CTLA4Ig真核表达质粒及穿梭质粒的构建

收稿日期:2005210210

作者简介:张进安,男,副教授,博士,主要从事内分泌学代谢病的临床与基础研究工作.

文章编号:167224291(2006)0320080204

CT LA4Ig 真核表达质粒及穿梭质粒的构建

张进安1,2,　杨章民3,　Peter M.Thule 2,　Darin E.Olson 2,　Adam G.Campbel 2

(1西安交通大学第一附属医院,陕西西安710061;

2爱默蕾大学及退伍军人医疗中心内分泌代谢科,美国亚特兰大30033;

3.陕西师范大学生命科学院,陕西西安710062)

摘　要:以表达人CTLA4Ig (hCTLA4Ig )的原核质粒为基础,采用限制性DNA 内切酶,DNA 连接酶等基因重组技术,构建了能表达该蛋白的真核质粒,EL ISA 法检出了受转染的真核细胞培养上清液中的蛋白表达.在此基础上构建了含hCTLA4Ig 的穿梭质粒.关键词:质粒构建;真核表达;基因治疗中图分类号:R392.11　文献标识码:A

Construction of eukaryotic expression plasmid and

pShuttle plasmid containing CT LA 4Ig gene

ZHAN G Jin 2an 1,2,YAN G Zhang 2min 3,Peter M.Thule 2,Darin E.Olson 2,Adam G.Campbel 2(1The First Affiliated Hospital of School of Medicine ,Xi ′an Jiaotong University ,Xi ′an 710061,Shaanxi ,China ;2Endocrinology and Metabolism Section ,Veterans Adminstration Medical Center and Emory University ,Decatur 30033,Atlanta ,USA ;3College of Life Science ,

Shaanxi Normal University ,Xi ′an 710062,Shaanxi ,China )Abstract :On the basis of the availability of the prokaryotic expression plasmid which expresses human CTLA4Ig (hCTA4Ig ),the eukaryotic plasmid harboring hCTLA4Ig was constructed by using recombinant DNA technique.The recombinant eukaryotic expression plasmid was identified by digestion of restricted enzymes and sequencing.The protein of hCTLA4Ig was detected by EL ISA in the conditioned medium after the plasmid was transfered into 293cells.Then hCTLA4Ig gene fragment together with eukaryotic promotor was cut from eukaryotic expression plasmid and was inserted into plasmid pShuttle.Restriction enzyme analysis showed that pShuttle/hCTLA4Ig has been successfully obtained ,and it lays a foundation for CTLA4Ig gene therapy.K ey w ords :construction of plasmid ;eukaryotic expression ;gene therapy

CTLA4Ig 是人工合成的针对共刺激途径的免疫抑制分子,1992年由Linsley 等采用原核基因工

程方法首先制备[1].自那时起,这种可溶性蛋白便得到了广泛重视和研究.近年来,CTLA4Ig 治疗类风湿性关节炎的几个大型、双盲、安慰剂对照临床试验更是显示了这一新型免疫抑制药物高效、低毒的特点和广阔的应用前景[224].但是,对自身免疫病和移植排斥反应这些慢性病理状态来说,反复注射这种价格不菲的人造蛋白不仅不方便且代价很高,限

制了将来广泛的临床应用,特别在中国等发展中国家.而且,长期全身给药的潜在副作用也不宜忽视,例如病毒、细菌感染的机会可能增加[5].基因治疗可以克服这些缺点.因此,近年来应用CTLA4Ig 抑制排斥反应的研究已主要集中在基因治疗.移植前对移植器官或细胞用表达CTLA4Ig 的重组病毒进行灌注,术后移植物局部的蛋白表达呈高水平,外周血则较少表达且疗效更持久[628].基因治疗的前提是建立表达目的基因的真核质粒,对绝大多数基因

第34卷　第3期陕西师范大学学报(自然科学版)

Vol.34　No.3　2006年9月Journal of Shaanxi Normal University (Natural Science Edition )Sep.2006　

治疗来说还需将目的基因插入穿梭质粒,以便进一步建立表达目的基因的重组病毒.为此,我们构建了表达CTLA4Ig的真核质粒和穿梭质粒,为CTLA4Ig的基因治疗奠定了基础.

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　质粒及菌株　CTLA4Ig原核表达质粒pUC19/hCTLA4Ig由美国CDC(Center for Disease Control and Prevention)Rod M.Donlan教授惠赠.真核表达质控pCI,全长4006bp,CMV启动子,氨苄青霉素抗性和穿梭质粒pShuttle,全长6621bp,卡那霉素抗性,均由本室保存.大肠杆菌菌株E.coli DH5α和293细胞也由本室冻存.

1.1.2　工具酶及试剂　限制性内切酶PvuⅠ由美国Promega公司提供,其余内切酶由Biolab公司提供.T4DNA连接酶购自美国Invitrogen公司.琼脂糖凝胶上DNA纯化回收试剂盒、细菌内微量质粒提取(minipreraration)和大量质粒提取(megapreparation)试剂盒,以及DNA聚合酶Ⅰ的大片段(K lenow片段)均购自G ibco公司.鼠抗人CTLA4单抗和羊抗鼠Ig G为美国Vector公司产品.其它试剂均为美国产分析纯.

1.2　方法

1.2.1　真核表达质粒　pCI/hCTLA4Ig的构建将原核表达质粒pUC19/hCTLA4Ig以NotⅠ和XbaⅠ进行双酶切,切下hCTLA4Ig基因片段,目的片段用凝胶上DNA纯化回收试剂盒回收,按说明书进行操作.将回收后的hCTLA4Ig基因片段与经过NotⅠ和XbaⅠ酶切而呈线性的pCI质粒混合,用T4DNA连接酶连接,反应液总体积为10μL,室温过夜.

将连接产物转化E.coli DH5α菌体,按电穿孔仪说明书操作.氨苄青霉素抗性固体培养基筛选重组子,挑选在LB固体培养基上生长良好的单菌落于5mL LB培养基中,37℃震荡12h,吸出1mL培养液,以微量质粒DNA提取盒制备质粒.

1.2.2　重组体pCI/hCTLA4Ig的鉴定　对制备的微量DNA应用限制酶进行分析鉴定,其结果用1%琼脂糖凝胶电泳检查.另外,送少量DNA样品至Emory大学分子生物学研究中心进行序列分析.

1.2.3　大量制备质粒pCI/hCTLA4Ig并转染真核细胞　将上述经酶切分析证实含有pCI/hCTLA4Ig 质粒的细菌培养液1mL加入1L含有氨苄青霉素的LB培养液中,37℃震荡过夜,离心后以大量质粒DNA提取药盒按说明书制备质粒pCI/hCTLA4Ig.以氯化钙法转染293细胞,置37℃、5%CO2培养箱中培养,分别于第3、5、8、10天吸取上清液,置-80℃冰箱待测.

1.2.4　hCTLA4Ig蛋白检测　应用鼠抗人CTLA4单抗、羊抗鼠Ig G等,以双抗体夹心法(EL ISA)对细胞培养液中的hCTLA4Ig进行定性测定.

1.2.5　穿梭质粒pShuttle/hCTLA4Ig的构建　以限制酶PvuⅠ切开质粒pCI/CTLA4Ig,所得到的线性质粒为粘性末端,再在dN TP存在的条件下以DNA聚合酶Ⅰ的K lenow片段改造为平端,反应液中每个脱氧核苷酸的终浓度为33μmol/L,K lenow 片段的浓度为每微克DNA1个单位.以p H值为512的醋酸钠和乙醇沉淀DNA,再以限制性酶Bg1Ⅱ消化线性DNA,切下带有CMV启动子和SV40 polyA的hCTLA4Ig片段,以限制酶BglⅡ(生成粘性末端)和EcoRV(生成平端)双酶消化质粒pShuttle.在T4连接酶作用下将从pCI/hCTLA4Ig 上切割下来的hCTLA4Ig插入pShuttle质粒.所构建成的质粒以酶切分析鉴定.

2　结果

质粒pUCI/CTLA4Ig经NotⅠ和XbaⅠ双酶切后得到1410bp的完整hCTLA4Ig基因的cDNA片段,如图1所示.多个单酶切、双酶切分析显示,该片段被成功插入了质粒PCI的多克隆位点,如图2

所

图1　从质粒pUC19/hCT LA4Ig上切下

1.4kb的hCT LA4Ig cDNA片段

Fig.1　Cutting hCT LA4Ig cDNA(1.4kb)

from plasmid pUC19/hCT LA4Ig

a.阴性对照;

b.XbaⅠ/NotⅠ;

c.XbaⅠ/NotⅠ;

d.100bp marker;

e.1kb marker

示质粒上无PvuⅠ的酶切位点,有一个EcoNⅠ位点,经EcoN I/XmnI双酶切产生2631bp和2785 bp两个片段,经EcoNⅠ/XhoⅠ双酶切产生432bp、918bp和4066bp三个片断.基因测序证实所插入的hCTLA4Ig cDNA片段的碱基序列正确.EL ISA

第3期张进安等:CTLA4Ig真核表达质粒及穿梭质粒的构建81

图2　酶切分析鉴定质粒pCI/CT LA4Ig

Fig.2　Identif ication of pCI/CT LA4Ig by

restriction endonuclease digestion

a.pVU Ⅰ;

b.EcoN Ⅰ;

c.EcoN Ⅰ/Xmn Ⅰ;

d.EcoN Ⅰ/Xho Ⅰ;

e.阴性对照;

f.100bp marker ;

g.1kb marker

分析证实了pCI/CTLA4Ig 质粒可在293细胞中成

功表达并分泌hCTLA4Ig 蛋白,且在培养的第3—8天内培养液中hCTLA4Ig 蛋白浓度递增.

质粒pCI/CTLA4Ig 长度为5416bp ,其上有两个Pvu Ⅰ和一个Bg1Ⅱ位点,所以双酶切后得到三个基因片段,分别为1350bp 、1277bp 和2789bp ,如图3所示,其中2789bp 的片段为CMV 启动子控制下且含有SV40polyA 的hCTLA4Ig 基因,

而且

图3　从质粒pCI/CT LA4Ig 上切下2789bp 的

受CMV 启动子控制的且带有

SV 40polyA 的hCT LA4Ig cDNA 片段Fig.3　Cutting hCT LA4Ig fragment including CMV promotor and SV 40polyA(2789bp)

from plasmid pCI/CT LA4Ig

a.100bp marker ;

b.1kb marker ;

c.Bgl Ⅱ/pVU Ⅰ;

d.Bgl Ⅱ/pVU Ⅰ;;

e.Bgl Ⅱ/pVU Ⅰ

经过K lenow 片段处理后,其一端(Pvu Ⅰ端)变为平端,以与pShuttle 的EcoRV 端(也为平端)相连接.此基因片段插入pShuttle 质粒的多克隆位点后制得长度为9410bp 的质粒pShuttle/hCTLA4Ig.多个酶切分析证实质粒pShuttle/CTLA4Ig 构建成功,如图4显示该质粒被限制酶Acc65Ⅰ切成1452bp 和7958bp 两个片段,被Bgl Ⅱ/BamHI 酶切后得到3304bp 和6106bp 的片段

图4　酶切分析鉴定质粒pShuttle/CT LA4Ig

Fig.4Identif ication of pShuttle/CT LA4Ig by restriction endonuclease digestion a.BamH Ⅰ/Bgl Ⅱ;b.阴性对照;

c.Acc65Ⅰ;

d.1kb marker

3　讨论

T 细胞的活化需要双重信号,一种信号由T 细

胞受体与抗原递呈细胞(APC )的抗原—MHC 复合物相结合来提供;另一信号通过APC 表面的共刺激分子(如B7)与T 细胞上相应受体(如CD28)的结合而提供.缺少共刺激信号时,T 细胞呈克隆无能或发生凋亡.CD28/B7途径是最重要的共刺激途径,其在正常免疫应答和病理性免疫应答中均起重要作用.这一途径涉及APC 上的B7(B711或B712)与T 细胞上的CD28的结合.CD28组成性表达于CD4+和CD8+T 细胞的表面,CTLA4在结构上与CD28高度同源,只暂时性表达于活化T 细胞的表面.CTLA4与B7分子结合后向T 细胞传递负性信号,

抑制T 细胞的进一步活化,使免疫反应适可而止.CTLA4抑制免疫反应的重要作用在CTLA4基因敲

除鼠得到了很好的证明.该种小鼠出生后两周即自发性罹患一种全身性淋巴细胞增殖性疾病,3～4周后死亡.其淋巴结和脾脏5～10倍于正常大小,心、肺、胰和骨髓内有大量淋巴细胞浸润.因此,人为调节这一途径引起了学者们极大的兴趣.CTLA4Ig 是一种基因工程产品,是将CTLA4的膜外功能区与Ig G 1的铰链区相连接的可溶性融合蛋白.CTLA4Ig

与B7分子结合,不仅阻断CD28与B7的结合,而且对APC 产生负调节作用,主动诱导T 细胞失活和无反应性,是一种很有潜力的新型免疫抑制剂.给基因敲除鼠注射CTLA4Ig 可阻止淋巴细胞的过度增生,中断给药则细胞增殖回升到给药前水平.目前CTLA4Ig 防治自身免疫性疾病(如1型糖尿病、多发性硬化)及移植排斥反应已进行了大量动物实验,研究结果令人鼓舞.因此我们首先构建了能表达

82　陕西师范大学学报(自然科学版)第34卷

CTLA4Ig 蛋白的真核质粒.对某些疾病如自身免疫

甲状腺疾病来说有可能通过直接注射这种质粒来达到治疗目的,因为甲状腺细胞有摄取和表达质粒DNA 的特性[9211].在构建真核表达质粒的基础上我

们进一步将目的基因连同真核表达启动子导入了穿梭质粒,为CTLA4Ig 的基因治疗奠定了基础,因为穿梭质粒的结构特征为重组病毒的构建所必需,而目前大多数基因治疗以重组病毒为载体[12].参考文献:

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Investigative Medicine ,2005,53(4):2012212.

[责任编辑　王　勇]

我校组织陕西师范大学周末科技论坛

随着世界科学技术的迅猛发展,传统的学科界限变得越来越模糊,学科的交叉融合,跨学科的科学研究

已成为当代学术发展的重要生命力所在。本着“优化学术环境,促进学科交流,提升科研水平,形成发展特色”的宗旨,由我校房喻教授、王国俊教授倡议,张志琪教授、吴建华教授、林书玉教授、张成孝教授、王吉吉之教授、黄春长教授、李永明教授、田呈瑞教授、游旭群教授等发起组织民间性质的周末科技论坛,并于2006年4月9日晚召开论坛理事会预备会议,探讨了开展跨学科研究的必要性及科技论坛的运作方式,确立了第一届理事会理事,王国俊教授担任首任理事会主席,张志琪教授担任副主席,冯建新同志担任秘书长。预备会议确定了论坛举行的时间,计划每两周周末(周六或周日)举办一次。

周末科技论坛首场报告会于2006年4月22日在雁塔校区学术活动中心二层报告厅举办,由王国俊教授主讲,房喻教授主持。

(王彩红)

第3期张进安等:CTLA4Ig 真核表达质粒及穿梭质粒的构建83