67kD层粘连蛋白受体的克隆、表达及其对肝癌细胞侵袭能力的影响

ISS N 100727626C N 1123870ΠQ

中国生物化学与分子生物学报

Chinese Journal of Biochemistry and M olecular Biology

2004年6月20(3):335～340

67kD 层粘连蛋白受体的克隆、表达及其

对肝癌细胞侵袭能力的影响

郑大利,　黄清玲,　蒋雪梅,　彭碧文,　林建银

3

(福建医科大学分子医学研究中心,福州　350004)

摘要　探讨细胞膜表面67kD 层粘连蛋白受体(67kD laminin receptor ,67LR )在肝癌细胞侵袭转移中

的作用,从肝癌细胞中提取RNA ,通过RT 2PCR 扩增67LR 的前体———37kD 层粘连蛋白受体前体(37kD laminin receptor precurs or ,37LRP )基因并定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1Πmyc 2His (-)A ,采用脂质体将重组质粒转染到Hep G 2肝癌细胞中,通过G 418筛选和RT 2PCR 、流式细胞术鉴定,获得了细胞膜表面67LR 高表达(阳性率为69.2%)和低表达(阳性率为11.7%)的细胞克隆,采用体外细胞侵袭实验测定不同细胞的侵袭能力,发现膜表面67LR 高表达的细胞侵袭能力明显高于低表达及不表达细胞,说明67LR 在肝癌细胞侵袭转移过程中可能具有重要意义.收稿日期:2003206217,接受日期:2003208213

福建省重大科技项目(N o.992Z 214)和福建省教育厅B 类项目(N o.JB03170)资助

3

联系人:T el :(0591)3569300,E 2mail :jylin @https://www.360docs.net/doc/3e1533814.html,

郑大利,男,1973年5月生,硕士,讲师

Received :June 17,2003;Accepted :August 13,2003

Supported by M ajor Scientific and T echnogical Project of Fujian Province (N o.992Z 214)and B T ype Project of Education Department of Fujian Province (N o.JB03170)

3

C orresponding author T el :(0591)3569300,E 2mail :jylin @https://www.360docs.net/doc/3e1533814.html,

关键词　层粘连蛋白受体,肝癌细胞,克隆,表达,侵袭中图分类号　R735.7

Cloning ,Expression of 67kD Laminin R eceptor and Its E ffect

on I nvasiveness of H uman H epatocellular C arcinoma Cells

ZHE NG Da 2li ,H UANG Qing 2ling ,J I ANG Xue 2mei ,PE NG Bi 2wen ,LI N Jian 2yin

3

(Molecular Medicine Research Center ,Fujian Medical University ,Fuzhou 350004,China )

Abstract In order to explore the effect of 67kD laminin receptor on invasiveness of human hepatocellular

carcinoma cells ,37kD laminin receptor precurs or (37LRP )gene was am plified by RT 2PCR using the total RNA extracted from HCC cells.The recombinant plasmid was constructed with pcDNA3.1Πmyc 2His (2)A using Bam H Ⅰ,Nhe I and was trans formed into E .coli T op10.The positive clones were identified by restriction enzymes and DNA sequence analysis.The correct recombinant plasmid was trans fected into Hep G 2HCC cells and was screened by G 418.The expression of 67kD laminin receptor was detected by RT 2PCR and flow cytometric analysis.A high expression of membrane 67LR cell clone which positive rate was 69.2%(clone number :LR4)and a low one which positive rate was only 11.7%(clone number :LR6)were obtained and used to assay the invasion potential in a transwell culture chamber besides Hep G 2with or without being trans fected by pcDNA3.1Πmyc 2His (2)A.The LR4cells showed the highest invasion potential (P <01001),while the LR6cells and Hep G 2with or without being trans fected by pcDNA3.1Πmyc 2His (2)A had no significant difference (P >0.05).The results indicated 67LR had an im portant role in the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma cells.K ey w ords 67kD laminin receptor ,hepatocellular carcinoma cells ,cloning ,expression ,invasion

层粘连蛋白(laminin)是细胞外基质的重要组成成分,它与肿瘤细胞表达的层粘连蛋白受体相互作用,影响肿瘤细胞的生物学行为,其中67kD层粘连蛋白受体(67kD laminin receptor,67LR)与多种肿瘤的转移和预后具有密切的关系[1],因而受到越来越多的关注.发现67LR之后,又发现了一种37kD的胞浆蛋白.以黑色素瘤细胞为材料,用脉冲示踪实验证明,这种37kD的多肽是67LR的前体,因此称之为37LRP(37kD laminin receptor precurs or),通过翻译后加工,经过酰基化后,依靠分子内疏水作用形成同聚或异二聚体,才转变为成熟的67LR[2,3].编码37LRP的基因已经被克隆并进行了全序列分析,发现它与核糖体结合蛋白p40具有共同的序列,是同一蛋白,所以该蛋白也称为37LRPΠp40.近来研究发现,67LR与细胞外基质的降解[4]、肿瘤细胞的移动能力[5]以及肿瘤血管的生成[6]有密切关系.针对67LR或37LRP的抗体或反义核苷酸,可以抑制肿瘤的生长、转移[7].对67LR结构与功能的深入研究,层粘连蛋白及其受体在肿瘤转移过程中的作用将会得到进一步的阐明,并为控制肿瘤的转移提供一种有等效的方法.Carloni等[8]和郑大利[9]均发现,Hep G2肝癌细胞膜表面不表达67LR,为67LR的克隆与表达提供了很好的实验材料.本研究将67LR的前体基因克隆到真核载体pcDNA3.1并转染Hep G2肝癌细胞,并观察其对肝癌细胞侵袭能力的影响.

1　材料与方法

111　细胞

S M MC27721、Hep G2肝癌细胞均购自中国科学

院上海细胞生物学研究所细胞库,用含10%新生牛血清RPMI21640(G ibcoBR L)培养液,置于5%C O

2、饱和水汽、37℃培养箱中培养.转染后的细胞加100μgΠml新霉素(G418)进行筛选.

112　试剂

TRIZ O L试剂为G ibcoBR L公司生产,SuperScript One2Step RT2PCR with Platinum Taq酶kit、克隆载体pcDNA311Πmyc2His(-)A、工程菌T OP10、G418、脂质体LipofectAMI NE为Invitrogen公司产品,DNase (RNase free)为Clontech公司产品,T4DNA连接酶、碱性磷酸酶(CIP)、限制性内切酶Bam HⅠ、NheⅠ为NE B公司产品,D L22000DNA Marker为T aK aRa公司产品;PCR产物纯化试剂盒、小量质粒抽提试剂盒均为上海华舜公司产品,大量质粒抽提试剂盒(QI AGE N Plasmid Maxi kit)为QI AGE N公司产品,鼠抗67LR抗体(克隆号:Mu LC5)为NeoMarker公司产品,PE标记的山羊抗鼠IgG(H+L)为C oulter公司产品,Matrigel、(fibronectin)、Cell Culture Insert incorporating polyethylene tereohthalate(PET)track2 etched membrane(8μm pore size)为Becton Dickins on 公司产品,牛血清白蛋白为M BI公司产品,其余试剂均为国产分析纯.

113　引物设计与合成

RT2PCR引物(T able1)由上海博亚生物工程公司合成,其中克隆用的引物根据G enBank37LRP基因(基因号:BC005391)用DNAM AN410程序设计,上游引物含有NheⅠ酶切位点,下游引物含有Bam H Ⅰ的酶切位点,检测引物参考文献[9]设计合成.

T able1　Olig onucleotide primers used for RT2PCR analysis

Sequence of primers S ize of RT2PCR products(bp)Restriction enzymes used for con formation

37LRP (for cloning)5′2CT AG CT AG CATG TCCGG AG CCCTTG ATG TC23′

5′2CGGG ATCCT AAG ACCAG TCAG TGG TTGG23′

905Bam HⅠΠNheⅠ

67LR (for identification)5′2TG CAACAACAAGGG AG CTCAC23′

5′2TCCATCAACCATTTTTCCAT23′

450P stⅠ

β2Actin 5′2G TGGGG CG CCCCAGG CACCA23′

5′2CTCCTT AATTG TCACG CACG ATC23′

540TaqⅠ

114　目的基因的扩增

各取一瓶处于对数生长期的S M MC27721、Hep G2肝癌细胞,采用TRIZ O L试剂一步法提取细胞总RNA,电泳后确认RNA未被降解后用紫外可见分光光度计测定样品A

260及A280,根据A260将两样品总RNA稀释至相同浓度,各取011μg RNA用SuperScript One2Step RT2PCR with Platinum Taq kit进行一步法RT2PCR,50℃20min合成cDNA,94℃2 min预变性并活化Platinum Taq酶,之后按94℃变性30s,55℃退火45s,72℃延伸1min,进行30个循环的扩增,最后72℃延伸7min.RT2PCR产物用115%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定.

633中国生物化学与分子生物学报20卷

115　67L R重组质粒的构建、筛选和鉴定

PCR产物经115%琼脂糖凝胶电泳分离后割下

相应条带,用小量胶回收试剂盒按说明书回收DNA,用Bam HⅠ、NheⅠ对扩增产物、载体pcDNA311Πmyc2His(-)A进行双酶切,37℃酶切20h 后电泳分离,胶回收纯化DNA,载体用碱性磷酸酶CIP处理1h,用PCR产物纯化试剂盒浓缩DNA,最后用T4DNA连接酶将载体与目的基因片段连接起来.具体操作均按各自说明书进行.按常规方法将重组质粒转化大肠杆菌T OP10感受态细胞,在含氨苄青霉素(Am p,100mgΠL)的LB平板挑取单菌落,少量液体LB扩菌,用小量质粒抽提试剂盒抽提质粒, Bam HⅠΠNheⅠ双酶切,选取酶切结果相符的2个克隆送上海博亚公司进行DNA序列测定.

116　重组质粒转染H epG2肝癌细胞

将含有重组质粒及空载体的T OP10于含100 mgΠml氨苄青霉素的液体LB中大量培养,用QI AGE N Plasmid Maxi kit提取质粒,115%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定并测定A

260和A280.将Hep G2接种于12孔细胞培养板(Nunc公司)中,24h后各取2μg 67LR重组质粒或空载体质粒,加到50μl无血清的RPMI21640中,另取4μl LipofectAMI NE加入50μl无血清的RPMI21640中,室温静置5min后将二者混匀,室温静置20min,细胞培养液换成无血清的RPMI21640,每孔019ml,加入质粒2LipofectAMI NE混

合液.置于5%C O

2、饱和水汽、37℃培养箱中培养24 h后换成含10%新生牛血清RPMI21640培养液继续培养.67LR重组质粒、空载体各做3孔.

117　转染细胞的筛选、鉴定

转染后24h加入500mgΠL G418筛选转染细胞,隔天换液,直到长出细胞克隆,在显微镜下用胰酶消化,挑出克隆,移至12孔细胞培养板继续培养, G418筛选并再次挑取单克隆细胞,大量培养.67LR 的表达用RT2PCR及流式细胞术进行鉴定,具体方法按文献[9]进行,为了防止RNA中少量的DNA影响RT2PCR的结果,用TRIZ O L试剂提取的细胞总RNA在进行RT2PCR之前用DNase(RNase free)37℃处理1h,另外用PE标记的山羊抗鼠IgG(H+L)代替了FITC标记的兔抗鼠IgG.

118　体外细胞侵袭能力的测定

按参考文献[10]的方法并作适当的修改,PET 膜外侧均匀地涂上5μg每10μl fibronectin,风干,膜内侧涂上20μg每20μl的matrigel,风干,形成一层基质屏障,在24孔板加入011%BS A2无血清RPMI21640,每孔600μl.处于对数生长期的细胞用胰酶消化,500g离心5min,重悬于011%BS A2无血清RPMI2 1640,终浓度为1×106Πml,将细胞悬液加入到Transwell小室中,每小室200μl,将小室浸入24孔板的条件培养液中,置于5%C O

2、饱和水汽、37℃培养箱中培养24h,将PET膜取出,甲醇固定1min,擦去未穿过膜的细胞,HE染色,于400倍显微镜下计数侵袭细胞数,每膜计数上中下左右5个不同视野的侵袭细胞数,计算平均值,每组重复3次.

2　结果

211　目的基因的扩增

用TRIZ O L试剂分别从S M MC27721、Hep G2肝癌细胞中提取总RNA,在上述反应条件下经RT2PCR 扩增、115%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定,均可见大小约900bp的条带,

符合预期大小

(Fig.1).

Fig.1　Identification of RT2PCR product and recombinant plasmid

37LRP2pcDNA3.1Πmyc2H is(-)A by restriction digestion

1,2:Recombinant plasmid37LRP2pcDNA3.1Πmyc2H is(-)A

digested by Bam HⅠΠNheⅠ;3:Recombinant plasmid37LRP2

pcDNA311Πmyc2H is(-)A;4:pcDNA311Πmyc2H is(-)A

digested by Bam HⅠΠNheⅠ;5:pcDNA311Πmyc2H is(-)A;6:

G el extraction of37LRP RT2PCR product digested by Bam HⅠΠ

NheⅠ(band was too weak to be seen in the phtotography);7:

37LRP RT2PCR product;8:DNA m olecular marker(D L22000)

212　重组质粒的筛选与鉴定

将目的基因定向克隆到pcDNA311Πmyc2His A (-)质粒中,转化到E1coli T OP10感受态细胞中,在含Am p的LB平板中可见多个单菌落,挑取2个单菌落,液体LB振荡培养10h,抽提质粒,用Bam H ⅠΠNheⅠ双酶切后产生两个片段,大小分别与酶切后的载体、PCR产物大小相符合(Fig.1),经DNA序

733

第3期郑大利等:67kD层粘连蛋白受体的克隆、表达及其对肝癌细胞侵袭能力的影响　

列测定,发现S M MC27721、Hep G2两株肝癌细胞的67LR前体基因DNA序列完全一致,且与文献完全符合,说明这些重组子确实是含有37LRP基因片段

的重组克隆.

213　转染细胞的筛选和鉴定

按上述方法将重组质粒转染Hep G2肝癌细胞后,经G418筛选,14d后12孔细胞培养板上可见G418抗性的Hep G2细胞形成克隆,经2次筛选后转染37LRP重组质粒的Hep G2细胞共挑出16个克隆(分别命名为LR1～16),转染空载体的Hep G2细胞共挑出8个克隆(分别命名为K ong1～8).经RT2 PCR扩增,凝胶经G eneSnap(SynG ene,Version 5100109)成像后用G eneT ools(SynG ene,Version 3100122)进行半定量分析,发现所有转染37LRP重组质粒的Hep G2细胞其67LR基因mRNA水平的表达(67LRΠβ肌动蛋白的比值)均明显高于转染空载体及未转染的Hep G2细胞(Fig.

2

,T able2),但采用

流式细胞术分析发现细胞膜表面67LR的表达仅LR4显著增高(6912%),大大高于转染空载体 (6150%)及未转染的Hep G2细胞(5112%),而其他克隆细胞膜表面67LR的表达仅在5%～15%之间,无显著差别(Fig.3).

Fig.2　Expression of67LR mRNA by RT2PCR

1:DNA m olecular marker(D L22000);2:LR14;3:LR7;4:LR6;

5:LR4;6:LR3;7:K ong23;8:Hep G2(the upper band wasβ2

actin,the lower one was67LR)

Fig.3　Flow cytometric analysis for surface expression of67LR

(A)C ontrol of Hep G2cell;(B)Hep G2cell;(C)K ong23cell;(D)LR3cell;(E)LR6cell;(F)LR7cell;(G)LR4cell;(H)LR14cell

214　67L R对H epG2肝癌细胞侵袭能力的影响选择未转染的Hep G2、转染空载体的空3、细胞膜67LR低表达的LR6(阳性率为1117%)、细胞膜67LR高表达的LR4(阳性率为6912%)四种细胞进行体外侵袭实验(Fig.4).结果发现Hep G2、空3、LR6的侵袭能力很弱,而LR4的侵袭能力明显增强(P< 01005),结果如T able2所示,说明67LR在肝癌细胞的侵袭转移过程中具有重要的作用.T able2　Expression of67LR and invasion potential

Cell T rans fected with

Expression of

67LR mRNA

(67LRΠβ2actin)

P ositive rate

of membrane

67LR(%)

Invasion

potential

(cellsΠfield,

x±s) Hep G2none111951124140±3129 K ong23

pcDNA311Πmyc2H is

(-)A

112661506180±3190 LR6

37LRP2pcDNA311Π

myc2H is(-)A

116911177160±6139 LR4

37LRP2pcDNA311Π

myc2H is(-)A

116169128714±1518

833中国生物化学与分子生物学报20卷

Fig.4　The invasive cells in the lower surface of PET membrane(HE,400×) (A)K ong23;(B)LR4

3　讨论

67LR实际上是由同一基因表达的具有多功能的蛋白质,既可以介导细胞与细胞外基质的粘附作用,又可以作为核糖体的一种组成成分,参与了核糖体的组装、成熟过程[11],同时又与肿瘤的多药耐药性有关[12],而且在生物进化过程中具有严格的保守性,提示该蛋白可能具有更为重要的生物学功能.本实验室研究发现细胞膜表面67LR的蛋白量与其mRNA的表达并无对应关系,在Hep G2细胞中37LRP mRNA的表达水平稍高于S M MC27721肝癌细胞,但Hep G2细胞膜表面基本不表达67LR蛋白,而S M MC27721细胞67LR的阳性率为3417%,这可能是由于不同细胞中67LR基因结构的不同或者其翻译、翻译后加工及投送(s orting)的机制可能有较大的差异[9],本研究分别从S M MC27721、Hep G2两株细胞中提取RNA,利用37LRP的特异引物进行RT2PCR,并将扩增产物定向克隆到pcDNA311中,经DNA序列分析发现,这两株细胞37LRP基因的编码区序列完全一样,提示67LR mRNA的表达与细胞膜表面蛋白水平的不对应性主要是由于其翻译、翻译后加工及投送的机制存在较大的差异.经过转染后,本研究获得16个细胞克隆,其mRNA的表达均明显升高,但绝大多数细胞克隆无法或很少将67LR定位到细胞膜表面,只有一个细胞克隆能高水平地表达膜表面67LR,同样也说明不同细胞67LR的翻译后加工及投送的机制可能存在差异,这些机制有待进一步深入研究.

pcDNA311Πmyc2His(-)A是一种穿梭载体,有多个较常见的多克隆位点,可以在细菌中复制、扩增,具有氨苄青霉素的筛选标志,同时可以在真核细胞中复制并表达外源基因,具有G418的筛选标志,是种常用的真核表达载体.本研究以pcDNA311Πmyc2 His(-)A为载体,构建了37LRP2pcDNA311Πmyc2His (-)A的重组质粒,采用脂质体转染Hep G2肝癌细胞,并从中筛选出细胞膜表面67LR低表达和高表达的细胞克隆,目前国内外尚未见相关报道,为进一步深入研究67LR的结构与功能提供了很好的实验材料.

Zheng等[13]发现,转移性肝癌67LR无论在蛋白水平还是在mRNA水平均显著高于非转移肝癌;在胃癌组织中,67LR阴性患者5年生存率为7216%,显著高于67LR阳性患者(4616%),且肿瘤浸润深度与67LR存在密切的关系[14];K im等[14]用laminin筛

933

第3期郑大利等:67kD层粘连蛋白受体的克隆、表达及其对肝癌细胞侵袭能力的影响　

选粘附型和非粘附型结肠癌亚克隆,发现laminin粘附型亚克隆比非粘附型具有更强的致癌性,两者67LR的mRNA及蛋白含量都没有明显的差别,但是前者67LR主要定位在细胞膜,后者主要定位在细胞质,而且通过laminin亲和层析柱发现前者的细胞抽提液中有更多的67LR能与层析柱结合[15].本研究发现,Hep G2肝癌细胞本身基本不表达67LR,其体外侵袭转移能力也很弱,而转染67LR后获得的细胞膜表面67LR高表达的细胞克隆,其体外侵袭能力明显增强,说明67LR在肝癌细胞侵袭转移过程中可能具有重要作用.不过层粘连蛋白与细胞膜表面67LR的相互作用不仅与67LR表达量有关,而且还与其加工修饰有关.本实验室研究发现,L202正常肝细胞膜表面67LR的表达明显高于S M MC2 7721肝癌细胞,但它与laminin的结合能力却明显低于后者,而且这种差别很可能是由于二者67LR糖链结构的差异所致[16,17].肿瘤细胞侵袭转移不仅与67LR的表达、细胞定位有关,而且可能还涉及到67LR翻译后加工修饰尤其是糖链结构.

肿瘤转移是一个复杂的、连续的、多步骤的过程.在肿瘤细胞转移过程中,涉及到各种因素,其中肿瘤细胞与基膜的作用是关键性因素.肿瘤细胞穿过基膜首先利用自身表达的基膜受体与基膜的相应成分(如Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤粘连蛋白等)结合,然后粘着的肿瘤细胞分泌破坏基质的水解酶,使局部基膜溶解.Ardini等人发现67LR与其配体laminin21或者其功能片段结合后可以引起半胱氨酸蛋白酶分泌增加,laminin21的水解加速,并产生一种新的水解片段参与细胞的体外侵袭[4].Vande Broek 等人也发现laminin与67LR的相互作用与细胞迁移能力密切相关[5].本研究发现,细胞膜表面67LR高表达的肝癌细胞体外侵袭能力明显增强,这可能也是由于67LR与laminin相互作用后促进了细胞外基质的降解以及细胞移动能力的增强所致,具体机制有待于进一步阐明.

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