人脐带血间充质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

人脐带血间充质干细胞体外分离培养及生物学特性研究
人脐带血间充质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

脐带血造血干细胞库管理办法(试行)

脐带血造血干细胞库管理办法(试行) 第一章总则 第一条为合理利用我国脐带血造血干细胞资源,促进脐带血造血干细胞移植高新技术的发展,确保脐带血 造血干细胞应用的安全性和有效性,特制定本管理办法。 第二条脐带血造血干细胞库是指以人体造血干细胞移植为目的,具有采集、处理、保存和提供造血干细胞 的能力,并具有相当研究实力的特殊血站。 任何单位和个人不得以营利为目的进行脐带血采供活动。 第三条本办法所指脐带血为与孕妇和新生儿血容量和血循环无关的,由新生儿脐带扎断后的远端所采集的 胎盘血。 第四条对脐带血造血干细胞库实行全国统一规划,统一布局,统一标准,统一规范和统一管理制度。 第二章设置审批 第五条国务院卫生行政部门根据我国人口分布、卫生资源、临床造血干细胞移植需要等实际情况,制订我 国脐带血造血干细胞库设置的总体布局和发展规划。 第六条脐带血造血干细胞库的设置必须经国务院卫生行政部门批准。 第七条国务院卫生行政部门成立由有关方面专家组成的脐带血造血干细胞库专家委员会(以下简称专家委

员会),负责对脐带血造血干细胞库设置的申请、验收和考评提出论证意见。专家委员会负责制订脐带血 造血干细胞库建设、操作、运行等技术标准。 第八条脐带血造血干细胞库设置的申请者除符合国家规划和布局要求,具备设置一般血站基本条件之外, 还需具备下列条件: (一)具有基本的血液学研究基础和造血干细胞研究能力; (二)具有符合储存不低于1 万份脐带血的高清洁度的空间和冷冻设备的设计规划; (三)具有血细胞生物学、HLA 配型、相关病原体检测、遗传学和冷冻生物学、专供脐带血处理等符合GMP、 GLP 标准的实验室、资料保存室; (四)具有流式细胞仪、程控冷冻仪、PCR 仪和细胞冷冻及相关检测及计算机网络管理等仪器设备; (五)具有独立开展实验血液学、免疫学、造血细胞培养、检测、HLA 配型、病原体检测、冷冻生物学、 管理、质量控制和监测、仪器操作、资料保管和共享等方面的技术、管理和服务人员; (六)具有安全可靠的脐带血来源保证; (七)具备多渠道筹集建设资金运转经费的能力。 第九条设置脐带血造血干细胞库应向所在地省级卫生行政部门提交设置可行性研究报告,内容包括:

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定 【摘要】目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞,接种含10%胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后,进行细胞形态学观察,绘制细胞生长曲线,分析细胞周期,检测细胞表面抗原。结果采用Percoll(1.073 g/mL)分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀,梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期,至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50%~70%细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定,可作为组织工程的种子细胞。 【关键词】脐血;间充质干细胞;细胞周期;免疫细胞化学 Abstract: Objective Isolation and cultivation of mesenchymal stem cells (MSCs) in human umbilical cord in vitro, and determine their biological properties. Methods The mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation from human umbilical cord blood in sterile condition, and cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum. After the adherent mononuclear cells were obtained, the shape of cells were observed by microscope, then the cell growth curve, the cell cycle and the cell surface antigens were obtained by immunocytochemistry and flow cytometry methods. Results MSCs obtained by Percoll (1.073 g/mL) were similar in size, spindle-shaped or star-shaped fibroblasts-liked cells. Cell growth curve analysis indicated that MSCs were in the exponential stage after 5d and in the stationary stages after 9d. Flow cytometry analysis showed that the CD29 and CD44 positive cells were about 50%~70%. Conclusions The human umbilical cord derived mesenchymal stem cells were grown stably in vitro and can be used as the seed-cells in tissue engineering. Key words:human umbilical cord blood; mesenchymal stem cells; cell cycle; immunocytochemistry 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)在一定条件下具有多向分化的潜能,是组织工程研究中重要的种子细胞来源。寻找来源丰富并不受伦理学制约的间充质干细胞成为近年来的研究热点[1]。脐血(umbilical cord blood, UCB)在胚胎娩出后,与胎盘一起存在的医疗废物。与骨髓相比,UCB来源更丰富,取材方便,具有肿瘤和微生物污染机会少等优点。有人认为脐血中也存在间充质干细胞(Umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,UCB-MSCs)。如果从脐血中培养出MSCs,与胚胎干细胞相比,应用和研究则不受伦理的制约,蕴藏着巨大的临床应用价值[2,3]。本研究将探讨人UCB-MSCs体外培养的方法、细胞的生长曲线、增殖周期和细胞表面标志等方面,分析UCB-MSCs 作为间充质干细胞来源的可行性。

胚胎干细胞的体外诱导分化模型

胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源 李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1 胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2 胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1 神经细胞 体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献  1 Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147.  2 Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731.  3 Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486.  4 裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)

脐带间充质干细胞综述(转)

脐带间充质干细胞概述 医学实验班70080103 王雪彤 脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构,其外被羊膜,内含2条脐动脉、1条脐静脉,在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织———华尔通氏胶(Whartonps Jelly) ,从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 。 1人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的形貌分析: 倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长, 为形态相对均一的梭形细胞,呈平行排列生长或旋涡状生长,低密度时较扁平, 密度增加趋于融合时细胞变细长。扫描电镜下观察呈长条状纤维样, 细胞膜表面不光滑, 有小结节状物, 细胞无明显突起,细胞间无网络状连接。透射电镜观察核大, 不规则, 核仁明显, 常染色质多, 异染色质少, 胞浆少。胞质内细胞器较少, 以粗面内质网和线粒体为主, 内有大量游离核糖体, 部分细胞可见内质网肿胀。 ——植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(×200) 例如三代细胞的形态学特征——人体脐带间充质干细胞离体培养后,培养至第三代。第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主,细胞周边有较多的丝状伪足,见图1,2;并形成毗邻细胞之间的网状连接,见图3;细胞核较大,核膜清晰,含两三个核仁,核质比较小,见图4。 图1图

2图3 图4 2人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的生物学特性: HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞,是别于两者之间的一类新的多能间充质细胞,它们之间既有联系又有差异。根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会( the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the Internation2 al Society for Cellular Therapy)制定的最低标准, 脐带间充质干细胞(MSCs)需满足以下条件: 1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长; 2 )MSCs表达CD105, CD73和CD90,不表达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA2DR; 3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。和其他来源的 MSCs一样HUMSCs呈长条梭形贴壁生长,表达CD73、CD90、CD105、CD166、CD10、CD13、CD29、CD44 及HLA2ABC ,不表达CD34、CD45、CD31等造血干细胞标记或CD33、CD14、CD56及HLA2DR、2DA、2DP、2DQ ,体外诱导培养能向多种成体细胞分化。比照这些条件,表明华尔通氏胶来源的间质细胞具有MSCs特性。HUMSCs还表达原始干细胞标记,如白血病抑制因子受体通路、胚胎干细胞特异基因Ⅰ及端粒逆转录酶及Nanog、STAT3、AP、Oct24、BMP4、PAX6、ADAM12、Nestin、HLA2Ⅰ。另外, HUMSCs低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD40 和CD40 l等。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制,并抑制T细胞的增殖,异体移植该细胞可产生免疫耐受性,表明其为一类免疫缺陷细胞,异基因移植不会发生免疫排斥反应。 3脐带间充质干细胞(UMSCs)的移植治疗作用: 骨髓MSCs用于改善心、脑功能的机制主要在于其分泌SDF一1和VEGF 等局部细胞因子, 诱导微血管的生成, 改善缺血组织微环境。UMSCs表达SDF 一1和VEGF, 提示了UMSCs治疗心脑梗塞、脊髓损伤的可能。 1)UMSCs对脑损伤的治疗作用 外源性UMSCs对脑组织的修复机理可能涉及到诱导内源性VEGF表达, 局部微血管增生, 抑制细胞凋亡等。利用液压冲击脑损伤模型, 证明

脐带血间充质干细胞体外分离_纯化及培养

脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养 陈 镭1,惠国桢2,栾文忠1,苗宗宁3,王 玲3,陆 华3,吴智远2,芦 奕2 (1.天津医科大学,天津,300070; 2.江苏省无锡市第三人民医院细胞实验室,江苏无锡,214019; 3.苏大学附属第一医院神经外科,江苏苏州,215006) 摘 要:目的 研究脐带血(HUCB)中含有的间充质干细胞(M S Cs)体外分离、纯化及培养条件,探究其作为种子细胞应用于实验和临床的可行性。方法 无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esen cult T M 作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层,用流式细胞仪检测M SCs 表面抗原。结果 来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞,间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达M SCs 相关的抗原(CD 29、CD 44、CD 166),但不表达造血细胞抗原(CD 34、CD 45),这与源于骨髓的M SCs 一致。结论 脐带血来源的M SCs 能在体外培养、扩增,而用于满足实验和临床的需要。 关键词:脐带血;间充质干细胞;体外培养 中图分类号:R 329 2 文献标识码:A 文章编号:1672 2353(2004)01 0012 03 THE ISOLATION PURIFICATION AND CULTURE OF HUCA MSCs CHEN Lei,HUI Guo zen,RUAN Wen zong,MIAO Zong ning,WANG Ling, LU HUA,W U Zhi yuan,LU Li (1.T ianj in M edical Univer sity ,T ianj in,300070;2.Cell Dep ar tment,T hir d H osp ital of W ux i ,W ux i ,Jiangsu ,2140001;3.Dep ar tment of Neurosur gery ,First A f f iliated H osp ital of Suz hou University ,Suz hou,Jiangsu ,215006) ABSTRAC T Objective:To investig ate the isolation,purification and culture of hum an umbil ical cord blood(HUCB)mesenchymal stem cells(M SCs)in vitro,and to observe the feasibility of using M SCs as seed cells in experiment and clinic.Methods:HUCB w ere collected from full term deliveries scheduled for cesarean section,all specimens w as obtained sterilely w ith preservative free heparin,the cord blood mononuclear cell w as isolated by lymphocyte separation medium,and puri fied and culture with M esencult T M medium and acidic environment to produce adherent layer,the surface antig en ex pression of MSCs was detected by flow cytometry.Results:The UCB derived mononuclear cells,when set in culture,gave rise to adherent cells,w hich ex hibited either an osteo clast or mesenchym al like phenoty pe,cells w ith the M SCs displayed a fibroblast like morpholog y and ex pressed several MSCs related antigens (CD 29,CD 44,CD 166),but did not ex press haematopoi etic cells antigens(CD 34,CD 45),which w as identical to human bone marrow derived M SCs.C on clusion:M SCs in H UCB can culture and expand in vitro,which could be regarded as an alternative source of MSCs for experimental and clinical needs. KEY WORDS umbilical cord blood;mesenchymal stem cells;culture in v itro 脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的 血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞和间充质干细胞(mesenchy mal stem 收稿日期:2003-12-16 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271325)、江苏省自然科学基金资助项目(BK2001170)作者简介:陈镭(1965-),男,天津市人,在读博士研究生。 12 实用临床医药杂志 Journal of Clinical M edicine in Practice 2004年第8卷第1期

胚胎干细胞体外诱导分化综述

胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要:由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能,因此,自20世纪90年代开始,对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词:胚胎干细胞;体外培养;诱导分化;应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下,它可以 分化成不同的功能细胞,形成多种组织和器官,它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞,后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力,并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力,能够维持机体功能的稳定,发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型,并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此,人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后,多年以来,人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法,在这里主要介绍三种: 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞(embryoblast),是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团(inner cell mass,ICM)分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异,因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团(ICM)细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞

卫生部办公厅关于印发《脐带血造血干细胞治疗技术管理规范(试行)

卫生部办公厅关于印发《脐带血造血干细胞治疗技术管理规 范(试行)》的通知 【法规类别】采供血机构和血液管理 【发文字号】卫办医政发[2009]189号 【失效依据】国家卫生计生委办公厅关于印发造血干细胞移植技术管理规范(2017年版)等15个“限制临床应用”医疗技术管理规范和质量控制指标的通知 【发布部门】卫生部(已撤销) 【发布日期】2009.11.13 【实施日期】2009.11.13 【时效性】失效 【效力级别】部门规范性文件 卫生部办公厅关于印发《脐带血造血干细胞治疗技术管理规范(试行)》的通知 (卫办医政发〔2009〕189号) 各省、自治区、直辖市卫生厅局,新疆生产建设兵团卫生局: 为贯彻落实《医疗技术临床应用管理办法》,做好脐带血造血干细胞治疗技术审核和临床应用管理,保障医疗质量和医疗安全,我部组织制定了《脐带血造血干细胞治疗技术管理规范(试行)》。现印发给你们,请遵照执行。 二〇〇九年十一月十三日

脐带血造血干细胞 治疗技术管理规范(试行) 为规范脐带血造血干细胞治疗技术的临床应用,保证医疗质量和医疗安全,制定本规范。本规范为技术审核机构对医疗机构申请临床应用脐带血造血干细胞治疗技术进行技术审核的依据,是医疗机构及其医师开展脐带血造血干细胞治疗技术的最低要求。 本治疗技术管理规范适用于脐带血造血干细胞移植技术。 一、医疗机构基本要求 (一)开展脐带血造血干细胞治疗技术的医疗机构应当与其功能、任务相适应,有合法脐带血造血干细胞来源。 (二)三级综合医院、血液病医院或儿童医院,具有卫生行政部门核准登记的血液内科或儿科专业诊疗科目。 1.三级综合医院血液内科开展成人脐带血造血干细胞治疗技术的,还应当具备以下条件: (1)近3年内独立开展脐带血造血干细胞和(或)同种异基因造血干细胞移植15例以上。 (2)有4张床位以上的百级层流病房,配备病人呼叫系统、心电监护仪、电动吸引器、供氧设施。 (3)开展儿童脐带血造血干细胞治疗技术的,还应至少有1名具有副主任医师以上专业技术职务任职资格的儿科医师。 2.三级综合医院儿科开展儿童脐带血造血干细胞治疗技术的,还应当具备以下条件:

人脐带间充质干细胞操作规范

人脐带间充质干细胞操作规范 一、人脐带间充质干细胞的分离和培养 1. 准备4~5个培养皿,打开放在超净台中,将消毒过的平剪×1,弯剪×2, 有齿镊子×4,放入超净台,紫外照射30 min,通风10 min; 2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水,在2#培养皿倒入25 ml酒精; 3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台,用弯嘴钳取出脐带放入1# 培养皿,清洗残留血渍,用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带 转移至2#培养皿,完全浸泡,计时1 min; 5. 将脐带转移至3#培养皿,用平剪剪成3 cm左右的小段,清洗脐带内的积血(如果积血较多,可再次转入另一加盐水的培养皿); 6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉,剥离华尔通氏胶,放入4#培养皿; 7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中,2000 rpm离心5 min; 8. 弃上清液,将胶 体倒入干净的培养皿中,用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中; 9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶,每瓶加入4 ml脐带有 血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF),水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀; 10. 第2天观察是否有污染,每3天换一次液,并观察细胞爬出情况(过程中 须注意平稳地拿放培养瓶,避免组织块发生移动); 11. 培养14天左右,倒去上清培养液,加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤,用0.25% 胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块,并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化; 12. 收集细胞及组织块悬液,2000 rpm离心5 min; 13. 弃上清液,加入适量生理盐水混匀,用70 μm滤网过滤去除组织块,即 得到P0代脐带间充质干细胞;

人脐血间充质干细胞来源的外泌体_分离鉴定及生物学特性_张娟

中国组织工程研究 第18卷 第37期 2014–09–03出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2014 Vol.18, No.37 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5955www.CRTER .org 张娟,女,1988年生,河北省玉田县人,汉族,内蒙古医科大学免疫学在读硕士,医师,主要从事干细胞的基础与临床应用研究。 通讯作者:王彩生,硕士,主任医师,内蒙古医科大学研究生学院,内蒙古自治区呼和浩特市 010110;呼和浩特市第二医院,内蒙古自治区呼和浩特市 010031 并列通讯作者:魏来,博士,教授,北京大学人民医院,北京大学肝病研究所,丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室,北京市 100044 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.37.009 [https://www.360docs.net/doc/2015317012.html,] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)37-05955-06 稿件接受:2014-07-31 Zhang Juan, Studying for master’s degree, Physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China Corresponding author: Wang Cai-sheng, Master, Chief physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China Corresponding author: Wei Lai, M.D., Professor, Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China Accepted: 2014-07-31 人脐血间充质干细胞来源的外泌体:分离鉴定及生物学特性 张 娟1,刘 峰2,张 薇2,丛 旭2,王彩生1, 3,魏 来2(1内蒙古医科大学研究生学院,内蒙古自治区呼和浩特市 010110;2北京大 学人民医院,北京大学肝病研究所,丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室,北京市 100044;3呼和浩特市第二医院,内蒙古自治区呼和浩特市 010031) 文章亮点: 1 研究发现间充质干细胞是通过旁分泌有效生物学活性物质外泌体在细胞间进行信息传递,进而通过某种机制发挥组织损伤修复作用。外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡,含有来源细胞的膜蛋白成分,可以选择性地将含有的蛋白质、RNA 等递送至受体细胞,调节细胞间的信号传导。故可将间充质干细胞来源的外泌体开发成为一种既具有间充质干细胞的作用特点,又能规避其不良分化和肿瘤形成缺陷的新型治疗手段。因此,通过间充质干细胞来源的外泌体促进组织损伤修复是今后具有重要探讨价值的研究方向。 2 分离提取及鉴定外泌体是进行深入研究的基础,实验主要通过超滤及差速离心法分离出外泌体,通过透射电镜及流式鉴定相结合来鉴定,为后续的外泌体功能研究奠定基础。 3偏倚或不足:人脐血间充质干细胞源性外泌体生物学功能及相关机制还需要进一步分析;人脐血间充质干细胞的外泌体最终要移入体内研究,所以尚需建立动物模型。 关键词: 干细胞;脐带脐血干细胞;外泌体;人脐血间充质干细胞;分离鉴定;活性 主题词: 胎血;间质干细胞;外泌体;膜蛋白质类 摘要 背景:外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡,越来越多的研究表明,间充质干细胞可能通过旁分泌外泌体而发挥对组织损伤的修复作用,目前人脐血间充质干细胞来源的外泌体分离鉴定尚未见报道。 目的:分离纯化人脐血间充质干细胞来源的外泌体,并鉴定其生物学特性。 方法:收集人脐血间充质干细胞培养上清,采用超滤及梯度离心法分离并纯化外泌体,通过透射电镜观察其形态,流式细胞术检测其表面标志 CD63、CD81、CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。 结果与结论:人脐血来源的间充质干细胞能够分泌外泌体,电镜下呈椭圆或碟状的囊泡结构,直径40-100 nm 。外泌体表达其共性表达标志CD63、CD81及间充质干细胞表面黏附分子CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。结果表明采用超滤及梯度离心法可以成功从间充质干细胞培养上清中分离纯化外泌体,间充质干细胞分泌的外泌体具有外泌体的胞膜蛋白组分。 张娟,刘峰,张薇,丛旭,王彩生,魏来. 人脐血间充质干细胞来源的外泌体:分离鉴定及生物学特性[J].中国组织工程研究,2014,18(37):5955-5960. Exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells: isolation, identification and biological characteristics Zhang Juan 1, Liu Feng 2, Zhang Wei 2, Cong Xu 2, Wang Cai-sheng 1, 3, Wei Lai 2 (1Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2 Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China; 3the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China) Abstract BACKGROUND: Exosomes are membrane vesicles secreted by mesenchymal stem cells. Increasing studies have shown that mesenchymal stem cells can secrete exosomes via paracrine function to play a role in tissue injury. However, reports on how to isolate and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells are few. OBJECTIVE: To extract, purify and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells. METHODS: The cell culture supernatant of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells was collected. Exosome was extracted and purified with ultrafiltration and gradient centrifugation methods. The morphology of exosome was observed by transmission electronic microscope, and the expressions of CD63, CD81, CD90, CD73, CD105, CD29, and CD166 in exosome of mesenchymal stem cells were analyzed by fluorescent activated cell sorting. RESULTS AND CONCLUSION: Mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood secreted exosome

小鼠胚胎干细胞培养实验步骤

细胞的原代培养 点击次数:540 作者:佚名发表于:2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出,分散成单细胞,在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞,如:动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物:孕鼠或新生小鼠 ? 液体:细胞生长液(内含20%小牛血清) 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材:灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 (1)胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。

b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒,取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口,用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部,取出含有胚胎的子宫,置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜(若胚胎较大,应剪去头、爪),将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎,去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 (2)胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中,用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎,直到成1mm3左右的小块,再用平衡盐溶液清洗,洗到组织块发白为止。 c. 静置,使组织块自然沉淀到管底,弃去上清。 (3)胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液,37℃中消化20-40分钟,每隔5分钟振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)。 c. 静置5-10分钟,使未分散的组织块下沉,取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm,离心10分钟,弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml(视细胞量),血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右,转移至25ml细胞培养瓶中,37℃下培养。 (4)胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养

脐带间充质干细胞(MSCS)抗衰老的临床实验

脐带间充质干细胞(MSCS)抗衰老的临床实验 作者:Simon Sun Isa Li 【摘要】目的:观察脐带间充质干细胞对人体衰老的影响和安全性,对比观察脐带间充质干细胞对衰老的逆转现象。方法:抽取20名健康人作为志愿者,进行脐带间充质干细胞静脉回输(其中男性6人,女性14人,年龄为50-80岁),实验组10名志愿者进行静脉滴注3个疗程脐带间充质干细胞,对照组滴注生理盐水。实验组和对照组志愿者均为双盲实验,疗程结束后3个月、6个月、12个月的对比观察。结论:治疗组有效率为90%,从外表、内分泌、精神状态、体能、睡眠均表现出有效性。 Abstract: Objective: To observe the effect and safety of umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) on human aging. Methods: a total of 20 healthy volunteers, of umbilical cord mesenchymal stem cells reinfusion (6 males, 14 females, aged 50-80 years old), the experimental group of 10 volunteers were intravenous infusion of 3 cycles of umbilical cord mesenchymal stem cells, the control group of normal saline drip. The experimental group and the control group were double blind experiment, 3 months after the end of treatment, and the observation of 6 months and 12 months. Conclusion: the effective rate of the treatment group was 90%, which was effective from the appearance, endocrine, mental state, physical fitness and sleep. 对抗衰老延长寿命是人类的梦想,但以往的方法以失败见终,究其原因均是不能针对衰老的根本原因所致。而人类衰老的原因一是衰老的细胞不能被代替,正常的新陈代谢因为干细胞的补充不足所致。随着干细胞和研究的发展,以及进行临床治疗中所带来的抗衰老表现,提示脐带间充质干细胞会对衰老的过程产生正影响,具有良好的市场应用价值。本实验就是采取双盲实验的方法来进行对证,验证MSCS对衰老的逆转影响。 脐带间充质干细胞(Mesnchymal Stem Cells,MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞,它能分化成许多种组织细胞,具有广阔的临床应

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