标记免疫测定技术的研究进展
文章编号:100122087(2006)0620699204 中图分类号:R446.61 文献标识码:A
标记免疫测定技术的研究进展
卢仁泉综述, 郑佐娅审校
(上海交通大学医学院医学检验重点实验室,上海200023)
关键词:标记;免疫测定;进展
作者简介:卢仁泉,男,1975年生,主管技师,主要从事免疫学测定研究。
近年来检验医学迅速发展,临床实验室使用的免疫测定技术也日新月异。作为临床免疫测定技术的一个重要分支———标记免疫测定技术是最为活跃的,也是发展最快的,其基本原理是利用抗原抗体反应的高度特异性,加上各种标记物的可测量性来达到方便敏感地检测体内各种微量生物活性物质的目的。
美国学者Yal ow 和Bers on 于1959年建立了放射免疫
测定(R I A ),开创标记免疫分析的先河[1]。R I A 采用放射
性核素作为标记物,一般分3个步骤:抗原抗体的竞争抑制反应、结合态(B )与游离态(F )的分离及放射性的测量。其后在R I A 基础上又出现了免疫放射测定(I R MA ),其特点是核素标记的抗体直接与受检抗原反应并用固相免疫吸附剂作为B 或F 的分离手段,1968年由M iles 和
Heles 改进为双位点免疫结合,使其取得了广泛的应用。
放射性核素的标记技术是标记免疫测定的重要的里程碑,其优点是准确灵敏、技术成熟、仪器试剂成本较低。然而,该技术的固有缺陷(如试剂盒的使用寿命短,批内批间不精密度较大,每次测定同时须做标准曲线,难以进行自动化分析以及放射性污染的负面影响等),使其受到了层出不穷的新技术的挑战,在当前免疫检测中已使用较少,有逐渐被取代之势,我们不做主要叙述。
上世纪70年代以来,新型标记物(如酶、荧光物质、发光剂、胶体金等)不断推出,使标记免疫分析朝着更敏感、简便、可靠以及多项联合检测的方向发展,结合自动化仪器使其呈现出检测速度快、能大批量处理标本和结果稳定等特点。我们主要就目前非放射性标记免疫分析的新技术及发展趋势,按标记物的类型分为酶标记技术、荧光标记技术、化学发光标记技术以及有色标记技术等4大类进行介绍。
一、酶标记技术
1971年Engvall 和Perl m ann 用酶代替核素进行标记,
创立了酶联免疫吸附试验(enzy me 2linked i m munos orbent
assay,E L I S A ),将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效
催化作用结合起来。因为制备的酶标记物可稳定保存较长时间,且此法既无放射性污染又不需要昂贵的测试仪器,所以比R I A 更易推广。酶免疫测定技术(enzy me i m 2
munoassay,E I A )
[2]
,根据抗原抗体反应后是否需要分离结
合的和游离的酶标记物,可分为均相和异相2种类型。
1.均相E I A 均相E I A 测定模式为竞争结合分析
法,主要用于小分子抗原、半抗原或药物测定。最早取得实际应用的是酶扩大免疫测定技术(E M I T ),是由美国
Syva 公司研制成功的,标记酶为葡萄糖262磷酸脱氢酶,酶
将底物辅酶I (NAD +)转化为还原型辅酶I (NADH ),用分光光度法进行测定,国外有较广的应用;此外,还有一种
均相E I A 称克隆酶供体免疫测定(CE D I A )[3]
,利用重组
DNA 技术分别克隆合成某种功能性酶分子的2个无活性
片段:酶供体(E D )和酶受体(E A ),E D 标记抗原和样品中的抗原竞争结合特异性抗体,游离的E D 标记抗原可与
E A 结合形成有活性的全酶,酶活性与样品中抗原含量呈
正比。1992年M icr ogenits 公司开发的CE D I A ,应用基因重组的β2半乳糖苷酶,检测敏感性为10-11mol/L 。两者相比较而言,E M I T 的应用较CE D I A 更广泛。
2.异相E I A 均相E I A 是利用免疫反应的同时酶活
性改变来测定,而异相E I A 中作为标记的酶本身活性并不改变,是通过分离结合的与游离的酶标记物而检测,较均相E I A 更广泛被使用。其中E L I S A 目前应用最为广泛,它常用聚苯乙烯为固相载体,有微孔板、小管、小珠、微粒等类型。目前E L I S A 自动化测定仪主要有美国
Dynex 公司D I A S T M
系统和Roche 公司的Cobas Core Ⅱ系统
等,测定的变异系数(CV )通常在10%以内。(1)固相载体的改进:E L I S A 技术多采用微孔板固相法,良好的
E L I S A 微孔板应该是吸附性能好,空白值低,各孔差异小,
而且理想的包被技术是以共价键结合取代物理吸附,丹麦Nunc 公司研制的氨基化聚苯乙烯酶标板在微孔内表面引入仲氨基(氨基臂长2n m ),用以连接抗体或抗原后,充分暴露抗体或抗原的结合位点,反应充分,近年来出现的琥珀酰亚胺酯活化的酶标板也具有类似的特性,后来有人采用带有磁性的聚苯乙烯微粒为固相载体[4],用以包被抗体或抗原,在磁力的吸引下与液相分离,方便快速,测定所需时间减少,且其表面积大,测定中所需样品量也极少,较早应用磁微粒作为酶免疫测定固相的是瑞士Ser ono 公司Ser ozy me 分析系统,后来Ser ono 公司又
推出全自动的SR I≥免疫分析系统,此外日本Tos oh公司的A I A≥2600免疫测定系统用外加磁场保持磁珠在温育过程不停搅动,缩短了温育时间,现已推出更为先进的A I A≥21800和G7免疫分析系统,具有高度敏感性、线性范围宽、检测迅速等突出优点;(2)放大系统:近年引入各种放大系统使得E I A敏感性有了很大的改进,除常用的底物循环、酶2抗酶复合物系统、生物素2亲和素/链霉亲和素系统(ABC法)放大等方法外,出现了催化受体沉积(C ARD)技术和微颗粒放大技术等,CARD技术[5]利用酶催化苯酚结合物沉积和连接生物素2亲和素、酶催化放大等技术可使体系放大200倍以上,而在微颗粒放大技术中,利用微颗粒硅胶作为中间体连接酶和抗体,避免酶和抗体的直接连接,每粒硅胶可接上千个酶分子,从而体系的敏感性可放大2个数量级;(3)衍生技术:随着酶免疫分析技术的不断发展,同时也发展了新的衍生技术,如荧光酶免疫分析(FE I A)及化学发光酶免疫分析(C LE I A), CLE I A在本文的“化学发光标记技术”中阐述,FE I A、CLE2 I A与一般E I A的区别是酶所催化的底物是荧光剂或发光剂,产物不再是有色物质,而是荧光产物或发光产物,所发出的光可用特定的仪器测定,从而大大提高了敏感性,根据需要发展和应用这些放大和衍生技术是酶免疫分析发展的方向,例如美国Abbott公司AxSy m全自动酶免疫荧光分析系统用碱性磷酸酶(ALP)作标记酶,以42甲基伞型酮磷酸盐(42MUP)为酶反应荧光底物,42MUP在酶的作用下分解脱磷酸基团生成42甲基伞型酮,其在360n m激发光的照射下,发出448n m荧光,最终根据经荧光计数仪记录所产生的荧光强度来计算所测定的浓度[6];(4)联用其他技术:与其他测定技术联用,如联用聚合酶链反应(PCR)技术的PCR2E L I S A分析、联用十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS2P AGE)技术的免疫印迹法(E I T B)、联用固相膜渗滤技术的斑点2E L I S A、联用基因工程技术生产的重组单链抗体片段(SeFv)或双特异性抗体(bis pecific monocl onal antibodies,bs M c Ab), bs M c Ab应用于E L I S A,bs Mc Ab的一个臂结合靶抗原,另一个臂结合酶,不必进行酶标抗体的制备,避免了标记反应中对酶的活性的损伤,这使得E L I S A操作简化且质量提高[7]。所有这些都推动酶免疫测定技术的应用更加广泛。
二、荧光标记技术
1.免疫荧光测定法(i m munofluorescence assay,I F A) 根据R I A和E I A的原理,20世纪70年代采用荧光素作为标记物,建立了I F A。常用的荧光素有异硫氰基荧光素(F I TC)、四乙基罗丹明(RB200)等。这种传统的荧光免疫分析受到散射光、来自样品的背景荧光和荧光淬灭等因素的干扰,分析敏感性较低,为10-8～10-12mol/L水平,现在主要用在流式细胞仪和荧光免疫组化分析中。
2.时间分辨荧光免疫(TRF I A) S oini和Koj ola在1983年建立了TRF I A,TRF I A使用的标记物不再是荧光素,而是采用镧系元素———铕(Eu3+)、铽(Tb3+)、钐(S m3+)等标记抗体或抗原,Eu3+等在紫外光激发下,发射荧光强度高且衰变时间长(60～900μs),可待短寿命的本底荧光(仅1～10ns)衰退后再进行测量,获得Eu3+的特异荧光信号,几乎可以完全消除非特异荧光物质的干扰。但实际应用中须加入增强剂使Eu3+从pH值
3.2条件下解离出来,并和增强液中的β2二酮体或三辛基氧化膦形成新的荧光微囊,荧光信号增强100万倍,故又称为解离增强镧系荧光免疫分析(DE LF I A),如芬兰PerkinEl m erW allac公司推出的Aut oDE LF I A1235、1420全自动时间分辨荧光免疫检测系统就应用此原理。此后1987年加拿大Cyber Fluor公司的Cyber Fluor615型荧光测定系统使用一种双功能络合剂———4,72二氯磺基苯21, 102菲罗啉22,92二(BCP DA),同时引入生物素2亲和素系统,只要络合1次,并在固相状态下测量,受污染影响小得多。由于各镧系离子间荧光衰减时间及波长差异很大,He mm ila等[8]首先提出以双标记技术同时以不同稀土离子(Eu3+和Tb3+)分别标记2种待测物,完成血清中促黄体激素(LH)和促卵泡激素(FS H)的定量分析,该原理用途广泛,例如可同时测定孕妇血清中的甲胎蛋白和游离的人绒毛膜促性腺激素(HCG),用于筛查胎儿神经管缺损和唐氏综合征等。与R I A和E I A相比,TRF I A更特异、精密,而且敏感性实现了分析方法学的突破,可高达10-19mol/L水平[9],因而成为20世纪90年代标记免疫分析技术中的新秀。问世时间虽短,发展却十分迅速,成为当代标记免疫分析中最有发展前途的超微量检测手段之一。
3.新型荧光标记 近年来报道了利用荧光纳米微粒代替有机荧光染料作为生物分子标记物[10],成功地标记了转移蛋白和免疫球蛋白等,预示其可作为新一代荧光标记物应用于医学测定领域的巨大潜力。荧光纳米微粒具有更好的荧光特性,并可以通过改变粒径得到具有不同发光颜色的材料,使选用一种激发波长进行多色分析成为可能,即多种粒径的荧光微粒同时标记不同的指标联合检测,在460～731n m的范围内可分为8条谱带。例如A rcD ia TPX技术即为基于包被荧光微粒的微球作为固相反应载体和荧光亲和试剂,检测荧光信号,有很好的敏感性,可用于检测C反应蛋白(CRP)[11]。
当前看来,荧光免疫分析发展趋势:开发新型荧光纳米微粒作为标记物;应用多重标记技术实现多个待测物同时检测;选择活性基团密度高的载体实现多重标记以提高分析敏感性;不使用增强液而改用酶促放大荧光剂以克服T RF I A易受外源性污染影响等。目前国外的TR2 F I A系列试剂盒多已商品化,包括检测甲状腺激素、甾体类激素、肝炎病毒、药物、多肽和蛋白质类、DNA核酸类等,我国目前也已开始有部分试剂盒研制成功,相信不久的将来会有国产仪器投入市场。
三、化学发光标记技术
A raka we于1975年首先报道了化学发光免疫测定技术(CL I A),它与荧光免疫分析本质区别在于化学反应过
程中所产生的化学能使分子激发产生发射光;同时也不会受自然本底的干扰(生物样品中几乎没有化学发光现象),信噪比较高。也不象E I A因为使用底物显色有标准曲线直线范围较窄的限制。随着各种CL I A自动分析仪的相继问世,其优越性使这一方法仅仅用了十几年时间就获得了普遍的应用。根据C L I A所使用的标记物,目前分为3种类型:
1.直接化学发光标记法 这类测定标记物在化学结构上有产生发光的特殊基团,直接参与发光反应。主要以吖啶酯类为代表。吖啶酯体系具有不需酶作催化剂、受外界因素干扰少、信噪比高、标记简单等优点。如德国拜耳公司的ACS180和ADV I A Centaur全自动化学发光免疫分析系统标记用的化学发光底物为吖啶酯,使用磁微粒作为固相载体,易于清洗且反应速度加快。
2.酶标记化学发光分析法(CLE I A) 反应中使用某些酶标记抗体或抗原,检测反应中形成酶标记的抗原2抗体复合物,发光底物在其作用下产生化学发光。从标记免疫测定来看,应属于E I A,因为其测定的是化学反应发出的光量子,为了叙述理解的方便,在此阐述。主要有(1)辣根过氧化物酶标记2鲁米诺为发光底物,在碱性缓冲液中进行,通常有过氧化氢(H
2
O2)参与反应,鲁米诺类的发光反应(与吖啶酯类不同)必须有催化剂,且与蛋白质或多肽结合后发光作用减弱,这类仪器较少,有美国强生公司V itr os EC I;(2)碱性磷酸酶(ALP)标记2二氧乙烷衍生物(AM PP D)为发光底物,通过化学反应发出的光在特定的仪器上进行测定,试剂稳定,无毒害。这类仪器目前使用较多,Beck man Coulter公司的Access全自动化学发光免疫测定系统、美国DPC公司的I m mulite等,采用粒径<7μm的磁微粒为固相载体,开机10～15m in即可出第1个结果。ALP2AMPP D发光体系是已知最灵敏的发光分析系统,其检测限可达10-21mol/L。
3.电化学发光(EC L I A) 1990年Leland等[12]首次将化学发光(CL)中使用的三丙胺(TP A)与发光化合物三
联吡啶钌[Ru(bpy)
3
]2+组合,因为[Ru(bpy)3]2+衍生物相对分子质量很小,与免疫球蛋白结合的分子比>20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性,而建立了一种新颖的ECL I A反应系统。这一技术便是ECL I A的基础, EC L I A应用了电促发光技术,以能量传递参与化学反应的非酶标记物参与,采用N2羟基琉珀酰胺酯(NHS)酯标记抗体或抗原,TP A参与化学反应,发出的光在电极表面又转为电信号,反映样品中的抗原或抗体的量。由于稀土元素钌也具有发光时间较长的优点,故敏感性较高,并且利用电极上的氧化还原反应来进行分析,具有实现均相测量和多元检测等独特的优点。瑞士Roche公司的Elesys1010、Elesys2010系统综合了各种先进技术如采用2.8μm的磁微粒为固相载体、引入链霉亲和素2生物素包被系统等,2001年推出电化学发光免疫分析模块E170,该模块可以组合,每小时最多可进行680个测试,有100个试剂通道,目前处于领先地位。
CL I A最终测定的是光电子,敏感性高、特异性强,检测试剂稳定,且操作智能化程度高,故它也是目前最有发展前途的免疫分析方法之一。
四、有色标记技术
在免疫学测定中,除了用放射性物质、酶、荧光、化学发光标记抗体或抗原外,也常常利用一些物质本身具有颜色作为免疫标记物,可直接观察。这类标记物有彩色胶乳、胶体金、胶体硒等,以红色的胶体金最为常用。它们具有直观、快速、操作简便等优点,是免疫测定技术的一个重要方向,近年来在临床诊断、床边检测(point of care testing,P OCT)方面的应用发展迅速。
1.彩色胶乳标记 自1956年Singer将人I gG吸附在聚苯乙烯胶乳颗粒上,首次建立检测类风湿因子(RF)的胶乳凝集试验(LAT)以来,以其简便、经济和实用的特点,在免疫学领域崭露头角。20世纪80年代末国外推出的彩色胶乳[13]已开始应用,这种彩色胶乳是由苯乙烯加染料聚合而成的。该技术关键是使染料(通常为水不溶性)或发色基团包裹在微球的核心区域,而不是结合在表面。通过用不同颜色的胶乳微球,分别标记不同种沙门菌对应的抗体,可以鉴定感染沙门菌的类型。
2.胶体金标记 20世纪80年代末发展的胶体金免疫测定技术(GI A)是以胶体金为标记物,以硝酸纤维素膜为固相载体,形成肉眼可见的红色免疫反应复合物。(1) GI A类型:根据B和F的分离形式有2种类型:胶体金免疫渗滤法(GI F A)和胶体金免疫层析法(GI CA),两者均为异相免疫分析方法,1989年DuPont公司推出了用于检测抗人类免疫缺陷病毒(H I V)抗体的GI F A,确立了GI F A的基本技术,国内1991年即有GI F A试剂生产,用于检测尿液HCG的“金标”早孕诊断试剂取得了广泛应用,1990年Abbott公司的O ski owiez等建立了免疫层析试验(I CA),其原理与I F A相同,不同点在于液体的移动不是通过直向的穿流而是基于层析作用的横向流动,O ski owiez应用的标记物为硒,其后一般均采用简便的胶体金,整个反应只需1个试剂,一步就可完成,而且价格一般不贵,满足了P OCT的需要,发展很快,目前已广泛应用于传染病、肿瘤标志物、药物滥用、法医及寄生虫检查等领域,可以检测100多种抗原物质;(2)GI A进展:随着胶体金快速检测技术的逐步完善,可以对一个样品进行多项检测[14],也可以进行半定量或定量检测等,使其更易得到市场的青睐,实现多项检测即在同一膜上作多种项目测定,一次检测可同时得到一组结果,这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值,如对献血者检查乙型肝炎表面抗原(HB s Ag)、抗H I V抗体以及抗丙型肝炎病毒(HCV)抗体。此外,也发现在GI CA或GI F A中,阳性结果的显色深浅随着样品中受检物的浓度的变化而变化,
目前GI F A半定量主要有标准色阶对照法、质控点对比法、同时测定质控液法等,定量测定有挪威Nycomed公司Nycocard Reader II仪测定CRP等;而GI C A半定量主要有标准色板对照法、质控线对比法、多条不同亲和力的配体加样等,定量测定目前有罗氏公司Cardiac Reader仪测定心肌钙蛋白T和肌红蛋白,国内也有单位研制了小型金标试条读数仪测定HCG、甲胎蛋白(AFP)等[15]。
3.其他标记 如新型磁性纳米粒子通过表面修饰与抗体结合标记,当施加外加磁场即可增加磁性复合物的组装密度,检测敏感性提高了,在免疫层析试纸上,形成浅褐色条带(Fe
3
O4的颜色),故又称为磁标显色试条[16]。
五、展望
目前,在检验医学中所使用的多种标记免疫测定方法共存,相互竞争和补充。R I A发展到目前为止,技术固有缺陷使其必然受到新的更灵敏、快速、稳定的测定技术挑战,从现状来看非放射性免疫分析技术取代R I A只是时间问题。在非放射性标记免疫分析中,T RF I A和CL I A 近十年来发展迅猛,、反应测量直至结果计算全过程自动化,并且可以对多个待测物同时检测,具有综合优势和潜力,是目前临床实验室大型免疫测定仪器的两大主流。胶体金等有色标记技术可通过直接目测颜色从而达到快速检测的目的,十分简便,也可通过小型便携式仪器单个测试,是P OCT的发展方向之一。我们相信,将来随着各学科之间交叉互补、交叉渗透,标记免疫测定方法与其他技术的联用必将推动人们不断研究、开发出更新更理想的免疫分析技术。
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出版社,2005.1472150.
(收稿日期:2006207219)
(本文编辑:姜 敏)
(上接第698页)
规则名称规则定义可能的误差
13.0SD I至少有一个结果的SD I>3.0随机误差
175%EA任意1个结果的偏倚>75%的允许误差范围随机误差
5x&150%E A所有结果在均值一侧且任意1个结果的偏倚>50%的允许误差范围系统误差
R4.0SD I任意2个结果的SD I>4.0随机误差
第6期
一、单选题 1.C;2.C;3.B;4.E;5.B;6.C;7.B;8.B;9.D;10.C
二、问答题
1.答:特异性强、灵敏度高,比微生物法快,比免疫法经济。
2.答:质粒AmpC酶常可在肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌、奇异变形杆菌、沙门菌和志贺菌中检测到,因为克雷伯菌、奇异变形杆菌和沙门菌天然缺乏染色体AmpC酶,而大肠埃希菌及志贺菌的染色体AmpC酶有缺陷,从而避免了在检测质粒AmpC酶时,染色体AmpC酶的干扰。
免疫分析技术的应用
时间分辨荧光免疫分析技术的研究进展及在食品安全领域中的应用 应化1001 王旸慧 随着分析方法的飞速发展，无论是食品中有毒有害物质，还是环境中 痕量元素的检测，或者生物体内功能因子的分析，都迫切需要一种灵敏度高、快速准确、性能稳定的痕量分析方法。时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay，简称为TRFIA）是20世纪80 年代中 期发展起来的一种新的荧光标记技术。这种方法应用某些特殊的稀土金属，能够区分背景光的散射所引起的干扰，从而大大地提高了分析的灵敏度。与传统的酶免疫法（EIA）、发射免疫分析法（RIA）相比，它具有很多优点:灵敏度高达10-19；稳定性好，克服了酶和放射性荧光物质的不稳定性； 动态范围宽；试剂货架期长；无放射性危害等,时间分辨荧光分析目前被公 认为是灵敏度最高的分析方法之一。 一、时间分辨荧光免疫分析法的原理及优势 时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）是在荧光分析（FIA）的基础上发展 起来的一种特殊的荧光分析法。它利用了具有独特荧光特性的镧系元素及 其螯合物为示踪物，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及 生物细胞，以代替传统的荧光物质、酶、同位素、化学发光物质。用时间 分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度 和相对荧光强度的比值，准确地测定反应体系中被分析物的浓度。TRFIA 所 使用的荧光标记物是镧系稀土金属，由于镧系稀土金属离子螯合物有很长 的荧光寿命(微秒级)，有别于传统荧光的短荧光寿命，使其能通过时间分 辨方式区别于背景荧光（钠秒级），正是由于荧光衰变时间长，可以延缓 测量时间，待测样品中短寿命的本底荧光衰变后再测稀土离子的特异荧光，因此可完全消除本底荧光的干扰。镧系稀土金属离子螯合物荧光很宽的Stokes 位移使其容易通过波长分辨方式进一步区别于背景荧光，提高方法 学的稳定性。镧系稀土金属离子螯合物狭窄的荧光发射峰使其荧光检测具 有很高的效率，进一步提高了信号检测的特异性和灵敏性。此外，由于检 测时加入了荧光增强液，它可使原来荧光增强100万倍，以上各种因素使TRFIA 的检测灵敏度和准确性大大提高。 二、TRFIA 的反应模式 目前在实践中应用的主要有固相双位点夹心法和竞争法。夹心法多用 于蛋白质类大分子化合物的测定，竞争法多用于小分子半抗原的检测。反 应模式流程如下：
免疫标记技术讲解
课程名称：临床免疫学检验技术课题名称：免疫标记技术 组员：朱恩鹏拉巴卓嘎 张燕培汪婷婷
免疫标记技术 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。藉助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的发展以及现代高新技术建立的仪器分析的应用，免疫标记技术也不断完善和更新。各种新技术和新方法不断涌现，至今已成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术，在医学和其他生物学科的研究领域及临床检验中应用十分广泛。 根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫酶技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定等。 第一节放射免疫技术 放射免疫标记技术是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法，由于此项技术具有灵敏度高（可检测出毫微克（ng）至微微克（pg），甚至毫微微克（fg）的超微量物质，特异性强（可分辨结构类似的抗原）、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等多个优点。因此，在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。 （一）放射免疫测定（RIA） 放射免疫测定（Radio immunoassay , RIA）是1959 年Yalow 和Berson 首先创建的经典放射免疫分析技术，用于血清中胰岛素含量的测定。30 多年来，由于此项技术灵敏、特异、并已制成多种标准试剂盒，使用方便，应用范围十分广泛。目前国外已成功地应用RIA检测的物质多达300余种，国内研究的被测物质也达百余种，试制的RIA试剂盒已有60余种，是测定各种微量物质不可缺少的手段。 （二）免疫放射测定（IRMA）
儿童肿瘤免疫治疗的临床研究进展共9页文档
儿童肿瘤免疫治疗的临床研究进展 过去的 40 年，儿童肿瘤的治疗取得了令人瞩目的成绩。但是，每年的死亡病例仍不在少数，肿瘤复发和治疗相关的并发症是主要原因。因此，对于难治和复发的恶性肿瘤，开展免疫治疗不失为一挽救性策略。近年来肿瘤免疫治疗领域进展迅速，出现了许多新技术、新方法，临床试验正在开展，使之成为颇具前景的治疗儿童肿瘤的选择。 近期徐晓军等在中华儿科杂志发表文章将近年来该领域的临床研究进展综述如下。 一、基于单克隆抗体的靶向治疗 ?单克隆抗体通过识别肿瘤细胞表面的特异性肿瘤抗原，发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用和补体依赖的细胞毒作用而增强机体的抗肿瘤能力。针对 CD20 的利妥昔单抗在治疗儿童恶性淋巴瘤的临床应用中取得了很好的疗效。 通过 CD20 单抗和化疗的联合应用，儿童Ⅲ／Ⅳ期非霍奇金淋巴瘤 (NHL) 的 3 年无事件生存率 (EFS) 可达到 95%，显示出此类药物的良好临床应用前景。目前针对儿童淋巴系统恶性肿瘤正在研发或处于临床试验阶段的单克隆抗体包括抗 CD19、抗 CD22、抗 CD25、抗 CD30、抗 CD33、抗 CD45、抗 CD52 单抗以及抗 CD3/CD19 双抗等。 CD19 是治疗 B 系肿瘤的重要靶点。ALL 患儿造血干细胞移植前后输注
CD19 单抗可明显降低肿瘤负荷，反应率在 50% 以上，且患儿耐受性良好。抗 CD3/CD19 双抗 blinatumomab 是将抗 CD3 和抗 CD19 的单链抗体偶联，从而使细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 和 CD19+ 的靶细胞通过该介质迅速连接到一起，让 CTL 发挥杀伤作用。 成人 NHL 和 ALL 患者对 blinatumomab 具有良好的反应性，可以达到75% 以上的疾病缓解率。儿童方面，有病例报道 blinatumomab 的治疗可以使 ALL 移植后的复发病例获得完全缓解。而一项大规模的多中心研究表明，骨髓复发的 ALL 患儿通过 1-5 个疗程 blinatumomab 的治疗，47% 的骨髓复发病例可以达到骨髓细胞学和分子生物学缓解。 抗 CD22 单抗有望成为靶向治疗 B 系肿瘤的另一新药，第一代抗 CD22 免疫毒素 BL22（CD22 单抗与假单胞菌外毒素 A 偶联）在治疗儿童 ALL 和 NHL 方面耐受性良好，但患儿仅有短期的治疗反应，总体效果并不理想。第 2 代高亲和力 CD22 单抗免疫毒素治疗难治复发性的 CD22+ALL 和 NHL 的 I 期临床试验正在开展，中期结果表明其反应率达到 61%，其中 17% 的患者可以达到完全缓解。 CD30 单抗药物偶联体 brentuximab vedotin 治疗难治复发霍奇金淋巴瘤及间变大细胞淋巴瘤可以达到 75% - 85% 的反应率和 34% 的完全缓解率，但存在外周神经病变等副作用，因此，2019 年，美国、德国等 6 个国家联合开展了一项全球性的利用 brentuximab vedotin 治疗儿童霍奇金淋巴瘤及间变大细胞淋巴瘤的Ⅰ／Ⅱ期临床试验，目前该临床试验仍在进行中。
化学发光免疫分析技术及其应用研究进展
化学发光免疫分析技术及其应用研究进展 发表时间：2014-12-16T16:00:48.107Z 来源：《科学与技术》2014年第10期下供稿作者：岳伦 [导读] 通过对化学发光免疫分析技术及其应用的相关研究，我们可以发现，该项技术的良好效果已经被普遍应用在临床检验与检测当中岳伦 重庆热展建筑工程咨询服务中心重庆 400012 【摘要】本文首先介绍了化学发光免疫分析技术的基本原理，分析了其基本装置。在探讨化学发光免疫分析技术在临床检验中应用的基础上，研究了其应用进展。 【关键词】化学发光；免疫分析技术；应用；研究进展 一、前言 作为一项效果较为理想的分析技术，化学发光免疫分析技术近期得到了长足的发展。研究该项技术的应用进展情况，能够更好地把握其运用动态，以更好地指导该项技术的实际应用。本文从介绍该项技术的基本原理着手本课题的研究。 二、化学发光免疫分析技术的基本原理 化学发光免疫分析技术是由免疫分析和化学发光分析两个系统构成的。其中免疫分析是用标记物直接标记在抗原或抗体之上的，然后再经过抗原与抗体反应生成抗体免疫复合物，其中标记物可以是化学发光物质，也可以是某种酶。化学发光免疫分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，待发光物质氧化后就会形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测，其中被测物的含量就是根据化学发光标记物与发光强度的关系利用标准曲线计算出来的。 化学发光的原理是指分子或原子中的电子吸收能量后，发生能级跃迁而释放光子的过程，能级跃迁过程是电子从基态到激发态的过程，实现了从较低能级向较高能级的跃迁。其中可以根据形成激发态分子的能量来源不同将发光过程分为化学发光、光照发光和生物发光。 化学发光又可分为直接化学发光和间接化学发光，若参加反应的物质是一个反应产物分子，且被激发到能发射光的电子激发态，那么这就是直接化学发光过程。若参加反应的物质激发能传递到另一个未参加化学反应的分子D上，使D分子激发到电子激发态，D分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。 三、化学发光免疫分析的基本装置 1.电极材料的选择与制备 化学发光检测的基本模式决定了其在免疫传感中必须使用特定的光电活性电极。而免疫探针分子则在这种电极表面固定，随后的免疫识别反应也在该表面发生，所以光电活性材料的选择和制备与免疫传感的检测性能密切相关。理想的光电活性电极应该具有较低的电子空穴复合率，以便获得稳定的光电流密度。一般而言，在化学发光免疫传感中，光电活性电极的选择主要取决于所设计的检测路径与传感过程。常用的电极有整体电极和氧化铟锡（ITO）修饰电极。整体电极如二氧化钛纳米管阵列电极，ITO修饰电极则由ITO基底和光电修饰材料两部分构成。 2.免疫探针分子的固定 电极制备好后，免疫探针分子的固定是传感器制备中重要的一步，直接决定着传感器性能的优劣。原则上，电化学免疫传感器中可以使用的固定方法都可以用于化学发光传感。但因后者使用的电极材料有所不同，所以具体采用的固定方法往往和电极材料的种类以及实验的设计有关。另外，为了保证探针分子的准确定位与吸附以使探针分子在固定后保持较高的活性和稳定性并形成具有适宜厚度、密度、多孔性的敏感膜，同时为了避免非特异性吸附和结合的干扰，在固定这一步骤中需对电极的表面化学性质进行严格控制，因此需要对实验条件进行多重优化以便确定最佳条件。 四、化学发光免疫分析技术在临床检验中的应用 1.激素分析 所谓的激素，其实就是内分泌腺或者内分泌细胞所分泌出来的活性物质，是细胞之间进行信息传递的一种化学媒介。各种激素通过化学发光面积分析技术进行测定，然后由化学发光面积分析技术提供各种检测数据，化学发光面积分析技术检测能够为临床治疗、诊断，以及预后等提供相关数据，且数据可靠性非常高，将检测的灵敏度与特异性大大地提高了。 2.对肿瘤标志物的分析 所谓的肿瘤标志物，其实是肿瘤在增殖的过程中，有肿瘤相关细胞的合成与释放，或者是机体与该细胞产生反应后，生成的一种物质，如激素、蛋白质、酶以及癌基因等。在患者的体液、血液以及细胞与组织中都存在肿瘤标志物。化学发光面积分析技术对肿瘤患者（良性及恶性肿瘤）在早期进行辅助诊断，并且对术后进行监测，同时，它还能用于对新肿瘤标志物的寻找。相关检测人员对血清中的相关抗原及cyfra21-1的浓度进行了检测，结果显示，对于食管癌患者的诊断，以及对预后的监测，它们能够达到相关标准。相关检测人员对肝病中，细胞色素的含量进行了检测，结果显示，作为肝衰竭病症的新标志物，细胞色素C达标。 3.病原诊断 对于乙型肝炎病症，其病毒表面的抗原与抗体是在感染后，对免疫功能及治疗效果的评价指标是血清标志物。如果应用常规的酶检测法，很有可能会漏检一些病毒携带量少的患者。而化学发光面积分析技术的灵敏度以及线性范围比酶法更高。相关检测人员对容易感染相关病毒的围产期儿童体内的相关病毒进行了检测，结果显示，化学发光面积分析技术检测法比常规酶法的灵敏度更高。 五、化学发光免疫分析技术的应用进展 1.检测细菌及病毒细胞的是一切生命活动的基本组成单位，人体就是由千千万万的细胞集合而成，每个细胞就是一个独立的小生命，而控制着细胞的核心物质就是核酸，核酸是遗传物质基础，具有贮存、传递和表达遗传信息的功能。因此对标本中的核酸进行定量检测，对于临床准确、及时的诊断疾病，监测治疗效果是十分必要的。传统采用普通的细菌培养方法往往存在培养时间过长等诸多缺陷，因此，现在很多实验室都在寻求快速、灵敏的检测方法。研究表明用放大核酸序列分析的方法对食物中沙门杆菌进行检测，结果表明，应用化学
免疫荧光技术的实验方法及其分类
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
肝癌免疫治疗的研究现状及进展
肝癌免疫治疗的研究现状及进展 摘要】肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一。其发生与肿瘤的免疫逃逸密切相关。 随着免疫学和分子生物学的发展，免疫治疗已成为研究热点，并开始应用于临床，显示出广阔的应用前景。本文从主动免疫治疗和过继免疫治疗两个方面综述了肝 癌免疫治疗的现状和进展。 【关键词】肝癌免疫治疗 肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。目前治疗方法主要有手术切除、化疗栓塞、射频治疗、生物反应调节剂治疗等。放化疗最大的缺点是无特异性杀伤作用，副作用大，易对机体造成继发性损伤，即使是根治性手术也只能解决局部问题， 复发转移率高，预后差。研究表明，肿瘤的发生发展与机体免疫系统密切相关， 免疫逃逸是主要原因之一。如何打破免疫耐受，激活肿瘤的杀伤功能是肿瘤免疫 治疗的主要方向。目前，肝癌的免疫治疗有多种策略。 1 主动免疫 主动免疫是指利用肿瘤细胞的特异性抗原诱导机体产生特异性免疫，从而主 动杀伤肿瘤细胞。目前，肝癌的主动免疫包括树突状细胞疫苗、肿瘤细胞疫苗和 异种重组甲胎蛋白疫苗。 1.1树突状细胞疫苗 树突状细胞（DC）是体内功能最强的抗原提呈细胞。DC最重要的功能是激活静息T细胞。由于许多肿瘤患者缺乏功能性DC，不能刺激抗原特异性T细胞反应，因此在体外诱导功能性DC对于主动免疫治疗具有重要意义。目前，大多数实验 都是利用细胞因子或转录因子激活，或热休克蛋白和肿瘤细胞负载DC制备DC疫苗，然后将这些致敏DC疫苗回流体内，诱导机体产生有效的肿瘤免疫排斥反应。MAGE-1在肝癌中的表达率高达80%，提示MAGE-1可作为肝癌免疫治疗的靶点。吴鸣宇等MAGE-1肽负载DC体外诱导高特异性抗癌免疫应答。肿瘤睾丸抗原（Tumor testis antigen，CT）是20世纪90年代发现的一种肿瘤特异性抗原，除 睾丸外，在正常组织中不表达，但在多种肿瘤组织中高表达。肿瘤睾丸抗原NY-ESO-1是CT抗原中免疫原性最强的抗原。结果表明，NY-ESO-1在肝癌组织中的表达率较高（30%-40%）。张文敏等。用原核表达纯化的NY-ESO-1蛋白肽攻击DC，体外诱导特异性CTL对肝癌细胞的杀伤作用。结果表明，融合蛋白肽刺激DC可 有效刺激T细胞增殖，诱导CTL的产生。 1.2 甲胎蛋白(AFP)多肽疫苗 AFP不仅是肝癌诊断的标志物之一，而且是肝癌免疫治疗的潜在靶点。甲胎 蛋白多肽疫苗是一种刺激肝癌特异性免疫反应的疫苗。巴特菲尔德等人。报道10 例Ⅲ-Ⅳ期肝癌患者用甲胎蛋白肽休克DC疫苗治疗。6例AFP特异性T细胞增多，6例AFP特异性T细胞合成IFN-γ的比例增加。提示AFP靶向疫苗具有免疫活性。 1.3 肝癌肿瘤疫苗 肝癌疫苗是通过物理、化学和生物因素的处理，改变或消除自身或同种肝癌 细胞的致瘤性，保持免疫原性，输入体内，刺激机体产生特异性免疫应答。Yang 等人。结果表明，H22全细胞疫苗可诱导肝癌小鼠产生特异性免疫应答，明显延 长小鼠的存活时间。 2 过继免疫治疗 ATT是一种将具有抗瘤活性的免疫细胞诸如:LAK、TIL、CTL细胞、细 胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞),转移给肿瘤患者的被动免疫治疗方法.
免疫抑制剂的研究进展
免疫抑制剂的研究进展 【摘要】综述了免疫抑制剂的分类及其在药学和临床方面的研究进展。 【关键词】免疫抑制剂;研究进展 免疫抑制剂是近20余年来在肿瘤化疗、器官移植、免疫病理学和临床免疫学等多学科研究基础上发展起来的新的药剂类别,在治疗剂量下可产生明显免疫抑制效应的一类药物。这类药物可作用于免疫反应过程的不同环节,抑制免疫细胞的发育分化,抑制抗原的加工、提呈,抑制淋巴细胞对抗原的识别,抑制活化T细胞或B细胞增殖和抑制淋巴细胞效应等。本文拟就免疫抑制剂的分类及其在药学和临床方面的研究进展作一综述。 1 常用免疫抑制剂分类 1.1 合成药物:该类化合物多来源于抗肿瘤物,此类药物对免疫的多个环节均有抑制作用,但其不良反应严重,为减少不良反应,临床上多与其他免疫抑制剂合用,如目前临床上多在三联疗法中应用A Z P ( A Z P + C S A +泼尼松) 。 1.1.1 糖皮质激素: 此类药物有泼尼松、氢化泼尼松和地塞米松等,对免疫反应的多个环节均有抑制作用,包括防止和抑制中介的免疫反应,减少淋巴细胞、单核细胞的数目,降低免疫球蛋白与细胞表面受体结合的能力,并抑制白介素的合成与释放,从而阻止淋巴细胞向淋巴母细胞转化。此类药物的免疫抑制作用与其用药剂量密切相关。常规剂量下,其免疫学作用主要表现在减少淋巴细胞产生细胞因子,影响细胞的激活。但在大剂量使用进行冲击治疗时,还可通过直接作用造成淋巴细胞溶解和凋亡,以达到快速有效的抑制免疫反应的目的。[1] 长期应用糖皮质激素可产生严重不良反应,诱发和加重感染,或导致肾上腺皮质功能紊乱等,但由于其疗效明显。若使用得当,仍不失为治疗自身免疫病的首选药物。常用于系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、肾病综合症、慢性活动性肝炎、溃疡性结肠炎等的治疗。 1.1.2 烷化剂: 环磷酰胺最早应用于临床, 它通过杀伤免疫细胞,影响免疫过程中的各阶段,作为一种免疫抑制剂用于肾病综合征、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等。较明显的副作用使其应用受到了限制。对免疫反应的影响因不同剂量及投药时问而
免疫分析技术研究进展
免疫分析技术研究进展 摘要：目的：综述免疫分析技术的最新研究进展。方法：通过查阅国内外有关免疫分析技术的研究论文，对放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CLIA)等免疫分析技术进行了综述，同时指出了发展前景和尚待解决的问题。结果：多种免疫分析方法相互结合，可大大提高分析方法的灵敏度，增大检测范围；CLIA和TRFIA是非放射免疫分析的两大主流，其中，CLIA更具有竞争力。结论：目前还没有一种免疫分析技术是完美无缺的，各种技术还需要不断发展和完善，以开发出更新、更理想的免疫分析技术。 关键词：药物分析学；免疫分析；放射免疫分析；酶免疫分析；荧光免疫分析；化学发光免疫分析 免疫分析法(immunoassay ，IA)是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。由于免疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。各种标记技术(放射性标记、荧光标记、化学发光、酶标记等)的发展，使免疫分析的选择性更加突出。免疫分析法起始于本世纪50年代，首先应用于体液大分子物质的分析，1960年，美国学者Yalow和Berson等将放射性同位素示踪技术和免疫反应结合起来测定糖尿病人血浆中的胰岛素浓度，开创了放射免疫分析方法的先河。1968年，Oliver将地高辛同牛血清白蛋白结合，使之成为人工抗原，免疫动物后成功获得了抗地高辛抗体，从而开辟了用免疫分析法测定小分子药物的新领域。在RIA的基础上，随着新的标记物质的发现及新的标记方法的使用，以及电子计算机、自动控制技术的广泛应用，派生出许多新的检测技术[1]，使免疫分析法逐渐发展成为一门新型的独立学科。 1 免疫分析方法分类 (1)根据标记物的不同，可以免疫分析主要分为放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)、酶免疫分析(enzyme immuoassay，EIA)、化学发光免疫分析(chemiluminescent immunoassay，CLIA)、荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay，FIA)等。 (2)按反应机制的不同，可以分为竞争法和非竞争法。非竞争法是将待测抗原与足够的标记抗体充分反应形成抗原-标记抗体复合物，产生的信号强度与抗原的量成正比。竞争法是将过量的待测抗原与定量标记抗原竞争结合形成定量的特异性抗体，待测抗原的量越大，与抗体结合的标记抗原量越少，产生的信号强度越小，由此定量待测抗原的量。 (3)还可以按测定过程中的某些步骤的差异分为均相免疫分析和非均相免疫分析两大类。均相酶免疫测定法的特点是抗原-抗体反应达到平衡，对结合与游
CAR T细胞在肿瘤免疫治疗的研究进展和展望文献综述
中国药科大学 生物工程文献综述 综述题目CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗的研究进展和展望英文题目Current situation and development trend of CAR- T cell for tumor immunotheraphy 专业生物制药（卓越工程师） 院部生命科学与技术学院 学号 姓名龙益如
CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗的研究进展和展望 龙益如 摘要：嵌合抗原受体修饰的Ｔ细胞（CAR-T）治疗是一种新型的肿瘤免疫治疗方法。在多种血液肿瘤的临床试验中，CAR-T细胞疗法取得重大突破，在实体瘤的临床试验中也初见成效。但在获得显着疗效的同时, CAR-T也存在持久性、归巢、脱靶效应、神经毒性、细胞因子风暴、插入突变、对实体肿瘤疗效有限等问题。现就CAR-T技术的最新进展及该领域有待解决的问题进行综述，以期初步了解该技术的发展前景及问题分析。 关键词：嵌合抗原受体修饰的T细胞；肿瘤；免疫治疗 Current situation and development trend of CAR-T cell for tumor immunotheraphy Abstract：A lot of remarkable results suggested that the modification of T-cells with CARs could be a powerful approach for developing safe and effective cancer therapeutics .A novel breakthrough has been made in CAR-T treatment of hematologic tumors and therapeutic potential in clinical studies of solid tumors has been achieved , although there are still many problem for CAR-T on the clinical application such as off-target effect, cytokine storm ,insertion mutagenesis, limited effects for solid tumors. Here, we reviewed the recent advances of CAR-T and problems that need to be solved in this flied. Keyword: Chimeric antigen receptor T cells ; Tumor ;Immunotheraphy
免疫抑制剂的研究进展
高铁血红蛋白浓度，一般推荐一氧化氮吸入浓度为20?10－6 80?10－6mmol/L。试验报道［20］患儿吸入一氧化氮浓度40?10－6 80?10－6mmol/L30min和吸入一氧化氮6?10－6 20?10－6mmol/L1 53d，均未发现有临床意义的高铁血红蛋白血症。 一氧化氮本身是一种自由基，大剂量吸入对肺有一定损伤。吸入高浓度一氧化氮则可产生不良反应。这主要因为一氧化氮可与氧结合形成二氧化氮，后者有很强的毒性作用。 一氧化氮吸入治疗，具有快速的早期反应性、高选择性和非创伤性、不良反应相对较少等优点，已被广泛应用于原发性和继发性肺动脉高压症、肺血管痉挛性低氧血症、BPD等治疗。但现在面临一系列问题，如一氧化氮的来源及毒性效应。一氧化氮的许多物理、化学及生物学特性还有待进一步观察，其生物合成、释放、转运、作用、灭活及清除机制还有许多问题需要深入探讨。雾化吸入一氧化氮供体（如硝普钠和硝酸甘油）是一种很成功的尝试。一氧化氮研究得出的许多结论还仅是初步的，因为各自的研究方法、条件、标准的不同，有的结论出入较大，甚至相互矛盾。 参考文献 ［1］唐英，王泉云．一氧化氮（NO）吸入治疗的临床研究新进展［J］．中国麻醉与镇痛，2001，2（3）：151-156． ［2］Lowson SM．Inhaled alternatives to notric oxide［J］．Anesthesiolo-gy，2002，96（6）：1504-1513． ［3］洪小杨，王斌，付雪梅，等．一氧化氮吸入治疗新生儿持续肺动脉高压［J］．中国小儿急救医学杂志，2006，3（13）：266-267．［4］吴湘兰，王章星，王萍，等．雾化吸入硝酸甘油治疗新生儿持续肺动脉高压［J］．广东医学，2010，12（3）：1602-1603． ［5］Gong FQ，Shiraishi H，Mariko Y．The effect of inhaled ion nebuliz-ed nitroglycerin in dogs with experimental pulmonary hypertension induced by U46619［J］．Chinese Med J，2000，113（7）：475-476．［6］Jiang BH，Maruyama J，Yokochi A，et al．Correlation of inhaled ni-tric-oxide induced reduction of pulmonary artery pressure and vas- cular changes［J］．Eur Respir J，2002，20（1）：52-81． ［7］王少华，黄斌，万永明，等．雾化吸入NO供体对新生猪急性呼吸衰竭综合征炎症反应的干预作用［J］．中国小儿急救医学杂 志，2011，18（1）：53-55． ［8］曾建军，陈冬梅，王瑞泉，等．吸入一氧化氮与高频振荡通气治疗新生儿呼吸衰竭合并肺动脉高压的疗效观察［J］．中国小儿 急救医学，2010，6（17）：537-539． ［9］夏红萍，黄国英，孙波，等．雾化吸入一氧化氮供体治疗新生猪急性低氧性肺动脉高压［J］．中华急诊医学杂志，2006，15（2）： 117-120． ［10］诸冰雪，贾兵，陈张根，等．吸入一氧化氮治疗先天性心脏病术后肺动脉高压［J］．临床儿科杂志，2005，3（23）：146-151．［11］Omar HA，Gong F，Sun MY．Nebulized nitroglycerin in children with pulmonary hypertension in congenital heart disease［J］．West View Med J，1999，95（2）：74-75． ［12］张宁，徐永健，张珍祥，等．核因子кB对支气管哮喘大鼠淋巴细胞增殖和凋亡的调节作用及雷公藤甲素对其影响［J］．中国 中西医结合杂志，2004，13（3）：435-438． ［13］张骏，夏毓华．先天性膈疝动物模型制作及其肺部一氧化氮的改变［J］．临床儿科杂志，2001，19（4）：243-245． ［14］沈毅弘，高惠荣．一氧化氮的临床应用进展［J］．浙江医学情报，1996，18（1）：14-16． ［15］李鲁明．一氧化氮及合成酶在缺氧缺血性脑病中的探讨［J］．医药论坛杂志，2003，24（15）：22-23． ［16］刘翠青，马莉．一氧化氮吸入治疗新生儿胎粪吸入综合征的随机对照研究［J］．中华儿科杂志，2008，46（4）：243-245． ［17］夏耀方，刘翠青．一氧化氮吸入治疗对胎粪吸入综合征患儿氧合功能及气道炎症反应的影响［J］．中国小儿急救医学，2008， 15（3）：234-237． ［18］Schreiber MD，Gin-Mestan K，Marks JD，et al．Inhaled nitric oxide in premature infants with the respiratory distress syndrome［J］．J N Engl J Med，2003，349（22）：2099-2107． ［19］Barrington KJ，Finer NN．Ihaled nitric oxide for resp iratory failure in p reterm infants［J］．Cochrane Database Syst Rev，2007，18 （3）：CD000509． ［20］Geggel RL．Inhalation nitric oxide：A selective pulmonary hyperten-sion of the newborn［J］．J Pediatr，1993，123（1）：103-108． 收稿日期：2011-12-26修回日期：2012-03-14编辑：楼立理 免疫抑制剂的研究进展 徐凯，朱其明※（综述），冯建鹏（审校） （扬子江药业集团江苏海慈生物药业有限公司，江苏泰州225321） 中图分类号：R979．5文献标识码：A文章编号：1006-2084（2012）14-2177-04 摘要：近年来，随着免疫学的不断发展，新型免疫抑制剂的不断问世推动了器官移植的蓬勃发展，一些高效低毒的新型免疫抑制剂得到了开发和应用。研究开发作用于新靶点的新型免疫抑制剂仍是今后努力的方向。为了全面地了解免疫抑制剂的研究进展，现对细胞因子抑制剂、DNA合成抑制剂、单克隆抗体类免疫抑制剂等的作用机制及临床应用进行综述。 关键词：免疫抑制剂；器官移植；作用机制；临床应用 Research Progress of the Immunosuppressive Drugs XU Kai，ZHU Qi-ming，FENG Jian-peng．（Yangtze River Pharmaceutical Group Jiangsu Haici Biological Pharmaceutical Co．，Ltd，Taizhou225321，China）Abstract：With the development of immunology in recent years，many new immunosuppressive drugs have been discovered，which has promoted the prosperity of organ transplant，and some new efficient immuno-suppressive drugs with low toxicity have been developed and applied．The goal of research of new immunosup-pressive drugs still focuses on researching for new targets．Here is to make a review of the action mechanisms and clinical applications of some immunosuppressive drugs，such as cytokine inhibitors，DNA synthesis inhib-itors and monoclonal antibody，etc．to get a good understanding of the research progress of the immunosup-pressive drugs． Key words：Immunosuppressive drugs；Organ transplantation；Action mechanism；Clinical application 免疫抑制剂是一类可抑制机体异常免疫反应的药物，其在临床上主要用于防止器官移植时的排斥反应及自身免疫性疾病的治疗。免疫抑制剂自20世纪70年代后发展起来的，到目前为止取得了很大进展。免疫抑制剂可通过影响机体免疫应答反应和免疫病理反应而抑制机体的免疫功能。不同的免
化学发光免疫分析技术及其应用研究进展 蒋恩彬
化学发光免疫分析技术及其应用研究进展蒋恩彬 发表时间：2014-12-25T08:59:42.297Z 来源：《防护工程》2014年第9期供稿作者：蒋恩彬 [导读] 由于化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、适用范围广泛等特点，所以受到了人们的认可。 蒋恩彬 重庆热展建筑工程咨询服务中心重庆 400012 [摘要]本文主要对化学发光免疫分析技术及其应用研究进展进行了分析，首先对化学发光免疫分析技术的相关概念进行了分析；然后从临床检验和兽医学应用化学发光免疫分析技术进行了分析；最后对化学发光免疫分析技术进行了新进展研究，希望对有关人士有所帮助。 [关键词]化学发光免疫分析、临床检验、兽医学 一、前言 由于化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、适用范围广泛等特点，所以受到了人们的认可，在医学、药品等众多领域得到广泛的应用。同时化学发光免疫分析主要利用了化学发光测定技术和免疫反应，化学发光测定技术传统的免疫分析，需要的培育时间比较长。 二、化学发光免疫技术的工作原理 1、检测器的检测原理 化学反应的检测过程中，一些化学基团在处于被氧化状态之后，会形成一个激发态，在回归至基态的过程中，会发射出光子，实质上就是免疫反应与化学反应有机结合在一起之后形成的一种分析方法，即微量倍增技术。微量倍增技术在临床检验中的应用，主要是通过粒径比较小的颗粒磁粉增大复合物表面的面积，提升复合物的吸附量，加强表面能，以此加快反应速度。 2、基本原理 化学发光免疫技术，反应过程主要包括两类，即化学发光反应与免疫反应。化学发光免疫技术的工作原理，主要是在抗体或者抗原上对化学发光物质或者其它一系列处于发光状态的酶标记物进行标记，使其产生免疫反应，使抗体与抗原能够特异性结合，产生一种复合物，然后在该复合物中加入发光底物或者氧化剂，使复合物可以发光。根据待测物质具备的浓度与仪器监测中获取的发光强度之间存在的线性关系，实现浓度的合理测定。 三、化学发光免疫分析的分类 化学发光免疫分析根据应用于免疫分析体系中的方式不同，可以分为以下三类： 1、直接标记发光物质的免疫分析这种分析方式是用吖啶酯直接标记抗体，作为抗原，然后与待测标本中相应抗体发生免疫反应，就会形成固相包被抗体一待测抗原一吖啶酯标记抗体复合物，到这一步后再加入双氧水氧化剂，这样环境就会呈碱性，吖啶酯就会在不需要催化剂的情况下分解、发光。 2、酶催化化学发光免疫分析标本中的抗原在发生免疫反应时所用的标记物为发光的酶，这种化学发光免疫分析方法是酶催化化学发光免疫分析。 3、电化学发光免疫分析，这种分析过程包括电化学和化学发光两个过程，具体是以三丙胺（TPA）为电子供体，用电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体（抗原），在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应。 四、化学发光免疫分析技术的应用 1、化学发光免疫分析在临床检验中的应用 就目前而言，化学发光免疫分析技术已经成为替代RIA的首选技术，且已经被广泛地应用于基础和临床医学的各个领域。下面就简要地谈谈化学发光免疫分析技术在临床检验中的几个应用。 （1）应用于传染性疾病的病原诊断作为评价和治疗机体免疫功能重要指标的重要血清学标志物乙型肝炎病毒表面抗原、抗体，以前诊断是否感染乙肝病毒用的是常规酶法，常规酶法的缺陷是可能使得部分低病毒含量携带者漏检。但是化学发光免疫分析具有高灵敏度和线性范围宽的特点，在传染性疾病的病原诊断方面其检测灵敏度比常规酶法高，Bowser等在测定感染人类免疫缺陷病毒的围产期儿童体内的单纯疱疹病毒、乙型肝炎病毒甲型肝炎病毒、及丙型肝炎病毒时给出了证明。 （2）应用于肿瘤标志物的分析肿瘤标志物包括蛋白质、酶、癌基因产物、激素等，它是由肿瘤细胞合成释放或机体对肿瘤细胞反应而产生的一类物质。在患者的细胞中，血液中以及组织中都存在肿瘤标志物。化学发光免疫分析可以用于寻找新的肿瘤标志物，也可以进行体外早期辅助诊断和对术后的监测，对恶性肿瘤患者的具有重要意义。Mac等达到了对食管癌患者的诊断和病情监测，他们采用的方法就是检测血清中癌胚抗原的浓度、cyfra21-1的浓度、鳞状细胞癌抗原的浓度。 （3）应用于心脏疾病的特征标记物测定临床上的心脏疾病常常采用同工酶定量测定，标记物为肌酸激酶和肌钙蛋白T＼肌红蛋白。Dutra等运用心肌肌钙蛋白受体分子制成了免疫传感器，可用于临床上早期检测心肌梗死。有关资料显示，同时检测了肌酸激酶同工酶和肌红蛋白，相关系数分别为cTnT0.953-0.982；CK—MB0.835-0.999；肌红蛋白0.776-0.992，具有很好的相关性可用于检测临床标本。 2、化学发光免疫分析技术在兽医学中的应用 化学发光免疫分析技术在兽医学中的应用还处于早期阶段，因此没有得到较多的应用。主要原因则是化学发光免疫分析技术在兽医学的应用中会跨越化学、兽医以及生物学科方面的知识，而这样加大了化学发光免疫分析技术的应用难度，因此没有在兽医学中得到较多的应用。但是化学发光免疫分析技术仍然是兽医学中一项疾病快速检测的方法，即通过化学发光免疫分析技术可以精准快速的判定动物所发生疾病的原因，而且通过这项技术的运用还可以监测动物体内的疾病发生概率。化学发光免疫分析技术在我国没有较多的应用到兽医学中，而且技术也没有国外先进，这进一步制约了化学发光免疫分析技术在我国的应用。国外化学发光免疫分析技术在兽医学中的应用较多，比如国外利用化学发光免疫分析技术来进行动物肠道病毒检测试验、猪肉中沙门菌抗体检测以及评价胰岛素浓度对奶牛繁殖性能的影响，并且取得了较好的成果。 五、化学发光免疫分析技术的新研究进展 化学发光免疫分析技术运用的重点就是检测内部微观化学反应的情况，而为了达到更好的检测效果就需要发光物质发光时间更加持久发光更加明亮，而这可以通过标记新的标记物来得以实现。各国科学家都致力于研究标记物的发光时间以及发光强度，标记物发光需要特定酶的催化，这需要科学家通过长时间的实践才能够证明哪一种标记物在哪一种酶的催化下才能够达到长时间的发光以及高强度的发光，
CAR_T细胞免疫疗法研究进展
CAR-T细胞免疫疗法的研 究进展 浙江理工大学 任嘉锋自动化（2）班 学号：2013330301070 指导老师：解纯刚
CAR-T细胞免疫疗法的研究进展 任嘉锋2013330301070 浙江理工大学机械与自动控制学院自动化2班,杭州 摘要:嵌合抗原受体修饰T细胞（CAR-T细胞）技术是近年来发展非常迅速的一种过继性免疫治疗技术。这里的CAR指的就是嵌合抗原受体,由胞外抗原结合域scFv、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成。其通过基因修改技术，将能识别肿瘤相关抗原的抗体融合表达于自体T细胞的表面，被修改过的T细胞因此具有对肿瘤细胞的靶向杀伤力。从该技术被发明以来，CAR的设计已从仅包含单一CD3ζ信号传递结构域的第一代CAR 发展为加入了CD28 和CD137（4-1BB）等共刺激分子信号传递结构域的第二和第三代CAR。其中，针对CD19 的CAR-T 细胞在治疗血液肿瘤中取得的成果尤为引人瞩目，同时CAR-T 细胞在针对实体瘤的治疗方面也取得了一定的成绩,但该技术同时也存在脱靶效应和细胞因子释放综合征等临床应用风险。这里就CAR-T细胞免疫疗法的原理和在肿瘤的临床治疗领域的研究进展作综述性的阐述. 关键词:CAR-T细胞;免疫疗法;基因技术;肿瘤治疗 1.CAR-T细胞疗法的原理 采用嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors，CARs)修饰的T细胞CAR-T 细胞治疗肿瘤的方法是近年来发展最快的一种肿瘤免疫新疗法。T细胞对肿瘤细胞具有很强的杀伤作用,在肿瘤免疫应答中起主要作用.但是肿瘤细胞表面的MHC(主要组织相容性复合物)在免疫编辑的过程中会出现表达下降的情况,这样长期形成的免疫逃逸机制, 能使肿瘤细胞成功躲避T细胞攻击, 肿瘤快速增殖。此外, 人体内肿瘤特异性的T细胞数量较少, 并且由于大多数肿瘤细胞不断表达自体抗原, 使得靶向这些抗原的T细胞通过免疫耐受机制被中和或移除, 数量进一步减少。 而CAR的修饰可使T细胞在获得靶向杀伤能力的同时获得更强的增殖及抗凋亡的能力，其肿瘤杀伤作用的发挥也不会受到主要组织相容性复合体(MHC)的