n -Z n O ∶A l /M g O 复合电极上的电化学发光。由于T b (Ⅲ)鳌合物在电极上相对长的发光周期,可以用时间分辨电化学发光仪器对其进行检测,结果表明,M g O 电极和n -Z n O ∶A l /M g O 复合电极都可以作为T b (Ⅲ)鳌合物发光的一次性工作电极。E u (Ⅲ)与适当的配位基螯合,可以检测到长时间的发光信号[70]。早期,R i c h t e r 等[71]已经对E u (Ⅲ)作标记物的电化学发光进行了研究,其方法的主要缺点是不能用于纯水体系中,并且即使在无水溶液中也产生很少的光子。2006年,J i a n g 等[72]又研究了E u (Ⅲ)鳌合物在水溶液中由于热电子激发引起的时间分辨电化学发光,当E u (Ⅲ)和2,6-N ,N -二-(羧甲基)氨甲基-4-苯甲酰苯酚螯合,形成的螯合物可以产生电化学发光,但它在
A l 2O 3电极上的电化学发光强度比较弱。当加入S 2O 2-3
时可以极大增强其电化学发光强度;加入1m m o l /L S 2O 2-3时,电化学发光周期为0.
94m s 。此螯合物可以作为电化学发光免疫检测的标记物,而与2,6-N ,N -二-(羧甲基)氨甲基-4-甲基苯酚螯合,形成的螯合物不会发光。L i s 等[73]将E u (Ⅲ)和其它物质结合,研究发现当E u (Ⅲ)与四丁胺阳离子螯合,形成的螯合物可以产生最强烈的发光信号。在螯合物溶液中加入邻二氮杂菲,发光强度和周期都明显增加。S t a n i n s k i 等[74]以A l 2O 3为工作电极研究了1222 分析化学第38卷
T b 3+,D y 3+,E u 3+鳌合物在水溶液中的电化学发光。研究表明,这些鳌合物产生的电子辐射主要是通过它们的配位基向金属电极的能量转移产生。
2.3.2 其它金属鳌合物作标记的电化学发光免疫检测 H e l i n 等[75]利用合成的T b (Ⅲ)-2,6-b i s [N ,N -b i s (c a r b o x y m e t h y l )a m i n o m e t h y l ]-4-b e n z o y l p h e n o l )螯合物标记人促甲状腺激素的第二代抗体,通过热氧化作用将硅片表面形成一层绝缘薄膜,其上依次加入抗体、抗原和标记有发光物质的第二代抗体进行免疫反应,用此硅片作为工作电极,在时间分辨电化学发光基础上检测其发光信号。电化学发光强度在很大范围内和促甲状腺激素成线性关系,但检出极限还有待降低。A l a -K l e m e 等[76]等也利用热氧化作用形成的硅电极作为一次性的工作电极,用自合成的T b (Ⅲ)-1的异硫氢酸衍生物T b (Ⅲ)-1-N C S 标记C -反应蛋白抗体,在硅电极上进行的双抗夹心免疫反应,电解池中加入含有0.1%N a N 3的0.
2m o l /L 硼酸(p H=7.8,H 2S O 4调节其p
H 值)检测液进行电化学发光检测,得到的检出限(0.3μg /L )优于商业上的检测系统。K u l m a l a [77]和E s k o l a [78]等都将铝电极经过特殊处理,表面被一层氧化薄膜包被,使其作为免疫复合物的固相载体,对人促甲状腺激素(T S H )进行了检测,但由于氧化薄膜包被的铝电极在水溶液中不稳定,其检测的准确性尚有待提高。
2.4 以量子点作发光物质
2.4.1 量子点电化学发光研究 量子点是由少量原子组成的准零级的纳米材料。1962年,N a k a m u r a 等[79]针对金属超微颗粒费米面附件电子能级状态分布提出了著名的K u b o 理论。1983年,J a i n 等[80]在市售半导体微晶掺杂的光学滤波玻璃上观察到了很高的3次非线性光学效应和快速的光响应。这一成果在光运算、全光开关和光通信等方面具有广阔的应用前景,使得量子点的研究工作引起了广泛关注。研究发现,半导体量子点具有独特的物理和化学性质,在磁学,电学,催化和化学传感等方面具有广阔的应用前景[81]。D i n g 等[82]研究发现半导体纳米晶体可以在一定的电位下被氧化和还原,并且通过一定的湮灭反应可导致相应的电化学发光过程。将电化学发光技术和新兴的纳米技术结合起来,为量子点在分析科学和生命科学中的应用开辟了一条新的途径。目前,人们找到一种高效的方法,即用适宜的配位体或受体化学修饰量子点表面,形成一种新型的纳米材料,使其作为一种光传感器检测特殊的敏感性物质。
H a n 等[83]将三聚氰胺氰尿酸盐覆盖在碲化镉半导体纳米晶体的顶端,用它作为一种新型的量子点,
通过电化学发光检测水溶液中的H 2O 2,该传感器的电化学发光强度与过氧化氢的线性响应范围为0.2～10μm o l /L ,检出限是0.06μm o l /L 。J i e 等
[84]已经证明了硫化镉纳米管的电化学发光;S h e n 等[85]也报道了硫化锌半导体纳米晶体和共反应物S 2O 2-
8在碱性水溶液中的电化学发光。L u 等[86]用聚酰胺-胺保护硫化镉半导体纳米晶体,与S 2O 2-8反应,可以产生强烈的电化学发光信号,并且通过改变电压脉冲的持续时
间和将扫描率提高,可以调整电化学发光的强度和稳定性。研究已经证明硫化镉量子点/碳纳米管(C N T s )混合物是电化学发光检测的一个重要前景,D i n g 等
[87]已对此混合物的电化学发光作了报道。2.4.2 量子点电化学发光免疫检测 J i e 等[88]将硒化镉量子点(C d S e Q D s )/纳米管-壳聚糖/硫酸铵(A P S )结合起来,研制了一种新型的电化学发光免疫传感器检测h I g G 。由于此体系有反应性胺基产生,所以它可以作为一种有效的交联剂连接生物大分子,如可以固定抗体。研究结果显示,当加入K 2S 2O 8作为共反应物时,它可以极大增强电化学发光信号,A P S 催化C d S e 量子点和K 2S 2O 8反应机理如下:
C d S e N C s+n e
-n C d S e -·S 2O 2-8+R C 3H 7N H 2
S O 2-4+S O 4-·+R C 3H 7N H 2+·C d S e -·+S O 4-·
C d S e ＊+S O 2-4
C d S e ＊C d S e+h v
此方法检测结果和酶联免疫分析检测的结果有很大的相关性。随后他们将C d S e Q D s /纳米金/前白蛋白抗体结合起来,提出一个无标记的电化学发光免疫传感器检测人前清蛋白
[89],此传感器通过免疫复合物定量抑制C d S e Q D s 和S 2O 2-8反应,检出限达到μg /L 量级。J i e 等[90]又将巯代乙酸修饰的C d S e -Q D s /纳米金/脂蛋白抗体结合,对低浓度的脂蛋白进行检测,因脂蛋白和脂蛋白抗体特异性结合可以使发光强度降低,据此检测脂蛋白的浓度,检出限是0.006μg /L 。由于量子点的发光强度低于常规的化1223第8期
张军瑞等:电化学发光免疫检测技术研究进展
学试剂,如:鲁米诺、R u (b p y )2+3。最近,J i e 等[91]将金电极/C d S e Q D s -碳纳米管/P D D A /纳米金/h l g G 抗
体结合起来对h l g G 进行检测,线性范围0.002～500n g /L ,检出限达到0.6μg /L ,显示了很高的灵敏度。综上所述,以量子点为基础的无标记的电化学发光免疫检测目前还处于初期阶段,但量子点独特的性质使其在免疫检测领域具有广泛的应用前景,有待深入研究。
3 展 望
电化学发光免疫分析具有灵敏度高、特异性强、适用面广等优点,广泛用于抗原、抗体和半抗原的免疫检测。又因其线性范围较宽,符合临床检验的需要,日益受到人们的青睐。电化学发光免疫分析技术为临床诊断和科学研究提供了一种超微量的非同位素免疫检测手段,在医学、食品、环境分析等方面具有广阔的应用前景。目前,电化学发光免疫分析已取得了一些成就,也存在一些问题,例如,将R u 2+
配合物作为电化学发光探针标记在抗体(抗原)上;在某些体系中,这种模式不仅对探针的电化学发光性能有一定的影响,而且还影响抗原抗体的特异性结合。所以,研究者在如何提高免疫诊断的敏感性和特异性,发展新的分析技术等方面仍在不断探索。电化学发光免疫分析技术的发展趋势在于合成新的发光标记物以及建立新的免疫分析方法等,值得提及的是以纳米材料为基础的电化学发光免疫检测技术
特别引人关注,将R u (b p y )2+3固定在碳纳米管、纳米粒、聚合薄膜上的化学和电化学发光特性,以量子
点为主体的无标记的电化学发光免疫检测技术,使其在生物医学上的具有广阔的应用前景。近年来,新的材料,如无机金属络合物薄膜、有机分子、纳米材料修饰的电极等,也将推动电化学发光进一步的发展。人们通过各种方法使电化学可视化,如扫描电化学显微镜。另一方面,人们通过酶促反应提高电化学发光检测的速度。化学发光免疫检测与微流技术的结合将会产生一种超高灵敏度的电化学发光检检方法,这些研究使电化学发光免疫检测技术在生物医学和环境科学的应用呈现美好的前景。
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