SDS-PAGE电泳操作规范
聚丙烯酰氨凝胶电泳
一简介
作用原理:聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。它有两种形式:非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE);非变性聚丙烯酰胺凝胶,在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro 于1967年建立,他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂(SDS即十二烷基磺酸钠)后,蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(可以忽略电荷因素)。
二作用
SDS是阴离子去污剂,作为变性剂和助溶试剂,它能断裂分子内和分子间的氢键,使分子去折叠,破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇,二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后,分子被解聚成多肽链,解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束,所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量,这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统,与连续缓冲系统相比,能够有较高的分辨率。浓缩胶的作用是有堆积作用,凝胶浓度较小,孔径较大,把较稀的样品加在浓缩胶上,经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选
TRIS/HCl缓冲液,电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后,HCl解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成以稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。此鉴定方法中,蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量,而与所带电荷和分子形状无关。
三电泳过程
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除,那电泳迁移率就取决于分子的大小,就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年,Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇,可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电,使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷,它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量,因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别,SDS与蛋白质结合后,还可引起构象改变,蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒,不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样,约为18A(1A=10的负十次方米),这样的蛋白质—SDS复合物,在凝胶中的迁移率,不再受蛋白质原的电荷和形状的影响,而取决于分子量的大小由于蛋白质-SDS复合物在单位长度上
带有相等的电荷,所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶,进入分离胶后,由于聚丙烯酰胺的分子筛作用,小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径,阻力小,迁移速度快;大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后,这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测,纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带,但如果蛋白质是由不同的亚基组成的,它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度,一般只需要不到微克量级的蛋白质,而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况,这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。
四操作步骤
所需试剂及仪器:
试剂:丙烯酰胺,双丙烯酰胺,Tris-base,TEMED,SDS,过硫酸铵,甘油,溴酚兰,甘氨酸,DTT,考马斯亮蓝R-250,甲醇,冰醋酸,蛋白Marker5只(50ul装),小牛血清白蛋白10mg。
仪器设备:电泳仪、槽、板5套;10ml小烧杯10只,微量移液器5
把,普通移液器5套,足量滤纸,0.45μm滤器。
母液:
1、2M Tris-HCL (pH8.8)100ml:
24.2g Tris-base,50ml蒸馏水,加入浓盐酸调pH8.8,最后定容至100ml。高压灭菌处理。
2、1M Tris-HCL (pH6.8)100ml:
12.1g Tris-base,50ml蒸馏水,加入浓盐酸调pH6.8,最后定容至100ml。高压灭菌处理。
3、10%SDS100ml:
10gSDS,加入70ml蒸馏水在60℃搅拌溶解,待泡沫消失后,定容至100ml。
4、50%(w/v)甘油100ml:
50ml甘油,50ml蒸馏水,混匀即可。
5、1%(w/v)溴酚兰(染色)10ml:
100mg溴酚兰,蒸馏水定容至10ml。
6、0.01mol/L乙酸钠溶液100ml:
0.139g乙酸钠溶于100ml蒸馏水中,调pH至5.2。
7、1M DTT20ml:20ml0.01mol/L乙酸钠溶液溶解3.09gDTT,过滤除菌后分装成1ml/份,-20℃保存。
工作液:
1、30%聚丙酰胺母液(A液)实际需要250ml
100ml:丙烯酰胺29g,双丙烯酰胺1g,去离子水在37℃溶解,
定容到100ml。0.45μm滤器过滤除菌,棕色瓶保存。pH≤7.0。2、4×分离胶缓冲液(B液)100ml:
75ml 2M Tris-HCL (pH8.8)
4ml 10%SDS
21ml蒸馏水
4℃存放。
3、4×浓缩胶缓冲液(C液)100ml:
50ml 1M Tris-HCL (pH6.8)
4ml 10%SDS
46ml蒸馏水
4℃存放。
4、10%过硫酸铵(D液)5ml:
0.5g过硫酸铵,5ml蒸馏水,0.1m分装。
5、TEMED (E液)
5、1×Tris-甘氨酸缓冲液1L:
Tris-base 3g
甘氨酸14.4g
SDS 1g 蒸馏水定容到1L,pH8.3左右。
6、5×上样缓冲液10ml:
0.5ml 1M Tris-HCL(pH6.8)
1ml 1M DTT
2ml 10% SDS
1ml 1%溴酚兰
5ml 50%甘油
0.5ml 蒸馏水7、考马斯亮蓝染色液1L:
考马斯亮蓝R-250 1.0g
甲醇450ml
冰醋酸 100ml
蒸馏水450ml 8、考马斯亮蓝脱色液1L:
甲醇100ml
冰醋酸 100ml
蒸馏水800ml 步骤:
一、组装模具:
用海绵蘸取少量清洁剂,擦洗干净两块玻璃板,自来水冲洗3—5遍然后,再用无水乙醇冲洗2遍,晾干待用。将已清洗干净的两块玻璃板用封条封严。组装在电泳架上,浅玻璃板朝外(靠近操作者一侧),然后固定结实。(注意:清洗玻璃板时动作要轻柔,切勿划破玻璃面;清洗干净之后,不要用手碰玻璃面。)
二、制胶:
1、配10%分离胶10ml:吸取A液3.3ml,B液2.5ml,蒸馏水4.2ml,D液100μl,在小烧杯中摇匀,再加入E液10μl,立即混匀并用10ml 注射器吸取大约8ml混合溶液,沿着玻璃板之间缝隙左上处,缓慢灌胶,一直到距前玻璃板上沿1.5cm处为止。(注意:A当凝胶完全浸没玻璃板底的时候,留意观察是否漏胶。若漏胶,则立即停止灌胶,重新固定模具之后再继续。B灌胶应缓慢进行,避免有气泡产生)
2、水膜封闭空气:在分离胶上面小心加入一层蒸馏水,以隔绝空气,促进凝胶聚合。等待约20—30min,交界面有明显的折光线,且倾斜模具,交界面不随之改变,为凝胶凝固良好。用滤纸小心洗干水分。
3、配5%浓缩胶5ml:吸取A液0.67ml,C液1.0ml,蒸馏水2.3ml,D液50μl,在小烧杯中摇匀,再加入E液5μl,立即混匀,灌胶,
到到前玻璃板上沿即可。
4、插上齿梳,确保无气泡。等待凝胶完全聚合,约需30分钟。
5、小心拔出梳子,卸下封条,将玻璃板颠倒放置,使浅玻璃板朝内,固定在电泳架上。将整个电泳架放入电泳槽,在内外槽中倒入电泳缓冲液,内槽液面应在前后玻璃板之间。
三、点样:
1、吸取20μl蛋白样品到EP管中,加入4μl上样缓冲液,混匀,沸水中加热5min
2、全部样品上样,小心不要使样品漂散。
3、同时吸取蛋白Marker10—20μl点样。
四、电泳:连接好正负极导线,稳压120V,至溴酚兰到达分离胶底部。
五、染色:
1、剥胶
2、将凝胶小心放入考马斯亮蓝染液浸泡,45℃摇床摇30min。
3、脱色:将凝胶浸泡入考马斯亮蓝脱色液中,放入一小块海绵,45℃摇床摇4—8h,其间更换脱色液3—4次,观察蛋白电泳情况。参考资料:
牛血清白蛋白分子量: 6.6KD因此,分离胶浓度选为10%。