免疫胶体金标记手册

浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班

技术资料

胡东维洪健徐颖

浙江大学

2001年10月

一、胶体金的制备

根据不同的制备方法,可以制备出直径1-500nm的胶体金粒子,但做为免疫标记探针,其直径应在3-30nm范围内。

在氯化金(HAuCl4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂,可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的1/8。

以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径3~16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄,而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1~0.2%的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。

利用柠檬酸为还原剂,可以制备12~150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时,胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。

除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金,它避免了单宁酸残基的问题,但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理,故该方法已经很少使用。

氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(0.5g或1g),因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存(-20℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时,烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。

制备好的胶体金保存寿命较长,可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。

1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3~16 nm胶体金

(1)取一250 ml三角瓶,加入79 ml双蒸水和1 ml 1%氯化金,预热至60~70℃。

(2)取一50 ml烧杯,加入4 ml 1%柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加入不

同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60~70℃。K2CO3的作用是保持

溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时,对pH的影响不大,K2CO3

可以省略。

(3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀,加热至沸并保温10分钟。自然冷却。

柠檬酸钠(ml )

单宁酸( l ) 胶体金(nm ) 4

5000 3 4

2000 4 4

500 6 4

120 8 4

70 10 4

10 16

2、白磷还原法制备5 nm 胶体金

(1) 取250 ml 三角瓶一个,加79 ml 双蒸水,1 ml 1%氯化金,并用0.25 M K 2CO 3将

溶液调至中性(pH7.0)。

(2) 取0.2 ml 饱和磷/乙醚溶液加到1.5 ml 试管中,再加0.8 ml 乙醚,混匀。取0.7 ml

加入溶液(1)中(磷有毒且易燃,操作请带手套,多余的磷溶液用CuSO 4进行中

和)。

(3) 室温下轻轻摇匀15 min ,然后加热沸腾并保持5 min ,自然冷却。

3、柠檬酸三钠法制备12-30 nm 胶体金(Frens, 1973)

(1) 取250 ml 三角瓶一个,加100 ml 双蒸水及1 ml 1%氯化金,加热沸腾;

(2) 取不同量的1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀,再保持沸腾30 min ,溶液颜色首

先变黑,再逐渐变红,粒子体积较小时,溶液呈桔红色,而粒子体积较大时,则

颜色偏向紫色。

注 意:

(1)由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差,以及制备过程中的其它问题,胶体金粒子的大

小及一致性与理论值可能有偏差,因此,在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太

大,粒子凝聚,粒子边缘不清晰等问题,须重新制备。

(2)胶体金溶液最好保存在4℃冰箱中;也可保存在室温下,一般可保存1-2个月。但决不可保存

在0℃以下,否则金粒子发生凝聚。

二、蛋白-金复合体的制备

一般认为胶体金粒子表面为一层AuCl2,因此,粒子表面带有负电荷,这种负电荷粒子之间相互排斥,形成稳定悬浮的胶体金溶液。

金颗粒表面可以包被一层生物大分子(如蛋白)来稳定和保护这些粒子,以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于pH值,这是因蛋白的净电荷取决于溶液的pH值,在pH=pI时为中性。由于在pH=pI时蛋白溶解度最小,因此这时它水化程度最小,最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备中,一般胶体金调整为pH=PI+0.5,这样蛋白带正电,有利于结合更稳定。

胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理,其目的在于(1)去除高浓度的盐分,高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合,或导致胶体金粒子的凝聚,这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。(2)使蛋白分子尽量分散为单体,冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子,可同时与多个胶体金粒子结合,影响标记的灵敏度和定量分析。(3)使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小(30 kD),形成的蛋白复合体往往是不稳定,可短时间内失活。而分子量过大时,被认为影响探针的灵敏度,特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下,去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度,延长探针寿命(防止凝集)的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白(如BSA,牛血清蛋白等)结合后,能制备出稳定性更佳的探针。

当蛋白前处理完成后,接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳pH值。对于理化性质不确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同pH值得胶体金结合后,只有某一特定pH 值能够形成结合最稳定的探针。在高浓度电解质(如NaCl)作用下不会凝聚。不同蛋白的适宜pH范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜pH值为最佳pH值。但有些探针的实际情况并不完全如此,最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。

在确定最佳pH值后,最后要确定最小蛋白量,即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。如果在制备探针时加入太多的蛋白,不仅造成浪费,而且更为严重的是容易造成探针凝聚,并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合,起到“封闭”(Blocking)作用,而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少的情况下要特别注意。

这里需要特别指出的是,使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时,除了蛋白量完全不同外,往往最佳pH也有一定变化。

因此,在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。

1、抗血清的前处理

一般抗血清中IgG的含量为10-25%,而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探针其标记活性与特异性均不理想。因此需去除其中多数杂蛋白。但处理环节不宜太繁,在实验室设备与经验缺乏的情况下更是如此,否则会导致IgG活性的大幅降低。如果你的实验室在蛋白纯化方面有很强的技术支持,高度纯化后效果会更好。

大量工作表明,只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的IgG蛋白。其基本步骤如下:

(1)取抗血清0.2 ml;

(2)加生理盐水(0.85%NaCl)0.3 ml,混匀;

(3)逐滴加入饱和(NH4)2SO4 0.5 ml,充分振荡混匀,4℃静置1 h;

(4)10000 rpm/min离心20 min,弃上清;

(5)加0.5 ml生理盐水重悬浮,混匀;

(6)逐滴加0.25 ml饱和(NH4)2SO4,充分振荡混匀,4℃静置1 h;

(7)10000 rpm/min离心20 min,弃上清;

(8)重复5~8步骤一次;

(9)加生理盐水0.5 ml重悬浮,混匀;

(10)生理盐水中透析12~24 h;

(11)在0.2 M pH 9.0硼酸缓冲液透析12~24 h;

(12)分装,即将使用时4℃保存,备用-20℃保存。

为最大限度保持抗体活性,整个过程应在4℃下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清,将生理盐水透析改为3 M KCNS透析,促使聚合的多聚体解聚。如果抗血清效价较低时,不宜准备胶体金探针。

2、亲和纯化抗体的处理

亲和纯化抗体多是一些商品化的通用抗体,即二抗。一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人的抗体。这些抗体一般有两个问题,一是IgG分子往往聚集为多聚体分子,二是往往含有较多的盐分。因此前处理的目的在于脱盐和解聚。

其基本步骤如下:

(1)将亲和纯化抗体用生理盐水稀释为0.5-1 mg/ml浓度

(2)在3 M KCNS(硫氰酸钾)溶液中透析12 h

(3)在2 mMol pH 9.0的硼酸缓冲液中透析12 h(更换透析液数次)

(4)分装备用

其它蛋白可参考此方法进行。但注意后一种透析液的pH值应与交联时pH值一致。在实际运用中,一般省略去3M KCNS透析这一步,特别是当蛋白分子量较小,且为非糖蛋白时。我们建议在制备通用探针(如二抗IgG,Protein A,Protein G,Streptavidin)等时,严格使用该方法,而制备直接标记探针时,也可以忽略处理步骤。

3、IgG Fab片段的制备

一般来说体积较小的探针具有相对较高的标记活性。主要原因在于胶体金颗粒较小时有利于在标记溶液中的扩散运动;在胶体金直径一定时,蛋白分子量越小,金表面吸附的蛋白分子越多,活性位点也越密集,也容易于靶位点结合。

IgG分子量为150 kD左右,由4个亚基组成,即两条重链(H)和两条轻链(L)。用水解酶(木瓜蛋白酶)水解后可得到两种片段,即Fab和Fc。其中Fab是具有抗原识别活性的部分,回收后制备探针。Fc能够与Protein A和Protein G特异性结合。但这种分离只能在有条件的实验室进行。

其基本过程如下:

(1)用PBS(pH 7.0,含10 mM EDTA,20 mM盐酸半胱氨酸)溶解纯化的IgG

(2)加固化木瓜蛋白酶

(3)37℃处理5h

(4)离心,去除固化木瓜蛋白酶(沉淀)

(5)过Protein G柱

(6)纯化的Fab片段按前文方法做进一步处理

注:Fab与胶体金结合的pH值为6.5

4、蛋白与胶体金结合最佳pH测定

(例纤维素酶,pI未知)

(1)取若干个1.5ml试管,分别加入1 ml 10 nm胶体金;

(2)用25 mM K2CO3将pH分别调为3,4,5,6,7,8,9,10;

(3)取一96孔培养板,按pH从低到高分别将上述胶体金分别取100 μl加入孔中,重

复三次;

(4)每孔分别加入3 μl浓度为1 mg/ml的纤维素酶,混合,室温下放置10-15 min;

(5)每孔分别加入20 μl浓度为10%NaCl溶液,混合,室温下放置10 min;

(6)观察胶体金颜色变化,记录保持红色的最低pH(X);

(7)重复(1)-(5)步,pH梯度为X-0.6;X-0.3;X;X+0.3;X+0.6;X+1。

(8)观察胶体金颜色变化直到室温下放置2小时,记录仍保持红色的最低pH。

注意:

1.如胶体金粒子直径较小(3~6nm),加NaCl需放置较长时间(几个甚至十几个小时)后才能观察到颜色变化。必要时可放大反应体积(1 ml胶体金),并借助离心来判断。

2.有些蛋白最佳pH范围较窄,设置的梯度不能太大。

5、最小蛋白浓度的确定

(1)用0.22 μm微孔滤膜过滤或高速离心去除蛋白中残物或多聚体;

(2)取一96孔滴定板,每个重复为若干个孔,分别加入最佳pH的胶体金100 μl,重

复3次;

(3)各孔依次加入不同量的蛋白(一般浓度为0.05-0.1 mg/ml)1~20 μl,混匀,室温

下放置15min;

(4)加入20 μl 10%NaCl,室温下放置10min;

(5)颜色仍保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白浓度。

(6)为确保结果准确性,可放大反应体积重复以上步骤。

注:在实际探针制备工作中,蛋白浓度往往为最小浓度的130%。

6、IgG-gold的制备

(1)取两个1.5 ml试管,分别加入1.2 ml 10 nm胶体金;

(2)加入适量25 mM K2CO3把pH调整为9.0;

(3)分别加入10 μl浓度为1 mg/ml IgG,混匀,室温放置10min;

(4)分别加入12 μl 2% PEG20000,室温放置5 min;

(5)10000 rpm离心20 min,轻轻吸除上清;

(6)用20 μl BL溶液重悬浮松散的胶体金沉淀,并集中到新管中;

(7)分别加20 μl 甘油,充分混匀;

(8)-20℃保存备用。

注意:

1).不同直径胶体金所需要的蛋白量差别很大;

2).不同直径胶体金所需离心速度完全不同。以绝大部分探针形成松散沉淀为原则。离心力太大,会产生不可逆的探针凝聚;离心力太小,探针无法沉下。最好能够直接用胶体金在不同转速下离心以确定适当的离心力。

3).在冷离心机中可适当延长离心时间,同时适当减小离心力,探针活性较好。

4).IgG的最佳交联pH有多种报导,从7.4-9.0。一般认为,7.4时胶体金结合的蛋白最多,9.0时制备的探针最稳定。

三、样品的固定、包埋与标记

1.固定

为了减少对标记底物结构的破坏,细胞化学样品固定的时间相对较短,多为1-3小时。环境温度一般在25?C以下。

低温固定剂一般采用2-3%甲醛与1%戊二醛。甲醛分子量小、渗透快,对蛋白质结构影响小,可较好地保存其抗原活性。但对细胞整体的细微结构保存欠佳。戊二醛对细胞的细微结构保存较好,但往往导致蛋白失去抗原活性。因此,在标记低物不是蛋白质或多肽时(如纤维素、多酚类化合物、β-1,3-葡聚糖、几丁质等),可用常规方法进行4%戊二醛和1%锇酸的双固定。

2.包埋

根据标记低物的不同,可以选择常规(常温)包埋剂或低温包埋剂包埋样品。如果标记物为蛋白质,特别是性质不稳定或不清楚时,建议使用低温包埋剂包埋,以最大程度保存抗原活性。大量实验表明,K4M是目前使用最为普遍的低温包埋剂。当选择常温包埋剂时,建议使用Spurr包埋剂。Spurr包埋剂粘性小,易渗透,易操作;包埋块不吸潮,保存时间长。

3.标记

根据标记程序的不同,标记分直接与间接标记。直接标记指胶体金探针直接与被标记底物结合;而间接标记指胶体金探针通过一或多个中间标记物后与底物结合。

直接标记间接标记

直接标记需要制备胶体金探针,其好处是标记特异性好,背景小,能够做阴性对照。间接标记无需制备胶体金探针,可以直接购买通用二抗探针,缺点是标记特异性较难把握,背景较高,不能够做阴性对照。

在做病毒粒子标记时,直接标记法可用抗体直接富集低浓度或稀有病毒而不会增加任何背景。

影响标记的因素主要包括以下方面:

(1)pH

pH变化会对探针蛋白的结构与活性中心产生影响,继而影响到标记强度与特异性。在很多情况下探针作用的最佳pH值往往与该蛋白作用的最佳pH值有一定差别。例如有一种来自真菌的纤维素酶本来在pH 4.8时活性最强,但结合到胶体金上后,pH在6.0左右时最强,当pH到7.2时仍有较强的标记活性。

(2)离子环境

有些蛋白只有在一定离子环境中才有生物活性,其中很多涉及Ca2+,Mg2+,Mn2+,Cu2+等阳离子。有时溶液中Ca2+、Cu2+等容易形成不溶性沉淀而导致标记失败;因此,在配制标记溶液时要注意各种阴阳离子的配伍,添加顺序及溶液pH。

(3)温度

标记温度对标记活性及特异性影响最大,也最容易出问题。以水解酶类做成的胶体金探针对温度变化也更为敏感,不同温度、不同时间标记出的切片其视觉效果完全不一样。在此特别指出一点,在用内切的水解酶探针时,切忌温度过低,时间过长,否则会出现标记的扩散现象。建议在可能时尽量使用外切酶探针。

在使用IgG或Protein A,Protein G探针时,有人认为在4℃下长时间标记特异性最好。但我们研究发现事实并非如此,在25℃以上的室温下标记20-60 min其特异性更好。

一般来说,如果用来自植物或微生物的蛋白做探针,标记温度最好在25℃左右;用来自动物的蛋白做探针时,标记温度最好在30℃左右。

(4)封闭液组成

封闭液对封闭有关非特异性活性基团,特别是醛基至关重要。在多数情况下封闭液与探针重悬浮液、标记溶液是一样的。目前最常用的封闭液组分有BSA、卵清蛋白、脱脂奶粉、PEG20000等。在用IgG、Protein A、Protein G等标记时,应优先选用BSA(组分五);在植物凝集素类探针标记时,应优先选用PEG20000。也有人发现IgG探针标记时脱脂奶粉最佳。

如果是用交联蛋白做成的探针,那么封闭液中最好有载体蛋白的成分。

4.样品的低温包埋的基本程序

(1)将新鲜样品切成1×1×3 mm3的小块,立即放入3%甲醛和1%戊二醛的磷酸缓冲

液(100 mM, pH 7.2)中4?C下固定2 h;

(2)在4?C依次用30%、50%乙醇溶液脱水,每步30 min;

(3)在-20?C冰箱中依次用50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇溶液脱水,每

步60 min;(注意乙醇溶液首先在冰箱中预冷!)

(4)在-20?C冰箱中依次用30%、70%、100%的K4M渗透,每步120 min;注意不断

轻轻摇动样品使渗透完全。

(5)在4?C K4M树酯包埋。注意包埋剂应尽量装满,否则气泡中的氧气会抑制包埋剂

的聚合。

(6)在-20?C冰箱中长紫外线照射聚合72 h。室温下聚合48 h。注意每天翻动2次样品

使紫外光照射均匀。

(7)聚合后的样品应及时切片,长时间放置会导致样品与包埋剂之间分离而无法切片。

(8)超薄切片应收集在镍网、金网或铍网上做胶体金标记。

与其它标记用包埋剂相比,K4M可在-35?C低温下仍保持较低的黏度;K4M有极性,亲水,易脱水,易标记;聚合后交联度高,易切片。

K4M的配方根据材料的性质确定。植物或坚硬的材料包埋剂的硬度要高;动物或幼嫩材料包埋剂的硬度要低。具体参见包埋剂说明。

注意:

(1)K4M有毒,须带PVC或PVDV手套谨慎操作。溅入眼睛或皮肤时请立刻用清水

冲洗。

(2)所有脱水乙醇须提前预冷。

(3)脱水过程中防止样品结霜吸潮。

5.样品常温包埋(常规)的基本程序

(1)将新鲜样品切成1×1×3 mm3的小块,立即放入4%戊二醛的磷酸缓冲液(100 mM, pH 7.2)中4?C下固定6-12 h;

(2)样品用磷酸缓冲液冲洗3次每次5 min;然后在2%锇酸溶液中固定1 h;冲洗3次,每次5分钟。(通风橱中戴手套进行,含锇酸废液倒入食用油中!)

(3)在4?C或室温下依次用30%、50%、70%、90%、100%、100%、100%乙醇溶液脱水,每步15 min;

(4)依次用30%、70%、100%的Spurr包埋剂渗透,每步120 min;然后在100%的Spurr包埋剂中过夜。

(5)Spurr包埋剂包埋。可包埋在0.5 ml的离心管中,每管加0.3 ml包埋剂即可。加入纸标签。

(6)在70?C温箱中聚合12-16 h。

(7)聚合后的样品可长时间保存。超薄切片应收集在镍网、金网或铍网上做胶体金标记。

6.胶体金直接标记基本程序

(1)在培养皿中铺上石蜡膜(parafilm);四周加吸水纸和水以保湿;

(2)加一滴dd H2O,镍网切片向下漂浮2 min;

(3)另滴50 μl封闭液(BL),将镍网切片向下漂浮30 min;

(4)另滴50 μl封闭液(BL),加入2-3 μl胶体金探针,充分混匀;将镍网切片向下漂浮

30 min;

(5)标记后镍网的在dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针,共漂洗3次,每次5-10

min;晾干;

(6)常规染色,观察。

7.胶体金间接标记基本程序

(1)镍网切片向下在dd H2O上漂浮2 min;

(2)在封闭液(BL)上漂浮30 min;

(3)把一抗用BL稀释100-500倍,将镍网切片向下漂浮30-60 min;

(4)dd H2O漂洗两次各5 min,除去多余一抗;

(5)在封闭液(BL)上漂浮30 min;

(6)用胶体金探针标记30 min;

(7)dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针,共漂洗3次,每次5-10 min;晾干;

(8)常规染色,观察。

8.利用胶体金间接标记法进行双标记的基本程序

(1)镍网切片向下在dd H2O上漂浮2 min;

(2)在封闭液(BL)上漂浮30 min;

(3)把一抗A用BL稀释100-500倍,将镍网切片向下漂浮30-60 min;

(4)dd H2O漂洗两次各5 min,除去多余一抗A;

(5)在封闭液(BL)上漂浮30 min;

(6)用小颗粒胶体金探针A标记30 min;

(7)dd H2O漂洗两次各5 min,除去多余胶体金探针A;

(8)重复步骤(2)-(7),其中抗体和探针改用一抗B和大颗粒胶体金探针B;

(9)dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针,共漂洗3次,每次5-10 min;晾干;

(10)常规染色,观察。

9.利用胶体金直接标记法进行双标记的基本程序

如果两种探针的重悬浮液相同(如同为IgG-gold),可直接混合,按上述5的方法进行。单混合时大颗粒胶体金的量要适当增加。

如果两种探针的重悬浮液差别较大,可分别进行直接标记。步骤如下:

(1)镍网切片向下在dd H2O上漂浮2 min;

(2)在封闭液1上漂浮30 min;

(3)用胶体金探针1标记30 min;

(4)dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针,共漂洗2次,每次5-10 min;

(5)在封闭液2上漂浮30 min;

(6)用胶体金探针2标记30 min;

(7)dd H2O上漂洗除去未标记的胶体金探针,共漂洗3次,每次5-10 min;晾干;

(8)常规染色,观察。

10.直接法标记粗提纯病毒

(1)取新覆膜镍网,在用BL稀释500倍的病毒抗血清上漂浮3 min;

(2)在病毒溶液上吸附10 min;

(3)BL封闭30 min;

(4)一抗胶体金探针标记30-120 min;

(5)水洗3次,每次5-10 min;

(6)2%醋酸双氧铀负染。

注意:

(1)如果使用间接标记方法,不能采用或只能采用高度稀释的抗体吸附病毒。否则,高强度的标

记背景影响正确判断。

(2)该方法允许多探针直接混合一步法同时标记多种病毒。特别适应于对未知病毒的检测。

胶体金标记技术路线的选择

1.包埋剂

根据抗原或标记底物性质决定包埋剂种类。

蛋白类,推荐使用K4M;包埋后立即切片标记。

外泌蛋白可选择spurr。可长期保存使用。

细胞结构组分,如纤维素、 -1,3-葡聚糖、几丁质、多酚化合物等,可选择spurr。2.胶体金体积

精细定位如病毒、细胞器定位等选用5 nm胶体金。细胞壁组分采用15-20 nm胶体金。多标记时,胶体金直径推荐选用6 nm、10 nm、15 nm;稳定抗原采用较大颗粒胶体金。一般蛋白标记采用10 nm。

3.通用探针选择

IgG-gold:-20°C可保存1年;但定位时胶体金距离标记位点较远,不适于精细定位。

Protein A/G:-20°C可保存3个月;但定位时胶体金距离标记位点较近,适于精细定位和多标记。

Protein A和Protein G与不同抗体之间的亲和性

胶体金制备与标记中常见的缓冲液配方

1.醋酸盐缓冲液(200 mM)

200 mM NaAc溶液的配制:NaAc·3H2O定容于1000毫升。

2.磷酸盐缓冲液(PBS, 200 mM)

1 M Na2HPO4溶液的配制:178.05克Na2HPO4·2H2O或358.22克Na2HPO4·12H2O定容于1000毫升。

1M NaH2PO4溶液的配制:138克NaH2PO4NaAc·H2O或156克NaH2PO4·2H2O定容于1000毫升。

3.Tri·HCl缓冲液(50mM)

50 mM Tris溶液的配制:36.3克Tris定容于1000毫升。

4.硼酸盐缓冲液(200 mM)

200 mM H3BO3溶液的配制:12.37克H3BO3定容于1000毫升。

50mM Na2B4O7·溶液的配制:19.07克Na2B4O7·3H2O定容于1000毫升。

5.碳酸盐缓冲液(100 mM )

100 mM Na 2CO 3溶液的配制:28.62克Na 2CO 3定容于1000毫升。

100mM NaHCO 3溶液的配制:8.4克NaHCO 3定容于1000毫升。

本缓冲液临用前配制,不能长时间保存。实验系统中有Ca 2++、Mg 2++时不能使用。

图1. IgG 的基本结构

H ,重链;L ,轻链;HC ,重链保守区;HV ,

重链变异区;LC ,轻链保守区;LV 轻链变

异区。

箭头为木瓜蛋白酶与胃蛋白酶的酶切位点。

Fab 、Fc 分别为木瓜蛋白酶水解后的两种片

段。Protein A 和Protein G 可识别Fc 部分。

主要参考文献

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2.Benhamou N, Lafontaine PJ. 1995. Ultrastructural and cytochemical characterization of

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3.Benhamou N, Lafontaine PJ, Nicole M. 199

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systemic resistance to Fusarium crown and root rot in tomato plants. Phytopathology 84: 1432–1444

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常见胶体金探针制备条件(10ml直径10nm胶体金)

19

免疫胶体金标记手册

浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖

浙江大学2001年10月

一、胶体金的制备 根据不同的制备方法,可以制备出直径1-500nm的胶体金粒子,但做为免疫标记探针,其直径应在3-30nm范围内。 在氯化金(HAuCl4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂,可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径3~16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄,而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1~0.2%的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂,可以制备12~150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时,胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金,它避免了单宁酸残基的问题,但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理,故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(0.5g或1g),因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存(-20℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时,烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长,可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3~16 nm胶体金 (1)取一250 ml三角瓶,加入79 ml双蒸水和1 ml 1%氯化金,预热至60~70℃。 (2)取一50 ml烧杯,加入4 ml 1%柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加入不

免疫胶体金技术常见影响因素分析

免疫胶体金技术常见影响因素分析 自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1耗材的选择 1.1不同型号膜的筛选。硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。 1.2结合垫的选择。结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1.3样品垫及吸水纸的选择。样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。

免疫胶体金技术影响因素分析

免疫胶体金技术影响因素分析 自20世纪70年代,Faulk等(1971)用胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1耗材的选择 1.1不同型号膜的筛选硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响—膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸

纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。 1.2结合垫的选择结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1.3样品垫及吸水纸的选择样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。 2关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性和重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均

胶体金的相关知识

免疫层析试纸包被技术简介 试纸生产 过程中一般有三种 溶液的包被处理,即 质控溶液,检测溶 液,和结合物溶液 (胶体金)。质控和 检测溶液就是C/T 线上包被的溶液。 在免疫层 析试纸硝酸纤维素 膜表面进行 C/T线的包被,是试纸生产制作的关键环节之一。免疫诊断试剂中使用的硝酸纤维素膜有两类,一种是免疫渗滤产品用的,按孔径选择一般采用0.45um-1.2um的膜,与分子生物学中用的印迹转移膜一样。Whatman Schleicher & Schuell的膜属于纯采用100%的纯硝酸纤维素,蛋白结合能力较高。另一类即免疫层析用膜,一般按侧向流动速度来划分,常用的范围一般在120-180秒/4cm。目前市场上的硝酸 纤维素膜材以带塑料底衬 为主,也有部分的膜不带 底衬。不带底衬的膜需注 意膜面的正反面,其光滑 度有适当差别。 鉴于流动封闭技 术的普及,C/T线的包被 目前流行先将膜粘贴在塑 料支持底板上,然后直接 将塑料板放入仪器上进行 划线操作,干燥后进行其 他部分的贴板组装,这种 划膜工艺可简称为划板。 但部分产品的工艺要求先直接在膜上划好C/T线,然后用特定配方的溶液将膜进行浸泡封闭处理,干燥后再贴膜及其他部分材料,这种划膜工艺可简称为划膜。 在结合物溶液(胶体金)的包被上,较多的用户倾向于用气动喷头进行定量操作。在科研及研发项目中,往往喷一条线或几条线就够用了,因此在单维往复平台上一次喷一条线也可接受。鉴于胶体金膜切条宽度一般在 3--7mm,不方便一条条依次地在移动平台上固定和取放。因此在批量生产过程中,一般建议采用成片的胶体金垫,用三维平台往复来回地间隔喷线,一次即可喷出二三十条。此后将喷好的金干燥再裁切成条,这样的操作会效率高,适合规模生产。 在某些免疫层析试纸产品生产工艺中,层析膜材或样品垫膜材需要用特定溶液进行整平面包被,要求效果均匀,如层析膜和样品垫的特定封闭处理。

免疫胶体金标记手册

大学电子显微镜室大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖

大学2001年10月

一、胶体金的制备 根据不同的制备方法,可以制备出直径1-500nm的胶体金粒子,但做为免疫标记探针,其直径应在3-30nm围。 在氯化金(HAuCl4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂,可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径3~16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径围较窄,而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1~0.2%的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂,可以制备12~150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时,胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金,它避免了单宁酸残基的问题,但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理,故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(0.5g或1g),因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存(-20℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时,烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长,可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3~16 nm胶体金 (1)取一250 ml三角瓶,加入79 ml双蒸水和1 ml 1%氯化金,预热至60~70℃。 (2)取一50 ml烧杯,加入4 ml 1%柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加入 不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60~70℃。K2CO3的作用是保 持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时,对pH的影响不大,K2CO3

胶体金标记工艺汇总

免疫金的特性 胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合,在免疫组织化学技术中,习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质(抗原或抗体)结合,这类胶体金结合物常称为免疫金复合物,或简称免疫金(immunogold)。 胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚,一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷,与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素,其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。 来源:Gold 2 免疫金的制备 1.用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点,也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。在调节胶体金的pH值时应注意,胶体金会阻塞pH计的电极,不可直接将电极插入胶体金溶液中,宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇(PEG,20000)稳定胶体金后,再调胶体金的pH 值。 2.将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中,放置室温反应2~5min。由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附,并可使胶体金聚沉,因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度,应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。 3.加入浓度为0.2%的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。 4.离心分离,去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒径而异:对5nm 金颗粒可选用40000r/min离心1h;8nm金颗粒用25000r/min离心45min;14nm金颗粒用25000r/min离心30min,40nm金颗粒用15000r/min离心30min。 5.轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮,恢复原体积后再离心。如此洗涤2~4次。以彻底除去未结合的蛋白质。 6.免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。

免疫胶体金技术影响因素分析_张付贤

免疫胶体金技术影响因素分析 张付贤1,2,王兴龙2 (1.吉林大学农学部畜牧兽医学院,长春 130062;2.军事医学科学院军事兽医研究所,长春 130062) 摘要:免疫胶体金技术以其快速、准确、简捷的特点,受到国内外科研工作者及基层工作人员的普遍关注。笔者从耗材的选择、胶体金的制备及标记、膜包被条件、缓冲液和产品保存及验证等方面分析免疫胶体金技术的影响因素,为制备胶体金检测产品提供理论依据和技术参考。 关键词:免疫胶体金技术;影响因素;选择;检测 中图分类号:Q-33 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2009)05-0199-04 自20世纪70年代,Faulk等(1971)用胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1 耗材的选择 1.1 不同型号膜的筛选 硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响—膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高(李云等,2002)。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标 收稿日期:2008-11-28 作者简介:张付贤(1982-),男,河南人,硕士,研究方向:兽医微生物与免疫学。 通信作者:王兴龙(1959-),男,吉林人,博导,从事分子免疫学研究。E-mail:w ang xl-2006@https://www.360docs.net/doc/352283137.html, 基金项目:吉林省科技厅计划项目(20050549)。记物在膜上的流动速率为最佳(邓省亮等,2007)。 1.2 结合垫的选择 结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附(张美玲,2006);玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1.3 样品垫及吸水纸的选择 样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。 2 关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性和重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离和沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深和假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体金结合物就不能快速而完整的从玻璃纤维上解离,从而影响试验结果(Bassab等,2001)。 胶体金的制备除了保证药品的质量外,制备过程中的细节关乎胶体金制备的成败。首先是操作环境和所用容器的清洁度(翟雷等,1996)。所有进入溶胶内的污物都会干扰胶体金颗粒的生成或使生成的胶体金出现聚堆现象,容器最好经酸洗和硅化处理。操作环境应保持清洁无尘粒,最好有专用工作

胶体金法的定义和分类

胶体金是一种常用的标记技术,是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术,有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。 1971年Faulk 和Taytor将胶体金引入免疫化学,此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA),用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链DNA抗体等,具有简单、快速、准确和无污染等优点。 免疫胶体金技术的基本原理: 胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,形成带负电的疏水胶溶液,由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外,还可以与许多其它生物大分子结合,如SPA、PHA、ConA 等。根据胶体金的一些物理性状,如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应,加上结合物的免疫和生物学特性,因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 胶体金标记,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合,因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中,这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大,称之为免疫金银染色。

几种胶体金技术详解

胶体金免疫分析技术详解 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业,免疫分析正在向两个方向发展:一类为全自动化的免疫分析;另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒,目前只能在医疗及检测中心应用,虽也能较快速给出结果,但仍需一定时间,不适合远离医疗及检测中心的地区,更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要,在酶免疫分析的基础上,主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析,主要有以下两种方法:斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术,是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最初用于免疫电镜检查,由胶体金颗粒标记抗原或抗体,与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合,在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后,此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法,使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来,利用硝酸纤维素膜(NC)等为固相载体,以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行,建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术,并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。 胶体金是指金微小粒子(0-100nm)分散在另一种物质中所形成的体系,通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶,用此金溶胶标记蛋白质(抗原、抗体或SPA、SPG),胶体金颗粒具有高电子密度的特性,故在金标蛋白的抗原抗体结合处,显微镜下可见黑褐色颗粒;当这些标记物在相应的标记处大量聚集时,可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点,从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短,仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中,高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中,待测抗原在渗滤或层析时,流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触,很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中,待测抗原要在液相中经过扩散作用,逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时,标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物,故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理: 将氯金酸(HAuCl4)用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒(胶体金),标记金黄色葡萄球菌A

胶体金标记技术

胶体金免疫分析技术 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业,免疫分析正在向两个方向发展:一类为全自动化的免疫分析;另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒,目前只能在医疗及检测中心应用,虽也能较快速给出结果,但仍需一定时间,不适合远离医疗及检测中心的地区,更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要,在酶免疫分析的基础上,主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析,主要有以下两种方法:斑点免疫渗滤分析DIFA 和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术,是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最初用于免疫电镜检查,由胶体金颗粒标记抗原或抗体,与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合,在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后,此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法,使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来,利用硝酸纤维素膜(NC)等为固相载体,以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行,建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术,并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。 胶体金是指金微小粒子(0-100nm)分散在另一种物质中所形成的体系,通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶,用此金溶胶标记蛋白质(抗原、抗体或SPA、SPG),胶体金颗粒具有高电子密度的特性,故在金标蛋白的抗原抗体结合处,显微镜下可见黑褐色颗粒;当这些标记物在相应的标记处大量聚集时,可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点,从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短,仅需要数分钟就完成了ELISA 需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中,高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中,待测抗原在渗滤或层析时,流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触,很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中,待测抗原要在液相中经过扩散作用,逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时,标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物,故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理: 将氯金酸(HAuCl4)用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒(胶体金),标记金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)或抗体,用于免疫印迹、免疫组织化学定位或快速免疫渗滤、免疫层析实验。金标记免疫渗滤技术的原理同一般的免疫斑点试验,也是用已知抗原或抗体包被NC膜,再用金标记抗体或抗原来进行快速快速测定,阳性时斑点呈胶体金的红色。改进之处为采用了渗滤装置,更加简便。金标记免疫层析则是利用NC膜条状纤维的毛细管作用,使样品在涌动中与金标记物及包被在NC膜上的抗原或抗体结合,出现呈色的阳性信号。

胶体金标记技术

胶体金标记技术 胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂,应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题,且利用不同颗粒大小的胶体金还可以作双重甚至多重标记,使定位更加精确。因此已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后的一种新型标记技术。现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂的制造等领域。 用胶体金作为特殊标记物的研究始于60年代初,1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜的研究。1971年,Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。近年来的研究表明,胶体金也可作为体外免疫加层试验的指示物。由于胶体金作为标记物具有很多优点,因此自其问世以来,在国内外的许多研究领域中得到了迅速的发展。 近年来,它更多的被应用于免疫学和细胞学相关分子水平的检测中。尤其随着人们物质生活的改善,有关人类健康的问题在现实生活中已显得非常突出。从90年代至今的多篇报道都是关于动物体或人体相关抗体和病原体检测的。 制备方法 在溶液中金颗粒呈圆形,边缘平整,界线十分清楚。金颗粒表面带有大量负电荷,由于静电的排斥力,使其在水中保持稳定状态,形成稳定的胶体,所以称其为胶体金。胶体金的制作方法有白磷还原法,抗坏血酸还原法,柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。通过改变反应体系中氯金酸与还原剂的比例(即增加或减少还原剂的量)可得到所需不同直径的金颗粒。 但前两种方法制备得到的金颗粒直径大小不均一,所以目前常用后两种方法,以柠檬酸三钠还原法为例,有两种方法。 1.Frens标准方法: 1)取0.01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸,随即快速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL。 2)约过25s沸腾的溶液变为淡蓝色,大约再过70s,蓝色突然转变为亮红色, 3)继续煮沸约5分钟后结束反应。 4)冷却后用0.1M K2CO3溶液调至所需PH值。 5)此后再延长反应时间或另加入额外的柠檬酸三钠都不影响实验结果。 该法制备得到的金颗粒直径约为41nm,如前所述要想得到更大或更小的金颗粒,该方法依然可行,唯一不同的是需要改变加入还原剂的量。另外,采用此标准方法所需反应时间最短。2.Slot标准方法: 1)取1mL1%HAuCl4溶液溶于100mL水中,2)再加入2mL1%二水柠檬酸钠溶液。 3)将该混合溶液加热煮沸约15~30min,直至溶液颜色变为亮红色, 4)冷却后,用0.1M K2CO3溶液调整PH值,该法制备的金颗粒直径约为15nm。 胶体金标记蛋白的原理是:在碱性条件下,胶体金颗粒表面带负电荷,可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合,这种结合对所标记蛋白的生物学活性无明显影响。 胶体金免疫技术可大致分为液相胶体金标记技术和固相胶体金标记技术,其分类依据同酶免疫技术。最早的液相胶体金标记技术叫免疫金染色法(IGS),它仅以胶体金作为标记物和显色剂。最初的免疫金染色都采用单标记。即采用大小均一的金颗粒进行标记。后来发展到可利用不同颗粒大小的胶体金作双重标记甚至多重标记。但该方法均仅以胶体金显色,需要较高浓度的标记物,耗费抗体或抗原的量较多,而且需要较大直径的金颗粒(40-50nm),才能获得较高的灵敏度,而且当金颗粒过大时,标记物不稳定,长期贮存容易发生自动聚集。 为克服以上缺点,免疫金银染色法(IGSS)应运而生。该方法的原理是,先用胶体金标记物作免疫金染色,再加入含银的物理显影液,则银离子靠电荷吸引,大量吸附于金颗粒周围,使显色结果呈现金属银的蓝灰色,同时将显色信号进一步放大。应用时,由于本法最终显色是靠金属银的吸附沉积,因此不需要高浓度的胶体金标记物,将胶体金标记物稀释几十倍,仍可获得同免疫金染色一样的最佳效果。这样不仅可以节省大量的抗体或抗原标记物,而且可以节省大量的胶体金。本方法灵敏度的关键在于胶体金吸附银颗粒的数量。小直径的

免疫胶体金标记手册

浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所 胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖 浙江大学 2001年10月

一、胶体金的制备 根据不同的制备方法,可以制备出直径1- 500nm的胶体金粒子,但做为免疫标记探 针,其直径应在3-30nm范围内。 在氯化金(HAuCI 4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂,可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍, 数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径3?16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄,而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1?0.2%的 H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂,可以制备12?150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金 时,胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备12-16 nm直径 的胶体金。 除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备 5 nm的胶体金,它避免了单宁酸残 基的问题,但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理,故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(0.5g或1g),因此在配制氯化金溶液 时一次配完,暂时不用的可以用 1.5 ml试管分装为1 ml保存(-20 C)。注意各种玻璃器皿 一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时, 烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长,可4C保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出 现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3?16 nm胶体金 (1)取一250 ml三角瓶,加入79 ml双蒸水和1 ml 1 %氯化金,预热至60?70C。 (2)取一50 ml烧杯,加入4 ml 1 %柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60?70C。K2CO3的作用是保持 溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时,对pH的影响不大,K2CO3 可以省略。 (3)将上两种溶液迅速混合并充分

胶体金免疫技术在食品检测中的应用

胶体金免疫技术在食品检测中的应用 摘要:胶体金免疫技术(GICA)是免疫技术中的重要组成部分,是一种具有广阔发展前景的快速便捷的新技术。结合GICA技术的原理,着重探讨GICA技术在食品检测中的应用,为食品质量安全的监控提供理论依据。 关键字:胶体金免疫残留 The application of immune colloidal gold technique in food detection Abstract:Immune colloidal gold technique (GICA) is an important part of immune technique, It has a broad prospects for development of new technology in food detection .Combined with the principle of GICA, the author discussed application of GICA in food detection, which provides the theoretical basis of food quality and safety. Key words:colloidal gold immunoassay residue 正文:胶体金免疫技术是固相免疫标记技术,它是伴随着荧光标记、同位素标记以及酶标记等盛行起来的一种技术。胶体金免疫法作为一种新型快速的检测手段,具有灵敏度高、特异性强、快速简便、无污染等优点,被广泛应用在农副产品及环境卫生的检测中。 1 原理 胶体金免疫技术(gold immunoassay,GICA)是将金标记法与层析法相结合的一种免疫形式原理为:将具有特异性的蛋白固定在层析带上,样品溶液通过毛细管层析作用在层析带上泳动,层析带上待测物的受体与样品中的待测物发生高特异性和高亲和性的反应,最终检测带上富集了相应复合物,通过酶促显色或直接目测着色标记物几分钟内即可观测到结果[1]。 与酶联免疫相比,基于实验者肉眼可观测到的颜色结果,且不需要大型仪器及特殊试剂,操作简单,短时间即可得到结果并保留。胶体金颗粒在放射性物质的比较,金颗粒具有一定使用优势[2]。该方法简单、快速。不同的抗原可能是共轭对不同大小的金颗粒,因此逐一确认。在一定条件下定位精确、定量分析是可能的,由于金颗粒清晰可辨因此与其他结构或内源性物质可避免混乱。 2 制备 通过加入某些特定还原剂(如抗坏血酸、白磷、柠檬酸三钠等),使氯金酸(HAuCl4)能够利用聚合反应聚合成一定大小的金颗粒,它们是带有负电的疏水性胶溶液,在静电力作用下其胶体状态不易破坏,该制备方法为化学还原法[3]。在制备过程中,加入还原剂的种类和浓度直接影响胶体金颗粒的大小,相关研究表明,欲制得直径较小的金颗粒,试验应选择还原能力较强的还原剂[4]。电子显微镜及光谱法能够准确地测定其含量,对其纯度能够较好地分析[5]。

胶体金技术

免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 文章来源: 文章作者: 发布时间:2007-04-24 字体: [大 中 小] (一) 原理 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl 4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下,聚合成为特定大小的金颗粒,并由 于静电作用成为一种稳定的胶体状态,称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外,还可以与许多其它生物大分子结合,如SPA 、PHA 、ConA 等。根据胶体金的一些物理性状,如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应,加上结合物的免疫和生物学特性,因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 (二) 胶体金的制备 根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下。 1.枸橼酸三钠还原法 (1)10nm 胶体金粒的制备:取0.01%HAuCl 4水溶液100ml ,加入1%枸橼酸三钠水溶液3ml ,加热煮沸30 min ,冷却至4℃,溶液呈红色。 (2)15nm 胶体金颗粒的制备:取0.01%HAuCl 4水溶液100ml ,加入1%枸橼酸三钠水溶液2ml ,加热煮沸 15min ~30min ,直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K 2CO 30.5ml ,混匀即可。 (3)15nm 、18nm ~20nm 、30nm 或50nm 胶体金颗粒的制备:取0.01%HAuCl 4水溶液100ml ,加热煮沸。根 据需要迅速加入1%枸橼酸三钠水溶液4ml 、2.5ml 、1ml 或0.75ml ,继续煮沸约5min ,出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm 、18~20nm 、30nm 和50nm 。 2.鞣酸—枸橼酸钠还原法 A 液:1%HAuCl 4水溶液1ml 加入79ml 双馏水中混匀。 B 液:1%枸橼酸三钠4ml ,1%鞣酸0.7ml ,0.1Mol/L K 2CO 3液0.2ml ,混合,加入双馏水至20ml 。

免疫胶体金标记手册

免疫胶体金标记手册 浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所胶体金免疫标记技术培训班 技术资料 胡东维洪健徐颖 浙江大学 2001年10月

一、胶体金的制备 根据不同的制备方法,可以制备出直径1-500nm的胶体金粒子,但做为免疫标记探针,其直径应在3-30nm范围内。 在氯化金(HAuCl4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂,可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍,数量减少为原来的1/8。 以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径3~16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄,而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1~0.2%的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10 nm的胶体金时建议使用该方法。 利用柠檬酸为还原剂,可以制备12~150 nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时,胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备12-16 nm直径的胶体金。 除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备5 nm的胶体金,它避免了单宁酸残基的问题,但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理,故该方法已经很少使用。 氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存(0.5g或1g),因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存(-20℃)。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理(1%双氯硅烷/氯仿浸泡1小时,烘干)。配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用0.22 m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长,可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。 1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3~16 nm胶体金 (1)取一250 ml三角瓶,加入79 ml双蒸水和1 ml 1%氯化金,预热至60~70℃。 (2)取一50 ml烧杯,加入4 ml 1%柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加 入不同用量的单宁酸及等量的25 mM K2CO3。预热至60~70℃。K2CO3的作用 是保持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5 ml时,对pH的影响不大,K 2CO3可以省略。 (3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀,加热至沸并保温10分钟。自然冷却。

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