复合菌群FWD1的木质纤维素降解特性及其微生物多样性研究
摘要：通过限制性培养条件和连续继代培养，筛选获得了一组高效稳定分解小麦秸秆的复合菌群FWD1。该菌群在10d 内对小
麦秸秆的分解率达到76.92%，发酵液中主要成分为乙酸、丙酸、丁酸和乙醇。利用第二代高通量测序技术对复合菌群和菌种来源土壤样品的细菌组成进行分析，结果表明FWD1中主要含有变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门，在种分类水平上，
Clostridium sp.BNL1100，uncultured Alcaligenes sp.，uncultured Alcaligenaceae bacterium 和Brevundimonas diminuta 为优势菌株。通过连续继代培养富集了变形菌门和厚壁菌门，更细化分类水平上富集了以Clostridium sp.BNL1100为主的纤维素降解菌。菌群通过菌种之间的协同作用，共同维持了体系的稳定。研究结果为明确菌群降解机理和提高木质纤维素降解效率提供了基础。关键词：复合菌群；小麦秸秆；代谢产物；细菌多样性；高通量测序技术中图分类号：
X712文献标志码：
A 文章编号：1672-2043（2015）
08-1582-07doi:10.11654/jaes.2015.08.022
复合菌群FWD1的木质纤维素降解特性及其微生物多样性研究
赵听1，张凯煜1，谷
洁2，3，张社奇1，王小娟2，3*
，宋
雯1，史龙翔2，3，闫法威2，3
，
潘洪加2，
3
（1.西北农林科技大学理学院，陕西杨凌712100；2.西北农林科技大学资源与环境学院，陕西杨凌712100；3.农业部西北植物营养与农业环境重点实验室，陕西杨凌712100）
Characteristics of Lignocellulose Degradation and the Microbial Diversity of FWD1
ZHAO Ting 1,ZHANG Kai -yu 1,GU Jie 2,3,ZHANG She -qi 1,WANG Xiao -juan 2,3*,SONG Wen 1,SHI Long -xiang 2,3,YAN Fa -wei 2,3,PAN Hong-jia 2,3
（1.College of Sciences,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.College of Resources and Environment,Northwest A&F Uni -
versity,Yangling 712100,China;3.Key Laboratory of Plant Nutrition and the Agri-environment in Northwest China,Ministry of Agriculture,Yangling 712100,China ）
Abstract ：A microbial community FWD1,which is relatively stable and has an efficient ability to decompose wheat straw,was selected from fir forest soil by using restrictive and successive cultivation method.The degradation rate of wheat straw by FWD1was as high as 76.92%within 10days of incubation.The metabolite products of FWD1were found to be mainly acetic acid,propionic acid,butyric acid and ethanol.The bacterial composition of FWD1and the fir forest soil sample where FWD1colonized was characterized by using the next gener -ation of high-throughput 16S rRNA gene sequencing technology.The dominated phyla of FWD1were Proteobacteria,Firmicutes and Bac -teroidetes and the predominated species were Clostridium sp.BNL1100,uncultured Alcaligenes sp.,uncultured Alcaligenacea e bacterium and Brevundimonas diminuta .Successive subcultivation led to the enrichment of specific bacterial groups,in phyla of the Proteobacteria and Firmicutes,in species of the Clostridium sp.BNL1100of cellulolytic bacteria.The stability of the microbial community FWD1and its func -tions were maintained by the synergistic coordination among bacterial species in the system.The results provide the basis for a better under -
standing of the mechanisms of lignocellulose degradation and for the improvement of the efficiency of lignocellulose degradation.
Keywords ：microbial community;wheat straw;metabolites;bacterial diversity;high-throughput 16S rRNA gene sequencing technology
收稿日期：
2015-02-11基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金（2452013QN035）；西北农林科技大学博士科研启动项目
作者简介：赵听（1990—），女，河南驻马店人，硕士研究生，研究方向为农业废弃物资源利用及微生物生态学。E-mail ：
zhaoting19900111@https://www.360docs.net/doc/327678494.html, *通信作者：王小娟E-mail ：
xiaojuan456@https://www.360docs.net/doc/327678494.html,
我国每年的秸秆产量高达6~7亿t，其中小麦秸秆占21%[2-3]。小麦秸秆为木质纤维素资源，直接还田可以培肥地力，但因直接还田分解难度大，分解周期长，制约了秸秆在培肥地力方面的应用[4-5]。在收获季节，大量的小麦秸秆在田间任意堆弃或焚烧，既浪费了宝贵的资源，又污染了环境。如何使秸秆变废为宝，对于环境建设和节能减排均有重要意义。
自然界中木质纤维素的降解是由多种微生物分泌多种活性酶协同完成的[6]。纯培养的单一菌株产生的酶种类较少或配比不均衡，因此将木质纤维素降解单菌进行组合及构建复合菌群是降解木质纤维素的有效途径[7]。而现阶段，国内外对人工组配菌群的研究主要集中于2~3种纯菌混合培养[8-10]，超过5种以上菌种混合培养的报道很少。同时，还约有99%的微生物目前无法培养[11]，所以人工组配的复合菌群并不符合自然状态下木质纤维素的分解条件和规律，其木质纤维素降解效率也不高。一些学者模拟自然条件下木质纤维素的分解过程，以原生态环境样品为接种物，采用限制性培养条件，构建了高效降解滤纸、水稻秸秆和纸浆废物等的复合菌群[12-16]。但目前对能够高效降解小麦秸秆的复合菌群的报道较少。
秦岭林地地面覆盖大量植物凋落物，该地区必定蕴含丰富的木质纤维素降解菌。本文以该地区具有较高木质纤维素降解能力的冷杉林地土壤样品（QLI）为菌种来源，连续继代培养获得了稳定高效小麦秸秆分解复合菌群FWD1，研究其降解特性，同时利用高通量测序技术分析复合菌群FWD1和菌种来源土壤样品QLI中的细菌群落组成，可为研究其协同作用机理和优化菌群奠定基础。
1材料与方法
1.1研究区概况
研究区位于陕西省境内太白山北坡，太白山北坡海拔800~3000m，采样地点位于海拔800~2600m。海拔800~1500m，属温带季风气候，年平均气温约11℃，活动积温3200~3500℃，夏季平均气温20~23℃，极端最高气温35~37℃，冬季最冷月平均气温-7℃~ -2℃，积雪与土壤结冻期常在3个月以上。海拔1500~3000m，全年无夏，春秋短促，冬季漫长，气候冷湿，多雨多雾。年平均气温6℃。活动积温1900~2500℃，无霜期仅140d左右，年降水量多达750~1000mm。
1.2样品采集
2013年9月在秦岭山区选取竹林、槐林、栗林、柏林、槲林、华山松、锐齿栎、油松和冷杉9个土壤样品，按照五点采样法采集5~25cm土层土样，去除石头等杂物，每个样品分为两份，一份置于4℃保存，另一份置于-80℃保存。各土壤的基本状况和性质详见表1。
1.3供试碳源及其预处理方法
自然收获的隔年小麦秸秆经1.5%NaOH碱液浸泡48h，用自来水冲洗数次，用清水浸泡1~2d，用盐酸调节pH为7.0左右，105℃烘干后备用。
1.4筛选培养基
Mandels培养基：（NH4）2SO41.4g·L-1，MgSO4·7H2O0.3g·L-1，KH2PO42.0g·L-1，CaCO32.0g·L-1，FeSO4·7H2O5.0g·L-1，MnSO41.6mg·L-1，ZnCl21.7mg·L-1，CoCl21.7mg·L-1，蛋白胨2.5g·L-1，pH7.0。小麦秸秆作为碳源，添加量为0.5%。
1.5试验方法
1.5.1土壤性质测定
pH值使用PHS-3C型数字pH计测定（土壤m∶水V=1g∶10mL），含水量采用减重法测定。
1.5.2复合菌群FWD1的驯化培养
取采集到的9份土壤样品各4g分别接种于80 mL的液体培养基中，于不同时间观察小麦秸秆分解情况，测定培养至16d的秸秆分解率，选取对小麦秸秆分解效果最好的培养物进行连续传代培养。当肉眼看到小麦秸秆的主体结构被分解成丝状后即转接传代，利用聚合酶链式-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）[17]检测微生物群落结构的变化，直到分子指纹图谱稳定，获得结构稳定的复合菌群为止，命名为FWD1。初始菌源富集培养为1代，以后转接依次为2、3、4…n代，每10d转接一代。以下试验操作都是在复合菌群FWD1结构稳定后以第23代培养物为对象进行的。
表1土壤样品基本状况与性质
Table1Basic properties of different soils
样品编号海拔/m pH含水量/%
竹林QLA872 6.3718.21
槐林QLB770 6.0513.90
栗林QLC932 5.8719.12
柏林QLD622 6.3516.52
槲林QLE1104 6.4818.59
华山松QLF2081 6.7925.77
锐齿栎QLG1610 6.2623.06
油松QLH1386 6.5421.57
冷杉QLI2600 6.3657.04
图1混合标准溶液的气相色谱图
Figure 1Gas chromatogram of mixed standard solution
表2土壤样品和复合菌群对小麦秸秆的分解情况
Table 2Degradation of wheat straw by soils and
microbial consortium
注：不同小写字母表示各处理间差异极显著（P <0.01）。
Note ：Different lowercase letters indicate extremely significant differ -ences （P <0.01）between different treatments.
项目编号秸秆分解率/%竹林QLA 38.42±0.06b 槐林QLB 29.00±0.04bc 栗林QLC 38.58±0.07b 柏林QLD 39.00±0.03b 槲林QLE 34.42±0.12bc 华山松QLF 24.75±0.07bc 锐齿栎QLG 21.33±0.06c 油松QLH 33.06±0.05bc 冷杉QLI 41.28±0.09b 复合菌群
FWD1
76.92±8.39a
发酵前称量添加干秸秆的质量，发酵结束后，
发酵剩余物8000r ·min -1离心10min ，弃去上清液，
然后用去离子水洗2次，收集沉淀物于105℃烘干至恒重，计算麦秸失重和分解率，
以不接菌处理作为对照，设置3个重复。
1.5.4小麦秸秆降解液组成分析
发酵液12000r ·min -1离心10min 后用0.45μm 微孔滤膜过滤，用日本岛津GC-14C 型气相色谱测定。色谱条件为：
色谱柱为DB-WAX 毛细管柱（30m ×0.320mm ×0.5μm ），FID 氢火焰检测器，载气为氮气，柱温190℃，进样口温度220℃，检测器温度为250℃。
程序升温过程如下：60℃保持2min ，然后以15℃·
min -1升至110℃，再以l0℃·min -1升至180℃。分别称取乙醇、乙酸、丙酸和丁酸各1g ，用超纯
水定容到500mL 容量瓶中，得标准储备液（2000mg ·L -1）。使用时，分别取1、2、3、4、5mL 标准储备液到100mL 容量瓶中，定容混匀，
该曲线浓度分别为20、40、60、80、100mg ·L -1，绘出混合液的标准曲线，
采用外标法测定发酵液中乙醇和各种有机酸浓度。
混合标准溶液的气相色谱图如图1所示。1.5.5DNA 的提取与高通量测序分析
采用Soil DNA Kit 试剂盒（OMEGA 公司）提取土
壤样品及第23代培养物的DNA ，
1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 完整性。利用细菌16S rRNA 基因的通用
引物515（5′-GTGCCAGCMG -CCGCGG-3′）和907R （5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）扩增其V4-V5区基因片段，修饰后的通用引物含有不同的Tag 标签用以区分不同样品。扩增程序如下：95℃预变性2min ，95℃变性30s ，55℃退火30s ，72℃延伸45s ，25个循环，72℃终延伸10min 后结束。PCR 产物经过切胶纯化、等摩尔数混合后以备高通量测序分析。
高通量数据分析采用Quantitative Insights Into
Microbial Ecology （QIIME ）。只有序列长度大于50bp ，平均质量得分大于20，连续相同碱基小于6，模糊碱基小于2的序列才能进行后续分析[19]。利用一个自定
义代码通过完全连锁聚类运算，
读段聚集成为最小分类单元（OTU ）[20]
。选取相似度在97%条件下的OTU ，得到稀释曲线、细菌多样性指数和群落结构。高通量分析具体流程参考已有的方法[21]。1.6数据处理与分析
所有试验数据采用Excel 2007进行均值和标准
差计算并作图，采用DPS 7.05统计分析软件对数据进行单因素方差分析，采用t-test 检测显著性差异（LSD ）。
2
结果与分析
2.1复合菌群FWD1的构建及其分解效果
9份土壤样品在富集培养16d 后，QLI 样品对秸
秆的分解率最高，达到41.28%（表2），以该样品为菌种来源进行复合菌群的筛选。筛选过程中，以第7代、
第9代、第11代、第15代和第23代培养物的基因组DNA 为模板，
对其16S rRNA 基因的V3区域进行细菌PCR-DGGE 分析，以检测该菌群的群落结构变化。结果表明，
第9代、第11代、第15代和第23代的主要细菌组成条带位置和亮度均未发生变化
（图2），表明至第9代时，培养物中细菌的群落组成结构已经稳定，至此获得了结构稳定的小麦秸秆分解复合菌群FWD1。该菌群在10d 内对小麦秸秆
1.501.251.000.750.500.250
1.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.012.0
3.42min 丁酸2.97min
丙酸
2.49min
乙酸
1.71min 乙醇t /min
图4相似度为0.97条件下FWD1和QLI 的稀释曲线
Figure 4Rarefaction curves of OTUs clustered at 97%sequence
identity across FWD1and QLI
4003002001000条带数
5000
QLI
FWD11000015000
20000
25000
图216S rRNA 基因PCR-DGGE 图谱
Figure 2PCR-DGGE patterns of 16S rRNA gene from
different generations
图3发酵过程中乙醇和有机酸浓度变化
Figure 3Changes of organic acids and ethanol concentrations during wheat straw degradation
的分解率达到76.92%（表2），与QLI 样品有极显著差异。
2.2小麦秸秆降解液组成分析
由图3可见，复合菌群FWD1分解小麦秸秆过
程中发酵液成分主要为乙酸、
丙酸、丁酸和乙醇，其中乙酸的含量最高。培养过程中，
乙酸浓度呈现出先升高后降低，再升高的趋势。在发酵第1d 时乙酸的含量为140.14mg ·L -1，第3d 时就达到了最大值655.54
；而乙醇、丙酸和丁酸分别在第1、
3、7d 时达到最大值18.87、127.17、27.47mg ·
L -1。2.3FWD1和QLI 测序结果及取样深度验证
对FWD1和QLI 中的细菌16S rRNA 基因序列进行高通量测序的结果表明（图4），删除低质量序列
后，在97%的序列相似度水平上，
FWD1和QLI 获得的细菌OTU 分别为44和382，序列读数分别为23912和10248。
稀释曲线可以用来说明样本的测序数据量是否
合理。从图4可以看出，
FWD1和QLI 的稀释曲线均趋向于平缓，说明
测序数据量合理，
能够比较真实地2520151050t /d
13
5
6
7
8
（a ）
8007006005004003002001000t /d
1
3
5
6
7
8
（b ）
160140120100806040200t /d
1
3
5
6
7
8
（c ）
302520151050t /d
1
3
5
6
7
8
（d ）
表3FWD1和QLI 中细菌丰富度和多样性指数Table 3OTUs'abundance and diversity of FWD1and QLI
样品Chao 指数Ace 指数Shannon 指数Simpson 指数
FWD144
0.71 2.670.10QLI
3820.87
5.19
0.01
反映样品的细菌群落，
代表细菌群落多样性。2.4FWD1和QLI 中细菌群落多样性指数分析
FWD1和QLI 中细菌群落的丰富度指数（Chao ）、
均匀度指数（Ace ）和多样性指数
（Shannon 和Simp -son ）见表3。就物种丰富度而言，
QLI 比FWD1高，表明FWD1中细菌的物种数量可能减少。
Ace 指数变化显示FWD1中细菌群落均匀度下降，反映出FWD1中某些细菌种群发育较好，在群落中的优势度上升，相反原本在QLI 中生长发育良好的细菌受到抑制甚至消失。
FWD1中细菌种群优势度的变化可能与其丰富度的变化有关，但这也反映出在选择性底物作用下
只富集了特定的微生物菌群。
较高的Shannon 指数表明，与稳定的复合菌群相比，原始土壤样品具有更高的微生物多样性。
2.5FWD1和QLI 中细菌群落组成分析FWD1和QLI 在门和种分类水平上的细菌相对
丰度如图5所示。
在门的分类水平上（图5a ），小麦秸秆分解复合
菌群FWD1中的细菌种类相对较少，主要含有变形菌门（Proteobacteria ）、厚壁菌门（Firmicutes ）和拟杆菌
门（Bacteroidetes ），分别占细菌总量的67.41%、19.25%和13.34%。
QLI 中的细菌类型丰富，主要包括变形菌门、酸杆菌门（Acidobacteria ）、拟杆菌门、
放线菌门（Actinobacteria ）和浮霉菌门（Planctomycetes ）等菌群，其中变形菌门、酸杆菌门和拟杆菌门在土壤细菌中
相对丰度较高，
分别为41.61%、24.04%和18.03%。经过长期筛选进化，FWD1中富集了变形菌门和厚壁菌门。
在种的分类水平上（图5b ），
FWD1中共确定出21种细菌，其中Clostridium sp.BNL1100，uncultured A lcaligenes sp.，uncultured Alcaligenaceae bacterium 和Brevundimonas diminuta 为优势菌，分别占细菌总量的11.80%、10.30%、6.70%和3.60%。QLI 中的细菌主要由uncultured bacterium ，
uncultured Bacteroidetes bac -terium 和uncultured alpha-proteobacterium 等组成。在
选择性底物作用下，
FWD1中富集了以Clostridium sp.BNL1100为主的菌株，其所占比例从0.01%上升到
11.80%。
3讨论
在自然界中，木质纤维素的降解是多种微生物协同作用的结果，微生物不同降解效率不同[32]。本文筛
（a ）
FWD1和QLI 在门分类水平上的细菌相对丰度；（b ）
FWD1和QLI 在种分类水平上的细菌相对丰度（a ）
Relative abundance of bacteria of QLI and FWD1at phylum level;（b ）
Relative abundance of bacteria of QLI and FWD1at species level.图5FWD1和QLI 在门和种分类水平上的细菌相对丰度Figure 5Relative abundance of bacteria of FWD1and QLI at both
phylum and species levels
other
uncultured rhodocyclaceae bacterium Clostridium bifermentans uncultured soil bacterium uncultured proteobacterium uncultured bacterium
uncultured alpha proteobacterium
uncultured pseudomonadales bacterium uncultured oxalobacteraceae bacterium uncultured nitrosomonadaceae bacterium uncultured burkholderiaceae bacterium uncultured bacteroidetes bacterium uncultured aquamicobium sp.uncultured alcaligenes sp.
uncultured alcaligenaceae bacterium Clostridium propionicum Coostridium aminovalericum unclassified
Sporomusa sphaeroides Psedomonas aeruginosa Flavobacterium johnsoniae Clostridium sp.NNL1100Brevundimonas
diminuta
选和驯化了小麦秸秆分解复合菌群FWD1，该菌群10d内对秸秆的分解率达到76.92%，代谢产物主要
为乙酸、丙酸、丁酸和乙醇，其中乙酸含量最高。研究表明适宜甲烷发酵的最佳发酵产物顺序为一碳有机化合物、乙酸、乙醇和丁酸[22]，因此可以将复合菌群FWD1应用于提高甲烷发酵的效果，例如将复合菌群作为甲烷发酵系统中水解酸化相的接种物，提高水解酸化程度，进而提高产沼气速率[23-24]；或者在发酵反应器启动过程中添加复合菌群，从而加快启动速度[25]。
高通量测序结果表明，FWD1中主要含有变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门，与杜然等[26]、Wongwilaiwalin 等[27]和乔江涛等[28]的研究结果相似，说明微生物协同降解木质纤维素的机制可能相似。更细化分类水平上，FWD1中主要包括丰度最高的Clostridium sp. BNL1100和一些不同需氧程度的uncultured A lcali-genes sp.，uncultured Alcaligenaceae bacterium和Bre-vundimonas diminuta。研究表明Clostridium sp.BNL1100分离自以玉米秸秆为碳源的富集培养物中，是重要的纤维素降解菌[29-30]。从微生物组成上可以看出，除了具有纤维素降解能力的梭菌存在外，菌群中还有其他的具有木质纤维素降解活性或不具有该活性的菌株。这与Mitchell等[31]在不同的生物质降解环境中能同时检测到厌氧的木质纤维素降解菌株和兼性厌氧的非功能菌株的结果是一致的。其中的非功能好氧菌可能在为木质纤维素降解功能菌提供厌氧环境、生长促进因子及中和pH方面起着至关重要的作用[32-33]，另外部分菌株在生长过程中产生的表面活性剂类代谢产物也会在一定程度上促进木质纤维素降解[34-35]，正是在这些菌群的共同作用下实现了木质纤维素的高效降解。
经过长期筛选进化，复合菌群FWD1细菌多样性下降，然而在选择性底物作用下富集了特定的微生物菌群，在门的级别上富集了变形菌门和厚壁菌门，在种的级别上富集了以Clostridium sp.BNL1100为主的纤维素降解菌。这也进一步解释了在木质纤维素分解能力上，复合菌群FWD1相对于原始土壤样品QLI 具有显著优势的原因。
复合菌群FWD1高效的木质纤维素降解能力，必然与菌群中木质纤维素降解酶的协同降解作用密切相关。因此，可以进一步利用宏基因组技术对该菌群中相关的木质纤维素降解酶基因进行克隆表达，并利用表达产物对木质纤维素进行直接酶解糖化，从而有效发挥复合菌群在农业废弃物能源转化方面的潜能。
4结论
本实验采用限制性培养条件和连续继代培养，构建了小麦秸秆分解复合菌群FWD1。该菌群在10d内对小麦秸秆的分解率达到76.92%，代谢产物以乙酸为主。
高通量测序结果表明，复合菌群FWD1中主要含有变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门，在种的分类水平上Clostridium sp.BNL1100，uncultured Alcaligenes
sp.，uncultured Alcaligenaceae bacterium和Brevundi-monas diminuta为优势菌群。在选择性底物作用下，富集了变形菌门和厚壁菌门，更细化分类水平上，富集了以Clostridium sp.BNL1100为主的纤维素降解菌。参考文献：
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