ICR小鼠胚胎干细胞分离培养及电融合法制作小鼠四倍体胚胎

裂球的细胞膜发生融合。两个二倍体的卵裂球融合得到的是四倍体胚胎，多个二倍体卵裂球的融合或卵裂球的连续融合则可以得到多种多倍体胚胎．

图１电融合原理

２．２电融合胚胎发育的形态学

２．２．１发育时序

经电融合后，胚胎的两个卵裂球逐渐融合为一个细胞，融合后第二天发育为４．细胞，融合胚在４．细胞期即发生致密化，相当于正常胚胎的８．细胞时期。而且与正常胚胎同时产生囊胚腔，形成囊胚。融合胚发育进程与体内发育胚胎和体外培养胚胎基本一致。

２．２．２细胞核形态

融合胚的细胞核显著大于体外发育、体内发育的同一时期胚胎的核，且绝大多数星椭圆形，核内有多个核仁或核仁里不规则分叶状；而体内发育囊胚的细胞核大多数呈圆形，有１以个核仁．

２．２．３囊胚形态

体内发育的正常扩展囊胚呈椭圆形，滋养层细胞的核分布很有序，呈网点状，一端明显可见内细胞团。融合胚发育到扩展囊胚时，核分布不整齐，大多数融合胚看不到内细胞团．在光学显微镜下观察，小鼠的四倍体和八倍体囊胚与正常二倍体囊胚在形态上没有区别，到达囊胚期的时间也基本一致。但用激光扫描共聚焦显微镜对多倍体小鼠囊胚进行形态观察发现，二倍体小鼠囊胚中的细胞数目较多，而四倍体小鼠囊胚中的细胞数目只有二倍体小鼠囊胚中细胞数目的一半左右，且细胞核相对较大：八倍体囊胚中的细胞数目通常只有４西个，细胞核的体积明显大于二倍体和四倍体的囊胚中的细胞核（图２）．

图２小鼠２ｎ－４ｎ，钿核型分析（李光鹏等，１９９６））

问题的首要步聚是建立体外研究模型和实验动物模型，探索治疗方案，再用于患者的治疗，在这一过程中还需要解决很多难题。只有全世界有关专家的共同努力和协作，才能最终用Ｅｓ细胞造福人类。

４小鼠胚胎千细胞体外分离培养技术

分离Ｅｓ细胞的实质是使具有全能性的早期胚胎细胞或Ｐ（配大量增殖而不发生分化。下面以小鼠Ｅｓ细胞的分离培养为例，概述ＥＳ细胞分离培养的主要技术环节（图５）

图５ＥＳ细胞分离培养的主要环节

４．１胚胎干细胞分离的主要方法

从着床前（孕３＿５ｄ）的胚泡中分离内细胞群（ＩＣＭ）细胞，是从早期胚胎建立鹳细胞系的第一步，也是建立ＥＳｃ系得最主要的先决条件。目前胚胎干细胞主要有两个来源，即胚泡内细胞群和生殖嵴中的原始生殖细胞，前者更为常用。从胚泡中分离内细胞群的方Ｎ：－ｌｚ要有三种：

４．１．１免疫外科学方法

免疫外科法是用酸或链蛋白酶去透明带之后，使裸胚与兔抗鼠脾淋巴细胞抗体、补体分别作用一段时间，滋养层细胞破裂崩解，再机械分离ＩＣＭ细胞．

体外培养的小鼠胚泡去除透明带后。经兔抗Ｊａｔ小鼠脾脏细胞抗血清（抗Ｈ－２）作用３０ｒａｉｎ，移至１：６稀释的新鲜豚鼠血清中作用３０ｒａｉｎ，强蜮冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存Ｉａ脚胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ＩＣＭ细胞进行培养。