蛋白质相互作用的主要研究方法

蛋白质相互作用的主要研究方法

细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。

研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。

1 免疫共沉淀

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。

在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆抗体的使用有助于避免污染的产生。（2）要确保抗体的特异性。即在不表达抗原

的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。（3）确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的。这需要进行蛋白质的定位来确定。

免疫共沉淀试验也同样不能保证沉淀的蛋白复合物是否为直接相互作用的两种蛋白。例如E1A与p60的共沉淀就是间接的相互作用。其实际上是E1A与p107直接相互作用，而p107与p60直接相互作用的结果。与蛋白亲和色谱相比，免疫共沉淀试验的灵敏度不够高。这与抗原浓度较低有关，但如果使抗原过量表达，又会破坏相互作用的天然状态。

免疫共沉淀是检测蛋白质间相互作用的经典方法，也是较常用的方法。它的优点是：与蛋白亲和色谱一样，检测的产物是粗提物；抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的浓度存在，避免了过量表达测试蛋白所造成的人为效应；蛋白以翻译后被修饰的天然状态存在；复合物以天然状态存在。Schaerer与他的同事们利用免疫共沉淀技术研究了GABAA受体蛋白与多功能蛋白gC1q-R之间的相互作用，与酵母双杂交试验得到的结果完全相同。

其缺点是免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白，而是通过第三者间接相互作用的蛋白，另外，其灵敏度不及蛋白亲和色谱高，因为感兴趣的蛋白浓度不如后者高，这样驱动复合物形成的能力小。免疫共沉淀的结果初步提示PKCα和IGF1R可能发生相互作用。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。为了解决免疫沉淀的这些问题，本实验制备了高效价的抗体来提高其灵敏度，此外还加大蛋白质A或G以及抗体的量，并将最后得到的蛋白进行浓缩，以便尽可能地得到较清晰的电泳条带。同时，结合Far-Western blotting等技术就可以弥补IP技术的不足，来证明两种蛋白质是否直接作用。

2 Far-Western blotting

Far-Western印迹最初发明用于32P标记的谷胱甘肽S-转移酶(GST)-融合蛋白表达文库的筛选，现在则用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。最近几年，Far-Western还用于检测受体-配体相互作用以及相互作用蛋白文库的筛选。借助这种分析方法，使许多研究变成可能，如翻译后修饰对蛋白质-蛋白质相互作用

的影响，用合成的多肽作探针检测蛋白相互作用的序列、以及在无抗原特异性抗体的情况下识别蛋白质-蛋白质相互作用。

Far-Western印迹技术与Western印迹十分相似。在Western印迹中，运用抗体检测转移膜上的相应抗原。在经典Far-Western印迹中，运用经标记的或可被抗体检测的“诱饵”蛋白检测转移膜上的“猎物”靶蛋白。用SDS-PAGE（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）或非变性PAGE分离含有未知靶蛋白的样品（通常为细菌裂解液）然后转膜。靶蛋白附于转移膜表面时可以被检测到。转膜后，封闭膜，用一已知诱饵蛋白（通常用纯品）进行探测。诱饵蛋白与靶蛋白反应后，运用该诱饵蛋白的特异性检测系统即可检测出相应条带。

3 生物信息学

预测蛋白质间相互作用的生物信息学方法主要包括以下九种方法：系统发育谱(phylogenetic profile)、基因邻接(gene neighborhood)、基因融合事件(gene fusion event)、镜像树(mirror tree)、突变关联(correlated mutation)、序列信号关联(correlated sequence-signatures)、保守的蛋白间相互作用(interologs)、同源结构复合体(homologous structural complexes)、进化速率关联(correlated evolutionary-rate)。

以上描述的预测蛋白质相互作用的生物信息学方法还不完善，但预期是非常有前途的，特别是随着原始蛋白质组数据的积累，生物信息学注释手段的运用会愈显重要，相信会有更多的生物信息学算法开发出来。对目前已有的多种生物信息学方法的比较和评估是另一项急待开展的工作，遗憾的是，这方面的文献不多，主要原因是缺乏作为评估标准的高质量实验数据。因此，开发高质量的蛋白质相互作用数据库-分析工具-信息抽提方法，以及建立数据库之间信息交换的标准尤显重要。

4 酵母双杂交系统

20世纪80年代中、后期，真核转录因子得到大量深入的研究，这类研究最终促成了酵母双杂交系统的诞生。当时的研究发现，真核转录因子的DNA 结合区（DNA-binding domain，BD）和转录激活区（transcription activation domain，AD）

在功能上和实质上都是可分的。BD能把蛋白定位到基因组特定DNA序列上，AD 能够使转录装置激活基因转录。Brent 和Ptashne于1985年证实，将2种不同蛋白的BD与AD重组，仍能产生有活性的转录因子。该实验进一步说明了转录因子的特性。后来，一些研究人员发现AD和BD不必在1条多肽上。当这两个区域单独存在时均没有转录激活功能，但当它们在间上彼此联系时，则能够激活基因转录。Field和Song正是利用这一特性建立了酵母双杂交系统。转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由2个或2个以上相互独立的结构域构成。GAL4蛋白是1个基因转录激活子(由它激活转录的基因可以编码半乳糖苷酶)。它包括2个分离的功能性结构域：1个能结合特异DNA序列(UASG)的N末端结构域和1个包含酸性区域的C末端结构域，它是转录激活所必需的。双杂交系统是这样建立的：GAL4的DNA结合结构域，与X蛋白质融合；GAL4的激活结构域，与蛋白质Y融合；X和Y形成一个蛋白质复合物，重新形成GAL4结构域的邻近效应，即实现了转录因子功能重建，导致UASG调控的基因(报告基因)开始转录。他们当时还用2种已知的能与SNF1和SNF4互作的酵母蛋白质检验了这个系统，只有当2个融合蛋白都出现在1个细胞中时才能获得高的转录活性。

酵母双杂交的原理是将2个目的蛋白分别与AD和BD融合产生新的融合蛋白，如果这2个目的蛋白能够互相作用，则该相互作用会促使AD和BD 互相靠近而产生有活性的转录因子，进而激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录。在这以前,也有许多生物化学方法用来研究蛋白质间相互作用,但都是在体外研究,该系统可以在酵母这种生长迅速且易操作的体系中研究真核细胞的蛋白质-蛋白质相互作用,且通过cDNA文库筛选直接找到与未知蛋白质相互作用的蛋白基因。

酵母双杂交系统与其衍生系统的操作程序是类似的，其基本操作程序大体包括以下几个步骤：①选择合适酵母作为筛选未知蛋白的受体菌；②诱饵蛋白表达质粒的构建和鉴定；③诱饵蛋白自身转录活性分析；④猎物蛋白cDNA 文库的构建；⑤酵母双杂交筛选与阳性克隆鉴定。这是筛选相互作用蛋白的基本步骤，如果需要利用双杂交进行其他方面的研究，可根据不同试验目的进行相应地调整。

酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用

及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。

酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。

针对“假阳性”问题,研究者在实践中通过对酵母双杂交系统进行改进出现了双筛选系统和假阳性显示分析法等。另外,近几年来已初步建立了哺乳动物双杂交系统,它能更好地模拟细胞内环境,从而探明蛋白质相互作用的机理。同时,为了克服酵母双杂交系统中存在的第1个问题,这些年来,人们开始尝试使用其他蛋白的结构特点来建立新的双杂交系统。于是,一些不依赖于转录因子活性的新型双杂交系统相继建立,如分离的泛素系统、蛋白质片段互补分析、阻遏物重构分析和SOS 恢复系统等。此后在酵母双杂交系统基础上还发展出酵母单杂交系统、双诱饵系统、三杂交系统、哺乳类双杂交系统等多种方法，并且还出现了用大肠埃希菌做为替代的双杂交系统。

5 噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是一种噬菌体表面表达筛选技术,也是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术。在编码噬菌体的外壳蛋白基因上连上1个单克隆抗体的

基因序列,当噬菌体生长时,表面就会表达出相应的单抗,将噬菌体过柱,由于柱上含有目的蛋白,所以会特异性结合相应抗体。因此,噬菌体展示技术使得表达蛋白(表达型)和编码基因(基因型)之间完美的联系起来,而且,它也能很好地解决酵母双杂交系统中存在的问题。

噬菌体展示技术具有两点最显著的意义：一点是它引伸出了分子库(molecular repertoires)的概念；而另一点则是此项技术克服了研究蛋白质相互作用时需基于对其结构的详尽知识的限制,这也是使得该项技术得以愈来愈广泛运用的直接原因。目前,利用噬菌体展示技术构建随机肽库、蛋白质库和抗体库研究受体或抗体的结合位置,改造和提高蛋白质、酶和抗体的生物学和免疫学属性,研究用于检测治疗用途的新型多肽药物、疫苗和抗体等,都具有广阔的应用前景。

6 表面等离子共振

目前, 表面等离子体共振( Surface Plasmon Resonance) 技术已成为了当今一种全新的研究蛋白质之间相互作用的手段。

表面等离子体共振SPR生物传感器是利用表面等离子体共振现象和SPR 谱峰对金属表面上电介质变化敏感的特点,通过将受体蛋白固定在金属膜上,检测受体蛋白与液相中配体蛋白的特异性结合。SPR 技术的特点是测定快速、安全、不需标记物或染料及灵敏度高。其除了应用于检测蛋白质-蛋白质外,还可检测蛋白质-核酸及其他生物大分子之间的相互作用,并且能对整个反应过程进行实时监测。因此,SPR技术在检测生物大分子特异性相互作用上比传统的方法更具优势,其对基础理论、医学诊断及治疗等都具有十分重要的意义。

7 荧光共振能量转移(FRET)

采用标签法检测和分离蛋白的方法虽然有效但也存在缺点,比如说分离蛋白标签可以改变蛋白的溶解性并且不能在活体细胞中进行等。荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)是近年来迅速发展的一种新技术,其最大的特点就是可以在活体细胞生理条件下对蛋白质间的相互作用进行实时的动态研究,已成为现代蛋白质组学研究的有力工具。