蛋白纯化培训总结

蛋白纯化培训总结

蛋白质分离纯化一般需经过细胞破碎、澄清、分离等步骤。

1 细胞破碎

常见的细胞破碎方法有超声破碎法、反复冻融法、高压匀浆法、珠磨破碎法等。实验中应根据实验室现有实验条件来选择合适的破碎方法。冻融法操作十分简便，无需特殊设备，在实验室中使用很方便，但耗时，耗能，大规模应用困难。珠磨破碎法适用范围较广，但对操作者的经验水平要求较高，且制备量不易放大。本实验室主要采用高压匀浆法破碎细胞，一方面可以得到充分破碎的细胞，高压匀浆机的制冷系统也可减少蛋白质的热变性的可能，另一方面此种方法与其他方法相比，可在增大细胞破碎量的时候有效的节约时间。若不具备高压匀浆破碎细胞的条件，也可采用超声破碎法，但超声破碎的效率受到声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等多种因素的影响。

2 澄清

经过细胞破碎的蛋白样品中含有大量的细胞碎片，不利于此后纯化过程的进行，需对样品液进行澄清处理。这一过程可通过离心、过滤、微滤等方法进行。实验室较多采用离心的方法获取澄清的液体，也可使用微滤的方法，如使用膜孔大小低于0.45μm的滤膜进行过滤，但容易出现频繁的滤膜堵塞的状况，需多次更换滤膜。大规模生产中可使用过滤的方法，如板框过滤法。

3 分离

分离的方法主要有沉淀法、超速离心、超滤、层析。沉淀法在血液制品的生产中应用较多，如沿用至今的冷乙醇沉淀法制备血浆蛋白。超速离心法根据不同大分子物质沉降系数的不同，通过离心将其分离开来，如用于病毒颗粒的分离。超滤法分离效率不高，主要应用于样品的浓缩。层析法在蛋白纯化中应用最为广泛，主要包含了离子交换层析、反相层析、疏水相互作用层析、亲和层析、体积排阻层析。

3.1 层析

在以上几种层析方法中，应用较多的为离子交换层析和亲和层析。

离子交换层析根据蛋白质与介质之间静电吸附的强弱进行分离。实验中应用离子交换层析时，需要根据纯化对象的不同，在离子交换层析介质、洗脱液pH

值、缓冲溶液类型、洗脱盐类型这几方面进行预实验，以寻找出最适的条件，预实验可用重力柱进行。

离子交换层析分为阳离子交换层析和阴离子交换层析，两种类型离子交换剂的常用电荷基团如下表：

亲和层析则是通过生物特异性差异分离样品的液相层析技术。可分离其他层析方法难以分离的样品。此种方法需根据纯化的物质不同选择不同的配基。在我们的实验中，选择了将目的蛋白与组氨酸标签融合表达，运用组氨酸标签与层析柱上金属离子（Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+）的特异结合，来分离纯化目的蛋白。

层析技术的基本步骤包含平衡、上样、洗脱，需根据纯化对象的不同，来探索优化洗脱方案。线性梯度洗脱虽为标准方法，且精确度高，但阶梯洗脱方法往往有更好的效果，实验中需摸索不同洗脱浓度下的洗脱体积，以确定针对特定蛋白样品的最佳方案。如果单一一种层析方法的纯化效果不佳，可尝试采用多种层析方法进行纯化。

实验内容

实验培训中纯化的目标蛋白为在BL21（DE3）菌株中表达的带His标签的可溶融合蛋白，蛋白由IPTG诱导表达，通过超声破碎法裂解细菌得到粗蛋白，在通过亲和层析、蛋白酶切、离子交换层析技术获得纯度达90%以上的目标蛋白。

一、实验材料：

1.仪器：

高速冷冻离心机、恒流泵、蛋白核酸检测仪（见图1）、电泳仪、pH计

图1

2.层析柱：

IMAC预装柱、Q预装柱、SP预装柱

3.试剂：

Tris、NaCl、Imidazole、Ni2SO4、EDTA、NaOH、重组肠激酶Enterokinase

二、实验方法：

1. 诱导表达

加入量为：1ml菌液加入1μl 0.5mIPTG，37℃诱导3h.

2. 破菌

①破菌buffer：20mM Tris 250mM NaCl 10mM Imidazole,pH 8.0

②20:1(ml/g)比例用破菌buffer重悬菌体，Φ10探头400W超声4s,停止6s，

循环99次。中间暂停一次搅拌均匀。破菌液12000rpm离心20min。

3. 亲和层析：

Column：IMAN预装柱（规格1ml）

Buffer A：20mM Tris 250mM NaCl 10mM Imidazole,pH 8.0

Buffer B：20mM Tris 250mM NaCl 500mM Imidazole,pH 8.0

Flow rate: 1.5ml/min

①清洗柱子：100mM EDTA→ddH2O→0.2M NaOH→ddH2O，每种清洗液至少

10个柱体积，最后一步冲ddH2O至流出液pH约为中性。

②挂Ni：冲100mM Ni2SO4至流出液出现绿色，用至少10个柱体积ddH2O洗

柱，去掉多余未螯合的Ni2+。

③平衡柱子：Buffer A平衡至少10个柱体积，归零蛋白核酸检测仪读数。

④上样：样品留取40μl，其余上柱。

⑤洗脱液配制：用Buffer B配制梯度洗脱液，每个梯度至少10ml，梯度为50mM

Imidazole、100 mM Imidazole、250 mM Imidazole。

收集洗脱液方法：待蛋白纯化仪出峰时（即读数开始上升）开始收样至峰下降至

稳定数值时停止收样。

4. 酶切：

Digestion buffer：20mM Tris 50mM NaCl，pH 7.5

①样品稀释：取200μl 250mM Imidazole洗脱液，加入800μl Digestion buffer

混匀。

②酶切：3个EP管A、B、C，依次加入100μl、100μl、200μl上述混合液，

C内加入8μl EK酶，混匀取100μl加入B混匀取100μl加入A。室温酶切1h。

5. 离子交换层析：

阴离子交换：

Column：Q预装柱（规格1ml，His标签结合柱上，目标蛋白穿透，此柱可去除样品中内毒素）

Buffer A：20mM Tris pH ±1.5单位PI值

Buffer B：20mM Tris 1M NaCl pH ±1.5单位PI值

步骤：

10ml Buffer A平衡柱子

EK酶切样品上样，收集流穿样品

10ml Buffer A平衡柱子

100/300/500mM/1M NaCl 和0.2M NaOH洗脱，收集洗脱液

各取40μl电泳

阳离子交换：

Column：SP预装柱（规格1ml，目标蛋白结合柱上，此柱可去除样品中内毒素并对样品进行浓缩）

Buffer A：20mM Tris pH ±1.5单位PI值

Buffer B：20mM Tris 1M NaCl pH ±1.5单位PI值

步骤：

10ml Buffer A平衡柱子

QFT上样，收集流穿样品

10ml Buffer A平衡柱子

100/300/500mM/1M NaCl 和0.2M NaOH洗脱，收集洗脱液

各取40μl电泳

三、透析、超滤、浓缩至保存体系

1、透析袋处理及透析

①裁剪合适大小的透析袋。

②大体积2% NaHCO3和1mM/L EDTA（pH 8.0）中将透析袋煮沸10min。

③去离子水彻底清洗透析袋。

④1mM/L EDTA（pH 8.0）煮沸10min。

⑤冷却后存于4℃，透析袋始终浸没于液体中，此后均需带手套操作。

⑥透析袋验漏后，将待透析液体加入透析袋内，置于透析液中4℃透析过夜。

2、超滤浓缩

去离子水润洗滤膜，透析液润洗滤膜，加入样品，4℃低温4000rpm （速度过大易破坏滤膜）2min预超滤，根据样品超滤速率，调整此后超滤时间，切勿使滤膜干掉。超滤完后，吹打匀样品后再继续超滤。

附1：超滤管处理方法

新管：去离子水、透析buffer润洗

旧管：①0.1M NaOH 浸泡30min，用枪吹打，离心。

②去离子水润洗，20%乙醇洗。

保存：20%乙醇浸泡

附2：测蛋白

①Lowry法

②BCA法

③Bradford法

④A280/A260法

附3：EDTA配制

800ml 水溶，加200ml 10M NaOH

附4：Ni柱脱Ni

①0.1 M EDTA 洗至无色

②水洗至pH中性

③0.2M NaOH 至核酸蛋白纯化仪指数稳定

④水洗至pH中性

⑤20%乙醇洗并保存。