Agilent 1290+6400 LCMS Training

安捷伦1260液相色谱-

G6400系列三级四极杆质谱联用仪

现场培训手册

版本说明

? 安捷伦科技（中国）有限公司, 2011

2011 年 2 月

Rev. B.03.01 SP2

本手册适用于安捷伦三级四极杆 MassHunter工作站软件B.03.01 SP2及以上版本。不同版本的功能可能有所差异。

声明

本手册内容如有改变，恕不另行通知。安捷伦科技公司对本材料，及由此引起的任何商务和特种用途不承担责任。安捷伦科技公司对本手册中可能有的错误或与装置、性能及材料使用有关内容而带来的意外伤害和问题不负任何责任。如果安捷伦与用户对本书中的警告术语有不同的书面协议，这些术语与本书中的警告术语冲突，则以协议中的警告术语为准。

联系方式

售后服务中心免费电话：800 820 3278

手机拨打：400 820 3278 (需支付本地电话费)

免费传真：800 820 1172

电子信箱：lsca-china_800@https://www.360docs.net/doc/2d15074675.html,

中文网站：https://www.360docs.net/doc/2d15074675.html,

其他常用网址

中国Agilent售后服务网站：https://www.360docs.net/doc/2d15074675.html,

资料库：https://www.360docs.net/doc/2d15074675.html,/chem/library

培训：https://www.360docs.net/doc/2d15074675.html,/chem/education

网上研讨会：https://www.360docs.net/doc/2d15074675.html,/chem/eseminars

软件状态公告和补丁：https://www.360docs.net/doc/2d15074675.html,/chem/techsupport

消耗品：https://www.360docs.net/doc/2d15074675.html,/chem/supplies

技术支持：https://www.360docs.net/doc/2d15074675.html,/chem/techsupp

目录

版本说明 (3)

目录 (4)

1 基本原理 (6)

1.1四极杆质量分析器的基本原理 (6)

1.2三级四极杆的工作方式 (8)

全扫描（MS2 Scan） (8)

选择离子监测（SIM） (8)

子离子扫描（Product Ion Scan） (9)

母离子扫描 (9)

中性丢失扫描 (9)

多重反应监测（MRM） (9)

1.3离子源技术和原理 (10)

1.3.1 ESI源—大气压电喷雾离子源 (10)

1.3.2 APCI源—大气压化学电离离子源 (10)

1.3.3 ESI with Agilent Jet Steam Technology—带有安捷伦喷射流技术的ESI源 (11)

1.3.4不同离子源的比较 (11)

2 硬件概览 (12)

2.1典型配置图 (12)

2.2仪器序列号位置 (12)

2.4系统结构图示意图 (13)

3 开机和关机 (14)

3.1开机步骤 (14)

3.2关机步骤 (15)

4 软件概览 (17)

5 仪器配置和快捷控制功能 (20)

5.1自动进样器的配置和快捷控制功能 (20)

5.2泵的配置和快捷控制功能 (23)

5.3柱温箱的配置和快捷控制功能 (25)

5.4DAD的配置和快捷控制功能 (26)

5.5三级四极杆的配置和快捷控制功能 (26)

6 调谐和校正 (27)

6.1自动调谐步骤 (27)

6.2检验调谐的介绍及使用 (30)

6.3手动调谐的介绍和使用 (31)

7 方法编辑 (33)

7.1新建方法 (33)

7.2自动进样器的参数设置 (34)

7.2.1 微盘自动进样器的参数设置（G1367，G4226） (34)

7.3泵的参数设置 (35)

7.4柱温箱选项卡 (36)

7.5DAD检测器的参数设置 (37)

7.6三级四极杆采集参数的设定 (38)

7.6.1 调谐文件选择、时间过滤和时间分段等设定 (38)

7.6.2 全扫描（MS2 Scan）采集模式的参数设置 (39)

7.6.3 选择离子监测（MS2 SIM）采集模式的参数设置 (39)

7.6.4 子离子扫描（Product Ion Scan）采集模式的参数设置 (40)

7.6.5 多重反应监测（MRM）采集模式的参数设置 (40)

7.6.6 ESI源的参数设置 (41)

7.6.7 带有安捷伦喷射流技术的ESI源的参数设置 (42)

7.6.8 APCI源的参数设置 (43)

7.6.9 色谱图界面设置 (43)

7.6.10 Instrument界面设置 (44)

7.7保存方法 (44)

8 运行单针样品 (45)

9 编辑和运行WORKLIST (46)

9.1创建工作列表 (46)

9.2添加一个样品 (46)

9.3添加多个样品 (47)

9.4保存工作列表 (48)

9.5运行工作列表 (48)

10 定性分析 (49)

10.1打开文件 (49)

10.2放大或缩小谱图 (50)

10.3提取色谱图 (50)

10.4提取质谱图 (51)

10.5提取和扣除质谱背景 (52)

10.6改变质谱图离子显示的阈值 (54)

10.7W ALK C HROMATOGRAM和S PECTRUM P REVIEW (55)

10.8积分 (56)

10.9计算信噪比 (57)

11定量分析——创建定量的批处理和定量方法 (58)

11.1内标法定量（ISTD） (58)

12 仪器的日常维护 (67)

12.1MS维护周期表 (67)

12.2冲洗雾化器组件（N EBULIZER） (67)

12.3离子源的清洗和维护 (68)

12.4机械泵的日常维护 (68)

14.添加或更换机械泵油 (68)

13 LC和MS常用消耗品 (70)

13.11100/1200/1260系列液相色谱仪常用消耗品 (70)

13.21290系列液相色谱仪常用消耗品 (71)

13.3质谱常用消耗品 (71)

14. 建立QQQ定量方法的操作流程 (72)

1 基本原理

1.1四极杆质量分析器的基本原理

四极杆分析器由四根棒状电极组成，它们距离相等而且互相平行，这四个棒状电极形成一个四极电场。四极杆处于对角位置的两根杆被连接在一起，其中一对杆之间施加电压 ，同时在另外一对杆上施加大小相同、极性相反的直流电压和相位相反、振幅/频率相同的射频电压- 。 V dc 为直流电压，V rf 为射频电压。直流电压与射频电压叠加在一起，且两对电极的极性不停进行快速切换，使得带电离子震荡通过四极杆。下图是这种分析器的示意图。

当质荷比为 的离子Z 沿轴方向通过四极场时，其运动轨迹可由马修方程表述。

这里

， ，

这里 为射频电压的振幅； 为直流电压； 为四极杆场中心到四极杆边缘的距离； 为射频电压的频率； 为离子的质量； 为离子所带的电荷数目。由a ，q 的方程我们可以得到： ， ，

由于 、 为仪器的固定参数，而 和 是可以由仪器控制的参数。因而，通过控制

=常数 进行扫描，就可以使不同质量的离子先后进入稳定区域通过四极杆被检出。

下图是马修稳定图。这是一张RF 和DC 电压结合图。这张图可以预测给定的离子在四级杆场中是否稳定。对于特定的RF 和DC 电压，包含这个点之上的稳定区域内的离子将会通过四级杆进入检测器。这条扫描线由调谐文件中设置的宽度增益和宽度补偿决定。如果降低宽度补偿，扫描线将会下降，峰宽度将会加宽。如果扫描线被提高，峰宽度将会变窄。

稳定区

不稳定区

实际操作时，当某一射频电压和直流电压施加到四极杆上，只有满足马修方程的某个质荷比的离子能通过四极杆到达检测器。质荷比太大的离子，因为RF力不足以克服离子的动能，将向负杆飘移。而质荷比太小的离子，则RF力会大于离子的动能，离子在四极杆内的振幅会越来越大，最后打到正杆。这一过程可把质量数超过带宽的离子被过滤掉，这一带宽是由调谐文件中设置的直流和RF电压比决定的。

改变加在四极杆上的直流和射频电压，另一质量的离子将通过四极杆，进入检测器。随着在四极杆上施加的电压的变化，质荷比在某质量范围内的各个离子，依次穿过四极杆到达检测器，给出响应信号，得到所采集的数据。

1.2 三级四极杆的工作方式

每个四极杆质量分析器有三种工作方式：离子全通过（True Total Ion，TTI）、全扫描（SCAN）和选择离子监测（SIM）。

离子全通过是只四极杆不施加直流电压，这样就不过滤离子，所有的带电离子全都通过；全扫描是指在给定的质荷比范围内，依次采集每个质量数的信号；而选择离子监测模式，只是收集指定的某个或某几个质荷比的离子信号。

两个四极杆在空间上串联起来，就可以有多种工作方式。三级四极杆主要有如下几种操作方式。

全扫描（Scan）

选择离子监测（SIM，Selected Ion Monitoring）

子离子扫描（Product Ion Scan）

母离子扫描 (Precursor Ion Scan)

中性丢失扫描 (Netural Lost Scan)

中性获得扫描（Netural Gain Scan）

多重反应监测 (MRM, Multiple Reaction Monitoring)

我们这里本手册只介绍最常用的Scan、SIM、Product Ion Scan, MRM这几种工作方式。下面的内容可以和方法设置部分质谱的参数设置配合理解。

全扫描（MS2 Scan）

MS1 工作在离子全通过（TTI）状态下，不过滤离子，所有的带电离子全都通过；碰撞池不施加碰撞能量，不会把离子撞碎；而MS2工作在扫描模式，可以得到待分析物质的一级质谱全图。在这种工作模式下，其功能相当于单级四极杆。

选择离子监测（SIM）

MS1 工作在离子全通过（TTI）状态下，不过滤离子，所有的带电离子全都通过；碰撞池不施加碰撞能量，不会把离子撞碎；而MS2工作在SIM模式，可以得到选定的离子的一级质谱图。在这种工作模式下，其功能相当于单级四极杆。

子离子扫描（Product Ion Scan）

MS1 使用SIM 方式选择某一个或多个特定质荷比的母离子通过四极杆1，在碰撞池产生碎片离子，然后在MS2 中进行扫描分析。此过程可以产生典型的质谱/

质谱碎片谱图。

母离子扫描

在母离子扫描中，MS1

采用扫描方式，MS2 采用SIM 方式测定某一个或多个特定的碎片离子，因此可在非常复杂的混合物中监测产生该特定碎片的母离子。非常适合分析具有同一结构的化合物。在下面的例子中，睾丸激素在母碎片(m/z 367) 中碎片m/z 97得到选择性监测，具有极高的灵敏度和精确的定量分析。

中性丢失扫描

在三级四极杆中进行中性丢失扫描，可监测母离子特定的中性丢失，MS1 和MS2 同步进行扫描，但是MS1 和MS2 之间具有固定的质量差值，这样可以使灵敏度和选择性得到最大化。例如缩氨酸磷酸盐中一个磷酸根的丢失。在这个例子中，MS1 和MS2的扫描得到母离子的谱图，这张谱图是母离子为了磷酸化，丢失了碎片98 而得到的。

多重反应监测（MRM）

MS1 采用SIM 方式选择某个或多质荷比的母离子，在碰撞池产生碎片离子。MS2 同样采用SIM方式来监测由母离子产生的一个或几个特定子离子。这就是多重反应监测（MRM）。这种方式可以极大提高检测灵敏度和定量准确性。是三级四极杆仪器最主要的使用方式。

1.3 离子源技术和原理

安捷伦专利的直角喷雾离子源设计，雾化器与采样毛细管轴呈90度角，这样大大减少了未离子化的中性溶剂液滴进入到质谱中，从而降低了噪音，并保证取样毛细管和离子光路更干净，更抗污染。固定位置的雾化器在分析方法要求改变流速或流动相组成时无需对雾化器位置进行繁复的调整，大大提高了分析效率。

安捷伦的离子源包括高流量的高温氮气反吹干燥气系统，可以加速喷雾的溶剂挥发，减少溶剂簇和流动相附加离子，提高了谱图的质量、灵敏度和重现性。在仪器不进样分析（处于Standby状态）时，仍然维持一定的干燥气温度和流量，可以避免用户实验室的空气被吸入质谱的真空系统，极大的减少了污染和维护的周期。

1.3.1 ESI源—大气压电喷雾离子源

雾化器的喷雾针被带了高电压的半圆柱体形电极环绕，带有被测物质离子的流动相，在雾化针尖端发生雾化。在半圆形电极和毛细管间的电压不同，产生一个电场，使液滴表面表富集带同种电荷的离子，而内部带相反电荷聚集，形成带电液滴细的喷雾，液滴在电场的作用下，飞向毛细管。加热的氮气干燥气体的反向流动，带走液滴中的中性的溶剂分子，从而收缩液滴，直到排斥的静电力超过液滴表面张力，引起库仑爆炸。这个过程不断重复，直到待分析物离子最终变成气态进入毛细管。

ESI是LC/MS的基础，是目前最广泛应用的电离方式，具有极为广泛的应用领域。ESI属于浓度敏感型离子化技术，样品浓度越高，灵敏度越高。适合与分析极性小分子；另外，由于其可以产生多电荷离子的特效和相对较低的离子化稳定，因而也适合分析生物大分子，比如蛋白质和多肽的分析。

1.3.2 APCI源—大气压化学电离离子源

APCI的电离是在常压下的气态化学电离(CI)过程。溶剂或反应气在电晕针的作用下先带电，再转移给化合物形成离子。APC一般只产生单电荷离子，且需要在高温的离子化环境下操作。它属于质量-流量敏感型离子化技术，样品分子量越大，性能越高；在相对较高的流速下灵敏度更高。适合分析中等极性到弱极性的化合物。

1.3.3 ESI with Agilent Jet Steam Technology —带有安捷伦喷射流技术的ESI 源

带有安捷伦喷射流技术的ESI 源（简称Jet Stream ）与普通的ESI 源的电离原理相同，提供和普通ESI 源相同的离子特征。另外，喷射流技术增加了加热的鞘流气，并可以在喷嘴处施加一个喷嘴电压。更高的温度可以提高流动相的蒸发率，更有利于气溶胶的形成和液滴的蒸发，减少了喷雾中大的液滴。由于使用了热梯度聚焦技术，同轴的鞘流气有助于减少离子扩散，将更多的离子引入到MS 中。减少中性溶剂束进入MS

，提高了灵敏度，降低了噪音

1.3.4

不同离子源的比较

2 硬件概览

2.1典型配置图

整套仪器包括液相色谱和质谱主机，以及与其配套的计算机和打印机。计算机、液相色谱和质谱之间通过网络协议通宵，并通过一个网络交换机（LAN Switch ）连接在一起。

2.2仪器序列号位置

对于液相色谱，每个模块的型号和序列号标签在该模块的右下方；对于三级四极杆，仪器的型号和序列号标签在仪器左下角的左侧。如下图所示。所有安捷伦的产品，Gxxxx 代表的是该产品的型号，USxxxxxxxx ，DExxxxxxxx 或者JPxxxxxxxx 代表的是仪器的序列号。

比如您的液相色谱泵有故障，您把泵的型号G1312B, 序列号DE63060245提供给我们。

注意：在您打电话到Agilent 时，请事先务必记下您仪器的型号和序列号。这对于我们在系统里及时给您提供服务非常重要！

2.4系统结构图示意图

三级四极杆的真空系统由一个前级真空泵（机械油泵，Edwards EM28）和一个（G6410B ）或两个（G6430A 和G6460A ）分子涡轮泵组成。 前级真空：1.8-2.5 Torr 6410B 的高真空范围：

2.7 to

3.3 x 10e-5 torr （碰撞气打开时） 3 to 6 x 10e-6 torr （碰撞气关闭时） G6430A 和6460A 的高真空范围： 1.9 to 2.3 x 10e-5 torr （碰撞气打开时） 3 to 6 x 10e-6 torr （碰撞气关闭时）

毛细管—增加去溶剂化，从而使化学噪声最小。

Skimmer 与八极杆—高效率的离子捕获，使宽质量范围离子传输最优化。 lens1和lens2—提高高质量离子的传输。

四极杆1(MS1)和四极杆2 (MS2)—双曲线的四极杆优化离子传输和质谱分辩率。

碰撞池（CC ）—高压具有线性加速度的碰撞池优化质谱/质谱分裂，从而在一个短的停留时间仍可消除交叉干扰。六极杆设计有助于捕获碎片离子。

高能打拿极—允许快速电极转换，高增益，寿命长，噪音低。离轴设计允许中性物质穿过而不会碰到检测器。

电子倍增器——寿命长，线性范围宽。因为离子从不接触其表面，只有电子接触。

毛细管

Skimmer 八极杆

Lens 1 Lens 2

高能打拿极

电子倍增器

3 开机和关机

3.1 开机步骤

如果使用液氮罐，打开液氮罐自增压阀门，调节液氮罐分压表的输出压力为0.7 MPa（~110psi），并确认前级泵的镇气阀处于关闭状态。

如果使用氮气发生器，打开氮气发生器的电源，待压力输出稳定后，调节输出压力为0.7 MPa （~100 psi），并确认前级泵的镇气阀处于关闭状态。

打开高纯氮主阀门，调节高纯氮气钢瓶次级减压表输出压力至0.15 MPa（最大不要超过0.2 MPa 或30psi）。

注意：不同的氮气发生器，其操作可能不同。请咨询氮气发生器的供应商，以正确操作氮气发生器。安捷伦不对因氮气发生器的原因导致的仪器损坏和故障负任何责任。

1. 打开计算机，网络交换机（LAN Switch）电源。

2. 打开液相各个模块电源。

3. 打开质谱前面左下角的电源开关，这时可以听到质谱里面溶剂切换阀切换的声音。同时机械泵开始工作，仪器开始自检。等待大约两分钟，听到第二声溶剂阀切换的声音(表明质谱自检完成)后，表示仪器自检完成，可以联机。

质谱一接通电源，前级真空规就开始工作，监视前级真空值。但只有当Turbo1和Turbo2（G6410B 没有Turbo2，G6430A和G6460有Turbo2）涡轮泵的转速都大于95%之后，四极杆的高真空规才会开始工作，读取真空值。

4. 在计算机桌面上双击MassHunter采集软件图标，进入MassHunter工作站。

5. 如果MassHunter工作站在之前曾经打开和关闭过，请确认在再次打开工作站之前，双击桌面上

的图标，以关闭MassHunter所有的进程。

注意：在MassHunter采集软件关闭后再次打开前，必须执行上面的操作，否则可能无法进入采集软件。并提示下面的错误。

3.2关机步骤

注意：关机前务必确认气镇阀（本页下方图所示）处于关闭状态(顺时针拧紧)，否则前级泵的泵油可能因此回流到质谱的真空腔内，损坏仪器。

气镇阀的位置如下

注意：在日常操作时，必须每周逆时针拧开气镇阀到底，维持约15-30min ，把油气分离器内多余的泵油放回泵内，然后再顺时针拧紧，关闭气镇阀。并且请务必每周检查确认泵油液位在标识的最高和最低刻度之间。

1. 在MassHunter 采集软件内点击MS 三级四极杆 图标，依下图所示选择Vent 。

2.出现下述提示，如果确认要放空，选择Yes 。

3. 可以在三级四极杆的Diagnosis界面观察涡轮泵转速的下降情况。

4.大约十分钟以后，会出现如下提示：

5. 点击OK，关闭MassHunter 软件。然后关闭质谱及LC各模块的电源。关闭电脑。如果使用液氮罐，同时关闭自增压阀门。如果使用氮气发生器，关闭氮气发生器。

4 软件概览

在仪器安装完成后，工程师一般都会将一些与MassHunter工作站相关的图标放置于电脑桌面上，便于用户使用。

仪器事件记录本仪器配置程序

打开数据采集软件后，常用的快捷按钮以及功能区如下：

软件功能区

仪器状态区

方法编辑区

工作列表

编辑区

谱图显示区

打开

/保存方法

打

开/保存工作列

表

编辑工具

仪器事件记录本

显示/

隐藏功能区

样品运行控制

工具栏

在Actuals 处点击鼠标右键，选择setup 。在弹出的Actuals Setup 对话框，选择前级真空、高真空、干燥气流量和压力以及涡轮泵转速、毛细管电流等重要参数到实时状态显示窗口。对于重要参数还可以选中该参数，然后利用Background Color 按钮和Text 按钮设定背景及字体颜色等。

另外，建议对所有LC 模块，也在这里设置来显示“Not Ready Text Long”的相关信息。比如上面的例子，泵的状态变为Not Ready ，在Logbook 里面并不会记录其原因，如果通过设置显示“Not Ready Text Long”的信息就可以很清楚的知道原因—溶剂A 的量太少 了。

仪器模块的不同的颜色代表了仪器的不同状态：

绿色：Ready ，表示仪器准备就绪，可以随时进行样品分析。 蓝色：表示仪器正在运行样品。

粉色：表示仪器处于等待运行的状态。

黄色：Not Ready ，表示仪器的状态还没有准备好或者仪器条件还没有达到设定值。 灰色：表示仪器处于Standby By 或Shut Down 状态。 红色：表示仪器出错。

5 仪器配置和快捷控制功能

在仪器的各个模块上，单击鼠标左键或右键可以弹出快速控制仪器的菜单。

注意：如果您的仪器的相应模块菜单与下图所示有所不同，那么则说明您的某些模块没有此功能或者您的软件版本不支持此功能。

5.1 自动进样器的配置和快捷控制功能

Configuration：对进样器进行配置。

注意：定量环、针座以及进样针的设定必须和仪器的配置相同，否则会影响仪器的性能或进样体积错误。除非仪器的硬件有更改，否则请不要更改默认的配置。