英中_微藻(四爿藻)细胞悬浮液的剪切应力切向流过滤系统_ 泵的作用

微藻(四爿藻)细胞悬浮液的剪切应力切向流过滤系统:

泵的作用

P. Jaouen*, L. Vandanjon, F. Qu6m6neur

ISOMer, Institut des Substances et Organismes de la Mer, Centre de Recherche et de Transfert de Technologie,

Laboratoire de G~nie des ProcOd6s,

Boulevard de l'Universit~, BP 406, 44 602 Saint-Nazaire CMex, France

摘要

微滤是细胞收集广泛使用的技术。相对脆弱的微藻需要选择合适的泵送系统。四爿藻, 作为一种运动能力非常强的藻,为这项研究提供了一个有趣的模板。本文研究了各种泵对于藻的损伤,在一个封闭循环系统中,这种损伤是通过观察藻类悬浮液在系统中的循环次数来测量的。离心式或旋转叶片式容积泵可能导致微藻的减少。与此相反,电子显微镜观察显示,在浓缩过程中使用偏心转子泵或蠕动泵,微藻不被破坏。

关键字:微藻 ; 泵剪切效果 ; 切向流过滤 ; 四爿藻

1、前言

海洋微藻生物技术的利用取决于经济和收获技术的技术适用性(Mohn,1980)。微藻悬浮液离心分离往往是相当有效的,但是昂贵,且离心作用导致细胞损伤。絮凝可引发毒性作用,如造成对生物质的化学污染(坎内尔,1990)。由于这些原因,对于脆弱物种的浓缩,低剪切微滤可能是一种替代方案(Walsh等,1986; Petrusevski 等人,1995)。

在这项研究中的首要任务是在浓缩过程中,要保证活细胞的完整性和活性。以四爿藻为模板,本文对各种泵剪切应力对藻的影响进行了研究,四爿藻具有4根脆弱的鞭毛。

2、方法

2.1 生物材料

在卢瓦尔河地区(大西洋海岸,法国),有一种海洋微藻,四爿藻(表1),因其(潜在的)工业利用价值,特别受到重视。

由于其成分(蛋白质,维生素,色素等),四爿藻(T.suecica)以营养丰富而闻名,并且需求量很大。四爿藻还为滤食性软体动物的毒理学研究提供了一种选择(Amiard-Triquet,1990)。例如,对重金属在食物链中转移进行实验研究,涉及生产足够数量的这些微藻及其浓缩来饲养更高营养级的海洋生物。从技术上讲,切向微滤可以应用到野外,但为获得更高品质的浓缩的产品,需要对泵的选择进行优化(Jaouen,1989)。

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表1 四爿藻的特性

2.2 剪切过程和评估

用切线微滤进行浓缩微藻时,由于藻细胞要多次通过泵和节流阀或流量控制阀(图1(A)),细胞承受强烈的剪切应力,剪切引起细胞破裂,继而造成生物物质质量的损失。因为细胞碎片堵塞滤孔,膜污染也增加了(Shimizu等,1994)。

在以前的工作中,阀门的剪切作用对于其他微藻或动物细胞的影响(Vandanjon等人,1995)已被研究。在这里,我们对泵的选择进行了研究。本文共对八个泵进行了测试,四个泵的输出流量为1L/min(表2),其余四个泵的输出流量为12L/min(表3)。

低输出的泵对于驱动实验室的小型单元(小体积浓缩,二次浓缩阶段)是有意义的。高输出的泵通常用于驱动0.5到1.2米的膜表面单元,适合于水产养殖的工业生产中。

按照如下方法,对泵体内剪切的影响进行了评估(图1(B)):

1、在20°C,选定一种泵并固定其输出量,在一个封闭回路中对5L体积的浮游植物循环培养

2、在这个过程中,进行初始采样、常规采样和计数,以评估细胞的运动能力(微藻自行运动的能力)的损失。

3、取样在循环系统中泵的出口处进行,取样量相对于5L培养体积,可以忽略不计。

4、不添加固定剂,因为样品是在采集后,用光学显微镜(型号为Leitz Laborlux)立即进行的。先对不动的细胞进行计数,然后用一种化学固定剂进行固定化后,再对所有的细胞进行计数,这样即可得到活动微藻的数量。

5、循环培养细胞悬浮液,直到最初运动能力的损失(%)达到恒定。

须指出的是,在某些情况下,剪切效应的评估比较容易,因为每个细胞处在完全静止或运动的状态。在其他情况下,固定化细胞的百分比估计是比较困难的,因为它们中的一些在几乎察觉不到的方式振动,而其他的则移动得非常缓慢。在这项研究中,只有完全不动的藻细胞被视为是不具有运动能力的。

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图1(A)典型的切向过滤过程:泵和阀门诱发严重的剪切效果(在微滤或超滤模块以及在管道的剪切一般可

以被忽视)。(B) 用于研究不同泵剪切作用的实验设置。

表2 小泵的特性

表3 大泵的特性

为控制生物物质的质量,在Laboratoire d'Histophysiologie Fondamentale et Appliqu ée de l'Universit é de Paris VI (法国),使用投射电镜对四爿藻进行了观测。培养

样品的处理采用了一种加甘油的方法(Meryman Hornbiower ,1977),该方法由Amiard-Triquet (1990)修正以用于微藻,并存储于-20℃。

3、结果与讨论

3.1 各种泵的剪切对藻类的影响

在先前指定的条件下对不同的泵进行测试。图2(Q =1L/min)和图3(Q =12L/min)显示了两种循环流量下的实验结果。每个点代表平均三到五个实验结果的平均值,误差线代表误差范围,由极端值(最小值和最大值)确定。

由此可以得出结论,细胞对于剪切效应是敏感的,“理想的”泵(特别是在12L/min的情况下)不存在。值得注意的是,最猛烈的泵一般是最便宜的(离心泵)。

在光学显微镜的观察中未发现任何细胞的损伤,即使是在最不利的情况下(例如:旋转叶片泵,12L/min)。在这种情况下,进一步的实验表明,仅仅造成藻细胞的疲劳,但没有打死。休息5小时后,大约40%的细胞恢复其最初的运动能力。

此外,关于通过次数的规定并非完全满意。对于一个给定的类型的泵(螺旋杆),在系统中循环相同次数的情况下,我们确认,用失去运动能力藻的比例度量的剪切效应是泵旋转速度的函数,所以也是输出流量的函数(图4)

总之,偏心转子和螺旋杆的泵是最温和的,并可能被用于大体积的浓缩。为实现小模块的浓度,蠕动泵,隔膜泵似乎比螺旋杆泵更适合,因为其较低的闭死容积(尽管他们的性能有限)。

初始运动能力的损失(%)

图2 低流出泵的剪切效应(1L/min)。离心:1次初始采样,然后每10分钟采样/计数1次。其他泵1次

初始采样,然后每隔60分钟采样/计数1次。

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初始运动能力的损失(%)

图3 高流出泵的剪切效应(12L/min)。1次初始采样,然后每30分钟采样/计数1次。

图4 螺旋杆泵中不动细胞——通过泵次数。转速的影响由出流量度量(12L/min和6L/min)。

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指出旋转叶片泵体中的强剪切效应,可能对细胞研磨有重要意义。在这些条件下,泵可以用于提取微藻和蓝藻的细胞内化合物。离心泵似乎是最具破坏性的泵之一。这可以解释为存在一个内部泄漏K(图5),这是每完成一次循环,一个细胞在泵体内转的圈数 (Vandanjon,1997)。K的数学表达方程

:

其中V ip是泵体的内部体积(cm3),Cyl 是容量(cm3),它代表泵旋转一次所产生的流量。

图5 一台离心泵的内泄露。如有(每循环一次,每个每个细胞要在泵体内旋转几次)

对压力的影响也进行了研究。将培养置于3或5bar压力下2个小时后,在静止状态下没有影响。当他们被置于3bar压力下4小时时,所有的细胞失去运动能力。在这些情况下,该现象是不可逆的,即使经过几个小时的休息,没有细胞恢复它的运动能力。在切线微滤模块中,反复挤压和释放

会放大压力的有害影响

(Lange-Chèze,1994)

图6 压力影响的评价,封闭的加压罐用于实验。

3.2 生物质质量的评估

用温和的偏心转子泵进行切向微滤(Jaouen等,1989)后,生物质的质量比较理想,可以用于新培养的接

种体。投射电镜观察表明藻体细胞比

未受损(图7),且覆盖鞭毛生长区的外部纤维也未发生改变(图8)。在温和的水动力学条件下,较好的性能和

浓缩质量表明低剪切微滤很有前景。

本文的研究结果与Gudin和Thépénier(1986)的研究结果相类似。

他们发现通过使用容积泵代替离心

泵,光反应器的产率可以提高2倍。

不过,他们指出,当输出量在

10-20m3h-1以上时,偏心转子泵(本

文中最温和的泵)不适于脆弱物种的

输送。此时,空气提升泵可能是个合

适的选择。

致谢:

作者感谢J.-C. Amiard博士、C.

Amiard-Triquet 博士和 C.

Marcaillou的科学和技术支持。

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图7.用偏心转子泵浓缩后的四爿藻。放大后细胞壁(箭头端)与对照组的细胞壁一致(此处没有给出)。注意完整保存的纤维多层结构。p.m:plasma

membrane(细胞质膜);s:starch(淀粉)。

图8.四爿藻。从前部顶穴的角度可见覆盖鞭毛生长区区域的完好的外部纤维(箭头)。对内部膜系统的损坏主要是由热变化或存贮中的冲击的影响。s:starch(淀粉);Ly:lysosome(溶酶体);V:vacuole(液泡);箭头端,细胞壁。

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