croRNA的筛选、靶分子的预测、构建和鉴定
万方数据
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１．２．４ｍｉＲ－５６８的真核表达载体的构建根据ＧｅｎＢａｎｋ中查
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１．２．６构建靶分子荧光素酶报告质粒根据ＧｅｎＢａｎｋ中查找的ｍｉＲ－５６８的靶分子３７ＵＴＲ序列，采用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０软件设计引物，使扩增后的产物两端具有ＥｃｏＲＩ和风ｆＩ酶切位点，引物设计为：ＮＦＡＴ５：８ｅ船ｅ５’?眦ＡＡｒｒｃＡＧｃｃＡＴ－
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１．２．７荧光素酶实验验证ｍｉＲ－５６８的靶分子将ｐｃＤＮＡ３－ｍｉＲ－５６８以及对照ｐｃＤＮＡ３与构建好的含有靶分子荧光素酶报告质粒、质粒ｐＲＬ－ＴＫ共转染ＨＥＫ２９３细胞，测定荧光素酶活性的变化。
图２Ｊｕｒｋａｔ细胞活化前后ｍｉＲＮＡ差异表达的基因谱
２．２ｍｉＲＮＡ的实时定量ＰｅＲ检测结果分别提取活化前后Ｊｕｒｋａｔ细胞的总ＲＮＡ，定量后反转录，并进行实时定量ＰＣＲ检测，结果显示：活化后的Ｊｕｒｋａｔ细胞，ｈａｓ—ｍｉＲ－２０２｝、ｈａｓ—ｍｉＲ－３３ｂ、ｈａｓ－ｍｉＲ－５６８和ｈａｓ－ｍｉＲ－５７６的基因表达均显著下调，与ＥｘｉｑｏｎｍｉＲＮＡ基因表达谱芯片检测结果一致（图３）。
图３ｈａｓ．ｍｉＲ一２０２｝、ｈａｓ－ｍｉＲ－３３ｂ、ｈａｓ—ｍｉＲ－５６８和ｈａｓ．ｍｉＲ－５７６的实时荧光定量ＰＣＲ
２．３ｍｉＲ－５６８重组真核表达载体的构建及鉴定应用设计的ｐｒｉ—ｍｉＲ５６８的基因序列扩增引物，ＰＣＲ扩增出目的基因片段，都与预期大小一致（图４）。重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ｍｉＲ－５６８经ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳显示了大小正确的基因片段（图５），经测序证实，ｍｉＲ－５６８的重组真核表达载体构建成功。
２结果
兰！Ｅ菇ｑ伽？Ｒ。Ｎ、Ａ．苎！耋达谱芯片检罂竺ｒ＋ｋａ．ｔ．竺竺雪竺图４ｌｎｉＲ－５６８基因ＰｃＲ产物琼脂糖凝胶电泳前后ｍｉｃｒｏＲＮＡ表达谱变化ｍｉｅｒｏＲＮＡ基因芯片结果显示ｉＤＬ２０００。二：ｊ：ｍｉＲ－。５６８…．”一…～…。（图１）。在Ｊｕｒｋａｔ细胞活化以后，ｍｉＲ－２０２｝、ｍｉＲ－３３ｂ、ｍｉＲ一
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图ｌ活化前后Ｊｕｒｋａｔ细胞ｍｉＲＮＡ基因差异表达分析散点图红色的点代表上调大于２倍的基因，绿色的点代表下调大于０．５倍的基因，蓝色的点表示无明显差异表达的基因．图５质粒ｐｃＤＮＡ３－ｍｉＲ５６８的酶切鉴定结果
Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；１：ｐｃＤＮＡ３－ｍｉＲ－５６８．
２．４预测ｍｉｌＲ－５碣的靶分子
利用ｍｉｒａｎｄａ软件，预测
万方数据
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ｍｉＲ－５６８的靶基因数目为３９７１，其中与Ｔ细胞活化信号通路密切相关的靶基因有：ＮＦＡＴ５（活化Ｔ细胞核因子５）、ＣＤ８Ｂ（ＣＤ８分子Ｂ链）和ＲＡＣ３（Ｒａｓ相关的Ｃ３肉毒素底物３）。２．５靶分子的荧光素酶报告质粒的构建和鉴定
以Ｊｕｒｋａｔ细
胞总ＲＮＡ反转录得到的ｅＤＮＡ为模板，扩增出ｍｉＲＮＡ靶分子３’ＵＴＲ中ｍｉＲＮＡ结合位点上下游部分片段，琼脂糖凝胶电泳证实片段大小都与预期长度相符（图６）。将ＰＣＲ产物分别连入ｐＧＬ３－ＭＣＳ２，转化，挑取阳性克隆，经ＥｃｏＲＩ和风ｔＩ双酶切鉴定，得到片段大小也都与预期长度相符（图７），经测序证实含有靶分子的荧光素酶报告质粒构建成功。
图６靶分子的ＰＣＲ扩增琼脂糖凝胶电泳
Ｍ：ＤＬ２０００ｌｌｌｓｌ＇ｋｅｒ；１：ＲＣＡ３，２：ＣＤ８Ｂ，３：ＮＦＡＴ５
图７靶分子的荧光素酶报告质粒酶切鉴定结果
Ｍ：ＤＬ
２
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ｍａｒｋｅｒ；１：ｐＧＩ．３一ＭＳＣ２一ＲＣＡ３；２：ｐＧＬ３一ＭＳＣ２一ＣＤＳＢ；
３：ｇ；Ｌ３－ＭＳＣ２－ＮＦＡＴ５．
２．６
荧光素酶实验结果靶分子的荧光素酶报告质粒构建
成功后，我们将ｐｃＤＮＡ３－ｍｉＲ－５６８或对照ｐｃＤＮＡ３与含有靶分子的荧光索酶报告质粒共转染ＨＥＫ２９３细胞，转染４８ｈ后分析荧光素酶活性。结果发现，在ＨＥＫ２９３细胞中，当共转染了质粒ｐＣＤＮＡ３?ｍｉＲ－５６８和ｐＧＬ３－ＭＳＣ２－ＮＦＡＴ５后，荧光素酶的活性有明显降低。提示ＮＦＡＴ５可能是ｍｉＲ－５６８作用的一个靶分子。
３讨论
有研究发现，ｍｉＲＮＡ在线虫、果蝇、植物、脯乳动物、甚至病毒中广泛存在，在各个物种间具有高度的进化保守性。ｍｉＲＮＡ在表达上具有组织和时间的特异性，是调节其他功能基因表达的重要调节分子，在生物体的各种生命活动过程中发挥着重要作用，参与生命过程中一系列重要进程，包括发育进程、造血过程、器官形成、凋亡、细胞增殖和肿瘤的发生。
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适应性免疫是免疫系统在进化过程中形成的针对特定抗原物质的高度专一性的防御机制，包括以Ｔ细胞为主的细胞免疫和以Ｂ细胞为主的体液免疫。在这个复杂的系统中ｍｉＲＮＡ发挥着巨大的作用悼。】。进一步深入研究ｍｉＲＮＡ在Ｔ细胞活化和分化过程中的生物学功能有助于我们更好的调控适应性免疫应答。
在本试验中，为了探询Ｔ细胞活化是否对ｍｉＲ—ＮＡ的表达谱产生影响，我们应用ＥｘｉｑｏｎｍｉＲＮＡ基因表达谱芯片，以活化的Ｊｕｒｋａｔ细胞（用ＣＤ３抗体和ＣＤ２８抗体双信号活化）为实验组，未活化Ｊｕｒｋａｔ细胞为对照组，分析了二者ｍｉＲＮＡ表达谱的差异，找出表达水平显著改变（下调超过２倍）的ｍｉＲＮＡ。芯片结果显示，与未活化的Ｊｕｒｋａｔ细胞相比，活化的Ｊｕｒｋａｔ细胞中有４种ｍｉＲＮＡ表达水平明显下调。为了进一步验证芯片结果的可靠性，我们对下调的
ｍｉＲＮＡ进行实时定量ＰＣＲ检测，最终分析结果与芯片结果相符。通过ｍｉＲａｎｄａ软件（ｍｉＲａｎｄａ是Ｅｎｒｉｇｈｔ等于２００３年５月开发的第一个ｍｉＲＮＡ靶基因预测软件，该软件可以很好的预测人的ｍｉＲＮＡ的靶分子），我们预测了ｍｉＲ－５６８在Ｔ细胞活化过程中的潜在作用位点，包括：ＮＦＡＴ５（活化Ｔ细胞核因子５）、ＣＤ８Ｂ（ＣＤ８分子１３链）和ＲＡＣ３（Ｒａｓ相关的ｃ３肉毒
素底物３）。为了验证这些预测的靶分子是否为ｍｉＲ－５６８作用的真正靶分子，我们将预测的靶分子的３’ＵＴＲ中ｍｉＲＮＡ结合位点上下游的部分序列导人ｐＧＩ．３一ＭＣＳ２荧光素酶表达载体中，构建报告系统；分别将ｐｃＤＮＡ３一ｍｉＲ－５６８与含有靶分子的荧光素酶报告质粒共转染ＨＥＫ２９３细胞，进行荧光素酶实验。结果显示：ｍｉＲ－５６８对ＮＦＡＴ５比较明显的抑制作用，提示ｍｉＲ－５６８可能通过ＮＦＡＮ５对Ｔ细胞活化起到一定的作用。
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