RNaseA takara
TAKARA 实验室常规试剂配制方法
031*-2./4,+ 5 8679giaifi [`eg]\_debe^h \ZgZbe^ edb`d]:mwwtYOOyyyNwioiuiNjsqNjr .1/{30,z +|2}-4*~ Q c gunvM_\p Jt_WNTL WNVL XNPK : I JRNS7GDO :H :8b~:;:8:M JRNS QK :H 4^R U ;8t 3L A99 POg /} T8Yclw\1yU <8[?`~t 3-C9ix ;AD gQG O U =8u 1E j 2P :HU >8m >m B,{qY 7>]dU SF Z I61E |0P7>q N ijQG O Y H 酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶 酶切反应 来源：easylabs 发布时间：2009-11-08 查看次数：12704 本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，A flIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，Eco RI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，Pa cI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI， 为什么要添加保护碱基？ 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。 其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。 该如何添加保护碱基？ 添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。 添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 单实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A 260 位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C 条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), , 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。 10 mM MgCl 2 20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切 11月13日 引物合成的详解 4.需要什么级别的引物？ 答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。 应用引物长度要求纯度级别要求 一般PCR扩增<45 base OPC 一般PCR扩增>45 base PAGE 诊断PCR扩增< 40base OPC, PAGE DNA测序20base左右OPC 亚克隆，点突变等根据实验要求定OPC, PAGE，HPLC 根据实验要求定PAGE 基因构建（全基因合成） 反义核酸根据实验要求定PAGE PAGE, HPLC 修饰引物根据实验要求定 8.如何计算引物的浓度？ 答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成 10-50pmol/ul。一般情况下，建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。 注意：1 OD260= 33 ug/ml. 9.如何计算引物的Tm值？ 答：引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成、引物使用缓冲的离子强度有关。 长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size 公式中，Size = 引物长度。 11.如何溶解引物？ 答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。 12.如何保存引物？ 答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。 13.合成的引物5’端是否有磷酸化 答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，需要另外收费。 14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？ 连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连 Code No. RR047A 研究用 PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 说明书 目录 内容页码 ●制品说明1 ●制品内容 1 ●试剂盒外必备材料 1 ●保存 1 ●特长 2 ●使用注意 2 ●操作方法 2 ●Real Time PCR 4 ●实验例 6 ●附录7 ●关联产品8 ●制品说明 为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但Total RNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。在这种情况下，我们常常需要对Total RNA样品进行DNase I处理，以除去残存的基因组DNA。而DNase I处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。 PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser是可以除去基因组DNA进行Real Time RT-PCR反应的专用反转录试剂。Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNA Eraser，通过42℃，2 min即可除去基因组DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNA Eraser处理后的样品可以直接进行15 min的反转录反应合成cDNA，因此，20 min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA 合成的全过程。 使用本制品合成的cDNA适用于SYBR? Green分析法和TaqMan?探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBR?Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）、Premix Ex Taq（Probe qPCR）等定量试剂组合使用。注意：Takara Bio使用SYBR? Green I作为研究试剂已得到Molecular Probes Inc.的许可。SYBR?为Molecular Probes Inc.的注册商标。 ●制品内容（20 μl反应×100次） 1. gDNA Eraser 100 μl 2. 5×gDNA Eraser Buffer*1200 μl 3. PrimeScript RT Enzyme Mix I*2100 μl 4. 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）*3400 μl 5. RT Primer Mix*4 400 μl 6. RNase Free dH2O 1 ml×2 7. EASY Dilution（for Real Time PCR）*5 1 ml *1：5×gDNA Eraser Buffer在反转录反应前使用，请务必进行基因组DNA的除去反应。 *2：含有RNase Inhibitor。 *3：含有dNTP Mixture。 *4：含有Oligo dT Primer和Random 6 mers。 *5：制作标准曲线时梯度稀释DNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或RNA如果用水或TE Buffer稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精 度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定 量的标准曲线。本制品不影响反转录和PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用。EASY Dilution 也可以单独购买（Code No.9160）。 注意：EASY Dilution请与本公司Real Time PCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性本公司尚未进行确认。 ●试剂盒外必备材料 热循环仪（或37℃水浴，42℃水浴和85℃加热块） 反转录反应所用0.2 ml和1.5 ml的微量反应管 微量移液器和枪头（高压灭菌） ●保存：-20℃。 Code No.：DRR019A RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 （100次量） 目录 内 容 页 码 ●制品说明 1 ●制品内容 1 ●保存 2 ●RNA PCR原理 2 ●试剂盒特点 3 ●RNA样品制备 4 ●使用注意 4 ●引物选择 5 ●实验操作 5 ●Q&A9 ●参考文献 9 ●制品说明 PCR（Polymerase Chain Reaction；聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA的简单而有效的方法。虽然原理上PCR法是扩增DNA，RNA不能直接被扩增，但是经过反转录酶的作用把RNA反转录成cDNA 后，PCR法便可应用于RNA的解析了。迄今为止，此方法已广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。 TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0是使用AMV（Avian Myeloblastosis Virus）由来的反转录酶将RNA合成cDNA，然后在同一反应管中使用Hot Start PCR用TaKaRa Ex Taq HS DNA聚合酶扩增此cDNA的RT-PCR试剂盒。本试剂盒含有从RNA到cDNA，然后使用PCR法扩增此cDNA所需的全部试剂。 本试剂盒中的Oligo dT-Adaptor Primer的独特设计，大大地提高了Poly(A )+ RNA 3′端区域的cDNA合成效率。Hot Start PCR用DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS的应用，大大地增加了本试剂盒的扩增性能。 ●制品内容（100次量） 1. AMV Reverse Transcriptase XL（5 U/μl） 50 μl （Avian Myeloblastosis Virus来源） 2. RNase Inhibitor（40 U/μl） 25 μl 3. Random 9 mers（50 pmol/μl） 50 μl 4. Oligo dT-Adaptor Primer（2.5 pmol/μl） 50 μl 5. RNase Free dH2O 1 ml 6. TaKaRa Ex Taq?HS（5 U/μl） 40 μl 7. M13 Primer M4（20 pmol/μl） 50 μl 8. 10×RT Buffer 1 ml [100 mM Tris-HCl（pH8.3），500 mM KCl] 9. 5×PCR Buffer 1 ml 10. dNTP Mixture（各10 mM） 150 μl 11. MgCl2（25 mM） 1 ml 12. Control R-1 Primer（20 pmol/μl） 25 μl （Positive Control RNA下游引物） 13. Control F-1 Primer（20 pmol/μl） 25 μl （Positive Control RNA上游引物） 14. Positive Control RNA（2×105 copies/μl） 25 μl （Transcribed poly(A)+ RNA of pSPTet3 plasmid） 【各种引物序列】 引物名称 各引物序列 Random 9 mers 5′-（P）NNNNNNNNN-3′ Oligo dT-Adaptor Primer 包含dT区域及M13 Primer M4序列。 Control F-1 Primer 5′-CTGCTCGCTTCGCTACTTGGA-3′ Control R-1 Primer 5′-CGGCACCTGTCCTACGAGTTG-3′ M13 Primer M4 5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′ -1- PCR设计引物时酶切位点的保护碱基表 ApaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5'GGGCC^C 3' BamHI（类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^GATCC 3' BglII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^GATCT 3' EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^AATTC 3' HindIII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' A^AGCTT 3' KpnI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GGTAC^C 3' NcoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' C^CATGG 3' NdeI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' CA^TATG 3' NheI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^CTAGC 3' NotI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GC^GGCCGC 3' SacI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GAGCT^C 3' SalI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' G^TCGAC 3' SphI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列：5' GCATG^C 3' TP600型PCR仪使用说明 目 录 一．外观及功能介绍----------------------------------------------------------------------------------------2二．性能一览表----------------------------------------------------------------------------------------------3三．操作方法------------------------------------------------------------------------------------------------3 1．概述------------------------------------------------------------------------------------------------3 2．使用现有程序进行PCR反应-----------------------------------------------------------------4 3．建立新程序---------------------------------------------------------------------------------------7 4．修改现有程序------------------------------------------------------------------------------------9 5．注册新用户---------------------------------------------------------------------------------------9 6．应用扩展模式-----------------------------------------------------------------------------------10 7．工具栏的使用-----------------------------------------------------------------------------------12 操作流程 1. 使用TAE缓冲液或TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。 2. 在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。胶块超过300 mg时，请使用多个Column进行回收，否则严重影响收率。注）切胶时请注意不要将DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。 3. 切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块溶解时间，提高DNA回收率。 4. 称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1 mg=1 μl 进行计算。 5. 向胶块中加入胶块溶解液Buffer GM，Buffer GM的加量如下表： 凝胶浓度Buffer GM使用量 1.0％3个凝胶体积量 1.0％～1.5％4个凝胶体积量 1.5％～ 2.0％5个凝胶体积量 6. 均匀混合后室温15-25℃溶解胶块（胶浓度较大或比较难溶时可以在37℃加热）。此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解（约5～10分钟）。 7. 当凝胶完全溶解后，观察溶胶液的颜色，如果溶胶液颜色由黄色变为橙色或粉色，向上述胶块溶解液中加入3 M醋酸钠溶液（pH5.2）10 μl，均匀混合至溶液恢复黄色。当分离小于400 bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。 8. 将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。 9. 将上述操作步骤7的溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液。注）如将滤液再加入Spin Column中离心一次，可以提高DNA的回收率。 10. 将700 μl 的Buffer WB加入Spin Column中，室温12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液。注）请确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%乙醇。 11. 重复操作步骤10。 12. 将Spin Column安置于Collection Tube上，室温12,000 rpm离心1分钟。 13. 将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30 μl 灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温静置1分钟。注）将灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。 14. 室温12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA。 T4 DNA Polymerase 使 用 说 明 书 TaKaRa Code： D2040 包 装： T4 DNA Polymerase（2～5 U/μl） 50 Units 10×T4 DNA Polymerase Buffer 1 ml 0.1% BSA* 500 μl * BSA在-20℃下易产生沉淀，应尽量避免多次反复冻融。短期 使用请在4℃下保存。产生稍许沉淀不影响反应效果。 保 存： -20℃ ●制品说明 在模板及引物存在的条件下，催化与模板互补的脱氧核苷酸依次选择性地连接在引物的3′-OH末端上的反应。本酶还具有单链DNA特异性的3′→5′外切核酸酶活性，该活性比Klenow Fragment强100～1,000倍，也作用于双链DNA，在dNTP存在条件下表现出聚合酶活性，当dNTP用尽时转为降解DNA 的活性。本酶不含 5′→3′的外切核酸酶活性。 ●酶贮存溶液 KPB 缓冲液（pH6.5） 200 mM DTT 1 mM Glycerol 50 % ●起 源 Escherichia coli carrying the plasmid containing phage T4 DNA polymerase gene。 ●活性定义 以热变性小牛胸腺DNA为模板／引物，在３7℃、pH8.8的条件下，30分钟内使10 nmol全核苷酸掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量定义为1个活性单位（Ｕ）。 ●纯 度 2 U的本酶和1 μg的Closed circular（RFI）pBR322 DNA在37℃下反应16小时，DNA的电泳谱带 不发生变化。 ●用 途 1）利用较强的3′→5′的外切核酸酶活性，通过置换合成（Replacement synthesis）从DNA片段的3’末端进行标记。 2） DNA末端的平滑化。 3） 通过引物伸长法解析mRNA转录的起始点。 ●使用注意 1） 本酶的最适pH为8～9，在pH7.5及pH9.7时活性约为50%。 2） 活性的表达需要Mg2+的存在。为了获得最大活性，还需要SH基的还原剂存在。 3） 整个反应体系中的离子强度超过100 mM时活性将被抑制。 4） 本酶易受模板DNA高级结构的影响，T4 gene 32产物可以显著提高聚合酶活性，而3′→5′的外切核酸酶活性则完全被抑制。 5） 在10×反应缓冲液中直接加入0.1% BSA时会产生大量白色沉淀，因此，在调制反应液时请按下列顺序添加试剂： dH2O→10×反应缓冲液→0.1% BSA→底物DNA。 ●添附Buffer组成（保存：-20℃） 10×T4 DNA Polymerase Buffer Tris-acetate（pH7.9） 330 mM CH3COOK 660 mM (CH3COO)2Mg100 mM DTT 5 mM ●使用例 DNA片段的末端平滑化 1． 在微量离心管内配制下列反应液，全量为9 μl。 突出末端DNA片段 0.1 pmol以上 10×T4 DNA Polymerase Buffer 1 μl 0.1 % BSA 1 μl dNTP Mixture（各2.5 mM） 1 μl dH2O up to 9 μl 2． 为防止DNA末端的“退火”（Annealing），先在70℃进行5分钟保温后，移入37℃的恒温槽中。 3． 加入1～2 U的T4 DNA Polymerase，用取样器轻轻混合（Pipetting），避免用振荡器剧烈搅拌。 4． 在37℃保温5分钟。 5． 用振荡器剧烈搅拌使酶失活（用振荡器搅拌后酶几乎全部失活）。为了避免过剩反应，把反应液置于冰中。进行连接反应时，最好马上进行。如果不立刻进行下一步反应，应进行苯酚／氯仿处理、乙醇沉淀后在-20℃下保存。 V2010.02 各种酶切位点的保护碱基引物设计必看 Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】 各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。 寡核苷酸近末端位点的酶切 (Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1 μg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH , 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。 2.双酶切的问题 参看目录，选择共同的buffer。其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。 有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。 两个酶切位点相邻或没有共同 buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。 3.酶切底物DNA，切不开 1）底物DNA上没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。 2）PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误，致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换buffer。由于PCR产物中带入的其它物质，会影响酶切，据报道，通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。3）酶切条件的确认，包括反应温度和反应体系等。同样的DNA，同样量，用不同的限制酶切情况可能不同，由于DNA的空间结构造成的。同样的DNA，不同的反应体系，酶切效果也可能不同，由于一些空间因素或不可测因素造成的。 Cat. # 3340 For Research Use Chaperone Plasmid Set Product Manual v201405 Table of Contents I. Description (3) II. Components (3) III. Storage (5) IV. Protocol (5) V. FAQs (6) VI. References (8) VII. Related Products (9) Safety Precautions Because the araB promoter and araC gene derived from Salmonella typhimurium are present on the Chaperone Plasmids pG-KJE8, pGro7, pKJE7, and pTf16, please follow all relevant guidelines for experiments using recombinant DNA as indicted by your organization when using this prod-uct. I．Description Large-scale expression of recombinant proteins is essential for structural and func- tional analyses of proteins. A variety of protein expression systems have been devel- oped to produce high levels of protein. Escherichia coli is commonly used as a host for protein expression, since it is a simple system that can be used to express a wide variety of proteins. However, expression of protein in E. coli often results in various problems, such as the formation of inclusion bodies and protease degradation of the protein. These frequently encountered issues often are a result of improper folding of the expressed proteins. Molecular chaperones are involved in protein folding, and numerous studies have been conducted to elucidate the mechanisms of in vivo protein folding. Takara's Chap- erone Plasmid Set consists of five different types of chaperone plasmids developed by HSP Research Institute, Inc. The plasmids are designed to enable efficient expression of multiple molecular chaperones known to work cooperatively in the protein folding process. It has been reported that coexpression of a target protein with one of these chaperone plasmids increases recovery of expressed proteins in the soluble fraction. Such proteins often form inclusion bodies using conventional methods (Figure 1). II．Components 1．Plasmid pG-KJE8 : 10 ng/μl 100 μl 2．Plasmid pGro7 : 10 ng/μl 100 μl 3．Plasmid pKJE7 : 10 ng/μl 100 μl 4．Plasmid pG-Tf2 : 10 ng/μl 100 μl 5．Plasmid pTf16 : 10 ng/μl 100 μl No.Plasmid Chaperone Promoter Inducer Resistant Marker References 1pG-KJE8d n a K-d n a J- grpE araB L-Arabinose Cm2, 3 groES-groEL Pzt-1Tetracycline 2pGro7groES-groEL araB L-Arabinose Cm2 3pKJE7d n a K-d n a J- grpE araB L-Arabinose Cm2 4pG-Tf2groES-groEL- tig Pzt-1Tetracycline Cm3 5pTf16tig araB L-Arabinose Cm3 寡核苷酸近末端位点的酶切 (Cleavage Close to the End of DNA Fragme nts (oligo nu cleotides)) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列 含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用r[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1卩已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反 应2小时和20小时。反应缓冲液含70 mM Tris-HCl （pH , 10 mM MgCI, 5 mM DTT 及适量的NaCI或KCI （视酶的具体要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。 DNA合成，新链的延伸方向是573因此，需要在5端加上酶切位点，因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则 会掉下来.引物的结构就是（573）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列 首先要看目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选（小虾米酶切位点分析）。其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变 DNA合成，新链的延伸方向是5T3因此，需要在5端加上酶切位点，因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform 让它可以结合上去，否则 会掉下来.引物的结构就是（573）:保护碱基+酶切位点+原来的引物序列? 创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* SDS-PAGE 30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide 将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 【保存条件】 4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存 【注意事项】 丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer) 称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 【保存条件】 室温保存。 【注意事项】 对人体有刺激性，请注意适当防护。 创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer) 称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。（1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。） 【保存条件】 室温保存 【注意事项】 应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 10%十二烷基硫酸钠SDS溶液-----10%(w/v)SDS 称取2g高纯度的SDS置于100~200ml烧杯中，加入约16ml的去离子水，68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节PH至7.2，定容至20ml后，室温保存 【保存条件】 室温保存 【注意事项】 对人体有害，请注意防护。 For Genome DNA Analysis Xba I T C T A G A A G A T C T TaKaRa Code：D1093A 包 装 量：1,500 Units 附带试剂： 10×M Buffer 500 μl 0.1% BSA 500 μl 10×Loading Buffer 500 μl 纯 度： 1） Overdigestion Test：≥15 Units 2） Ligation-Recutting Test： Ligation Effi.：100%,Recutting Effi.：100% 3） Genome DNA Digest：≥50 Units 4） pKF3 Cloning Test：＜2% ●酶贮存液： 10 mM Tris-HCl, pH7.5 50 mM KCl 0.1 mM EDTA 1 mM DTT 0.01 % BSA 50 % Glycerol ●起 源：Xanthomonas badrii ●一般反应体系： Xba I 1 μl 10×M Buffer 2 μl 0.1% BSA 2 μl DNA ≤1 μg 灭菌水 up to 20 μl ●反应温度：37℃ ●反应时间： 在上述20 μl的反应体系中，37℃反应5分钟可以完全切断dam非甲基化DNA，满足各种实验需求。针对特殊酶切底物DNA，如果得不到良好的酶切效果时，可以将反应时间延长至1小时。 ●活性确认： 在50 μl反应液中，37℃温度下反应1小时，将1 μg的dam非甲基化DNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 ●纯度检测： 1） Overdigestion Test：在1 μg DNA中加入过量的该限制酶，进行长时间（24小时）酶切反应，然后进行琼脂糖电泳，确认切出的DNA片段的电泳谱带不发生变化。 2） Ligation-Recutting Test：在经过10倍量该酶切出的DNA片段中，加入 T4 DNA Ligase，使其连接，然后再使用该酶进行切断反应，判断Ligation-Recutting效率。 3） Genome DNA Digest：在0.5 μg的Escherichia coli Genome DNA（包埋于0.5% Agarose Gel中）中，加入过量的该限制酶，进行长时间（24 小时）酶切反应，然后进行脉冲电泳，确定切出的DNA片段的电泳谱带不发生变化。 4） pKF3 Enforcement Cloning Test：使用10倍量的该酶，将Enforcement Cloning Vector pKF3 DNA切开，然后再进行连接后，转化至TH2感受态细胞中，判断该酶切位点受到影响的重组体所占的比率。 ●在各种Universal Buffer中的相对活性： * +0.01% BSA→100% ●各种DNA的切断数： ●甲基化的影响： 根据识别序列后续碱基的不同，有时受dam methylase影响。 ●Star活性： 高甘油浓度条件下，识别序列会发生变化。 ●Basal Buffer组成： 10 mM Tris-HCl, pH7.5 7 mM MgCl2 100 mM NaCl 7 mM 2-Mercaptoethanol 0.01 % BSA ●Universal Buffer组成（-20℃保存）： 1.10 × L 100 mM Tris-HCl,pH7.5 4.10 × K 200 mM Tris-HCl,pH8.5 100 mM MgCl2100 mM MgCl2 10 mM Dithiothreitol 10 mM Dithiothreitol 2.10 × M 100 mM Tris-HCl,pH7.5 1,000 mM KCl 100 mM MgCl2 5.10 × T 330 mM Tris-Ac,pH7.9 10 mM Dithiothreitol (BSA 100 mM Mg-Ac 500 mM NaCl －Free) 5 mM Dithiothreitol 3.10 × H 500 mM Tris-HCl,pH7.5 660 mM K-Ac 100 mM MgCl2 6. 0.1% BSA 10 mM Dithiothreitol 7. 0.1% Triton X-100 1,000 mM NaCl ●10×Loading Buffer组成 （开封后室温保存） 0.9% SDS 50% Glycerol 0.05% Bromophenol Blue 使用时添加反应液量的1/10，即可停止反应，进行电泳。-20℃保存时，会出现SDS沉淀，请于温水浴中溶解后使用。在室温下保存时，SDS有时也会出现沉淀，此时同样请在温水浴中溶解后使用。 L M H K T（+BSA）相对活性(%)<2080*20 ＜20 120 λ Ad2SVφX pBR pUC pUC M13Col 40174322 19 119 mp18E1 1 5 0 0 0 1 1 1 0 V2010.10酶切位点保护碱基表
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