滚环扩增原理

PCR扩增原理及操作

PCR扩增反应的操作 第一节PCR扩增反应的基本原理 一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成 PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。 PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。 1．模板DNA的变性 模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR 中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。 2．模板DNA与引物的退火 将反应混合物温度降低至37~65℃时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为1～2min。 3．引物的延伸 DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72℃条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为40～60个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需2～4min，一次PCR经过30～40次循环，约2～3h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y ＝（1＋X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，

pcr扩增的原理和步骤

PCR 扩增的原理和步骤 聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是20世纪80年代中期发 展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究，直到1996 年由美国Applied Biosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR(F lurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitati ve PCR,RT-qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记 跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计 算待测样品模板的初始浓度，实现了PCR 从定性到定量质的跨越，具有里程碑 意义。目前，此项技术已应用于干细胞研究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检 测和传染病研究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生物科技等多领 域研究中。本文对实时荧光定量PCR 的原理、分类和应用进行阐述。 一、实时荧光定量PCR技术的原理 real-time quantitative PCR 技术是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团，通过 荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进 行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。(1)荧光域值(t hreshold)的设定： PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15 个循环的荧光信号标准偏差的10 倍。(2)Ct 值：C 代表Cycle，t 代表 threshold，Ct 值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值 时所经历的循环数。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。一般来说，整条曲线可以分3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化。在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以反应终产物量与起始模板量之间已 经不存在线性关系，通过反应终产物也算不出起始DNA 拷贝数。只有在荧光产

RCA—根本原因分析

RCA——根本原因分析 第一步骤：进行RCA前的准备——人员、资料 （1）组织工作小组(Organize a team）：根据事件的严重程度确定小组人数 主要是相关流程的一线工作人员 确定主要负责人：应具有与事件相关专业知识并能主导团队运作 （2）事件相关资料的收集资料，作为后续分析的佐证。 相关资料最好能尽快收集，以免遗忘重要的细节。 资料收集包括访谈人员、设备调查、书面记录、发生地点和方法流程等 （3）详细叙述事情的发生经过（包括人物、时间、地点、如何发生），并确认事件发生的先后顺序。 （可以利用“叙事时间表”等工具来确认事件发生的先后顺序，将焦点放在事件的事实上，而不是一下子就跳到结论。） 第二步骤：确认相关原因——列出所有原因 （1）列出与事件相关的系统分类： 人力资源系统 资料管理系统 环境设备管理系统 组织领导及沟通系统 其他 （2）列出事件的流程：对照执行过程是否符合规范、常规。

需评估：当时执行的步骤跟流程的一样吗？ 当时执行的步骤跟平常做的一样吗？ 确认操作程序是否有问题 第三步骤：确定近端原因、根本原因 （1）从系统中筛选出根本原因 筛选标准： 可问以下问题，辨别是根本原因还是近端原因： 当此原因不存在时，此问题还会发生吗？ 若此原因被矫正或排除，假如再有相同诱发因素，还会再有类似问题发生吗？ 答「是」者为近端原因，答「否」者为根本原因。 （2）列出事件的近端原因及远端原因 （3）针对近端原因做即时的介入措施，即使分析过程未完成，若已先找出近端原因，便可针对近端原因马上做一些处理，以减少事件造成的影响。 第四步骤：制定及执行改善计划 制定具体的、可操作性的改善计划并落实改善措施，防止下一次事件再发生

PCR扩增的原理和步骤

PCR扩增的原理和步骤 聚合酶链反应(polymerasechain reaction PCR)技术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方法进行了许多探索研究，直到1996年由美国Applied Biosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧光定量PCR(F lurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR；real-time quantitati ve PCR,RT-qPCR or qPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度，实现了PCR从定性到定量质的跨越，具有里程碑意义。目前，此项技术已应用于干细胞研究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检测和传染病研究、药物分析、药物基因组学、植物学研究和农业生物科技等多领域研究中。本文对实时荧光定量PCR的原理、分类和应用进行阐述。 一、实时荧光定量PCR技术的原理 real-time quantitative PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在荧光定量PCR技术中有2个概念比较重要。(1)荧光域值(t hreshold)的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10倍。(2)Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。一般来说，整条曲线可以分3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化。在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以反应终产物量与起始模板量之间已经不存在线性关系，通过反应终产物也算不出起始DNA拷贝数。只有在荧光产生进入指数期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，所以在P CR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，由此来推断模板最初的含

PCR各步骤的目的

P C R各步骤的目的 Prepared on 22 November 2020

PCR各步骤的目的 （一）预变性： 破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。 （二）变性--退火--延伸循环： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。 （三）用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因： 1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taq DNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。 2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。 3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。

PCR扩增实验操作步骤

PCR扩增反应 一、实验原理 PCR：是一种选择性扩增DNA或RNA的方法，其基本原理是依据体内细胞分裂中的DNA半保留复制机理，以及在体外dNTP分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。 PCR反应分3步：①变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4 种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106~7拷贝。 变性 退火 延伸 图反应历程

二、实验材料 1·模板：细菌DNA 2·TsgDNA聚合酶3·dNTP混合液 4·10倍浓度PCR缓冲液5·2.5mmol/LMgCl2 6·RAPD引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97 S103 S110 S115 7·提取细菌DNA的相关试剂 三、操作步骤 1．细菌染色体DNA的提取（见上一组） 3·反应程序： 将RAPD反应试剂加入EP管中 轻混后用100ul石蜡油覆盖于反应混合液之上，防止样品在反复加热-冷却的过程中蒸发，盖好盖子 打开PCR反应仪输入以下反应数据 ●94 摄氏度预变性5min ●94摄氏度变性40s ●40摄氏度退火40s ●72摄氏度延伸1min 将EP管放入仪器开始扩增，循环35次；72摄氏度延伸10min 仪器为Model MyGene 25 Plus 三、注意事项 1、PCR反应体系中DNA样品及各种试剂的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性 及全部放入反应体系中。 2、为避免污染凡是用在PCR反应中的Tip尖、离心管、蒸馏水都要灭菌；吸每种试剂 时都要换新的灭菌Tip尖。 3、加试剂时先加消毒三蒸水，最后加DNA模板和Taq DNA聚合酶。 4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。 5.引物条件首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定二聚 体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

pcr扩增的原理和步骤

pcr扩增的原理和步骤 一、基本原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。 在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA 聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 二、PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA 聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 扩展： 在实践中，聚合酶链式反应（PCR）可以因各种原因而失败，部分原因是由于其对于污染的敏感性，导致扩增错误的DNA产物。正因为如此，人们已经开发了一些技术和步骤来优化聚合酶链式反应条件。将聚合酶链式反应前的混合物与潜在DNA污染物分开的实验室方案和流程解决了外源DNA的污染问题。 这通常包括从用于分析的区域分理出聚合酶链式反应的设定区域或者说聚合酶链式反应产物的纯化，一次性塑料制品的使用，及对反应装置之间的工作台面彻底清洁。引物的设计技术在改善聚合酶链式反应产物产率和避免杂产物的形成是很重要的。

PCR的基本步骤及注意

（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似修复复制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂复制（类似PCR 前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年化学奖。 PCR原理 DNA的是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计，DNA 聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。 发现耐热DNA聚合酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩扩增放大几百万倍。 [PCR反应体系与反应条件] 1.标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液10μl 4种dNTP混合物200μl 引物10～100μl 模板DNA ～2μg

RTPCR原理和实验步骤

RT—PCR原理与实验步骤 一、知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d,可以合成105个丝心蛋白) 共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR技术(Polymerase chain reaction）：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A。变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合. C。延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5’3’方向延伸。以上三步为一个循环,如此反复。 3、逆转录酶和RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶,至少具有以下三种活性： 1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链; 2、Rnase水解活性：水解RNA：DNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性:以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。 二、RT—PCR的准备: 1。引物的设计及其原则： 1）引物的特异性决定PCR反应特异性.因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型,不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物,或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 2) 引物设计原则的把握 引物设计原则包括： a、引物长度：一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度,也影响反应的特异性。 b、碱基分布:四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）:40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度.

pcr扩增的原理和步骤

PCR扩增反应的操作 第一节PCR扩増反应的基本原理 一、聚合魄式反应(PCR)的基本构成 PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组DNA)的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等. PCR基本原理：是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3,末墙有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微鼠的模板DNA得到极大程度的扩增.在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端己知序列分别互补的两个引物、适量的緩冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合醇、Mg2件.反应时先将上述溶液加热, 使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态：然后降低溶液温度,使合成引物在低温下与其祀序列配对，形成部分双链，称为堰火；再将温度升至合适温度.在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重夏改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩増.因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、痢稳定DNA 聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成(见图)。 1.模板DNA的变性 模板DNA加热到90^5-C时,双螺旋结构的级键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合.为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，GC间由三个氢键连接，而A-T间只有两个狙键相连.所以Gt含量较高的模板，其解链温度相对要高些. 故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G_C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚破(DMSO),并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用 97-C,时间适当延长，即所谓的热启动. 2.模板DNA与引物的退火 将反应混合物温度降低至37-65C时，寡核昔酸引物与单链模板杂交，形成DNA棋板?引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核昔酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于棋板DNA的浓度，井由于引物的长度显著短于棋板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为I ?2min。 3.引物的延伸 DNA模板-引物复合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板. 按基困对与半保留复制原理,合成一条与模板DNA鮭互补的新链。重复循环变性-退火?延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制鮭”，而且这种新鮭又可成为下次循环的模板.延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72*C条件下,Taq DNA聚合醪催化的合成速度大约为40?60个碱基,秒.经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中, 新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就増加一倍.每完成一个循环需2?4min, 一次PCR经过30?40次循环，约2?3丄扩増初期，扩増的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时.酶的催化反应趋于抱和，便出现所谓的“平台效应”.即爬DNA 产物的浓度不再増加. PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩増暈呈指数上升.反应最终的DNA扩増量可用Y= (1+X) ■*计算.Y代表DNA片段扩増后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩増效率，n 代表循环次数。平均扩増效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的増加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩増的DNA片段不

普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的基本原理和操作步骤

普通PCR、原位PCR、反向PCR和反转录PCR的 基本原理和操作步骤 普通PCR 1概述 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR 则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式发表了第一篇相关的论文。此后，PCR的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。 2 PCR原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 3 PCR反应体系与反应条件 3.1标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液10μl 4种dNTP混合物200μl 引物10～100μl 模板DNA 0.1～2μg

《 根本原因分析法RCA》

根本原因分析法RCA1对1培训及咨询、百度文库官方认证机构、提供不仅仅是一门课程，而是分析问题，解决问题的方法！管理思维提升之旅！ （备注：具体案例，会根据客户行业和要求做调整） 知识改变命运、为明天事业腾飞蓄能上海蓝草企业管理咨询有限公司 蓝草咨询的目标：为用户提升工作业绩优异而努力，为用户明天事业腾飞以蓄能！蓝草咨询的老师：都有多年实战经验，拒绝传统的说教，以案例分析，讲故事为核心，化繁为简，互动体验场景，把学员当成真诚的朋友！ 蓝草咨询的课程：以满足初级、中级、中高级的学员的个性化培训为出发点，通过学习达成不仅当前岗位知识与技能，同时为晋升岗位所需知识与技能做准备。课程设计不仅注意突出落地性、实战性、技能型，而且特别关注新技术、新渠道、新知识、创新型在实践中运用。 蓝草咨询的愿景：卓越的培训是获得知识的绝佳路径，同时是学员快乐的旅程，为快乐而培训为培训更快乐！目前开班的城市：北京、上海、深圳、苏州、香格里拉、荔波，行万里路，破万卷书！ 蓝草咨询的增值服务：可以提供开具培训费的增值税专用发票。让用户合理利用国家鼓励培训各种优惠的政策。报名学习蓝草咨询的培训等学员可以申请免费成为“蓝草club”会员，会员可以免费参加（某些活动只收取成本费用）蓝草club 定期不定期举办活动，如联谊会、读书会、品鉴会等。报名学习蓝草咨询培训的学员可以自愿参加蓝草企业“蓝草朋友圈”，分享来自全国各地、多行业多领域的多方面资源，感受朋友们的成功快乐。培训成绩合格的学员获颁培训结业证书，某些课程可以获得国内知名大学颁发的证书和国际培训证书（学员仅仅承担成本

费用）。成为“蓝草club”会员的学员，报名参加另外蓝草举办的培训课程的，可以享受该培训课程多种优惠。 一．市场营销岗位及营销新知识系列课程 《狼性销售团队建立与激励》 《卓越房地产营销实战》 《卓越客户服务及实战》 《海外市场客服及实务》 《互联网时代下的品牌引爆》 《迎销－大数据时代营销思维与实战》 《电子商务与网络营销-企业电商实战全攻略》 《电子商务品牌成功之路－塑造高情商（EQ）品牌》 《精准营销实战训练营》 《卓越营销实战－企业成功源于成功的营销策划》 《关系营销-卓越营销实战之打造双赢客户》 《赢销大客户的策略与技巧》 《如何做好金牌店长—提升业绩十项技能实训》 二．财务岗位及财务技能知识系列 《财务报表阅读与分析》 《财务分析实务与风险管理》 《非财务人员财务管理实务课程》 《有效应收账款与信用管理控制》 《总经理的财务课程》

PCR原理及过程

PCR技术原理、实验步骤和应用 来源：易生物实验浏览次数：3623 网友评论0 条 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。 关键词：PCR技术PCR聚合酶链反应 一、实验目的 1.掌握聚合酶链式反应的原理。 2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。 二、实验原理 PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA 重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。 PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。参与复制的有多种因素。PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

pcr扩增的原理和步骤

pcr扩增的原理和步骤 聚合酶链反应( CR)是分子生物学中的一种科学技术，将一段DNA的一个或几个拷贝跨越几个数量级，产生数千到数百万个特定DNA序列的拷贝。目前，PCR是一种常见的、经常不可缺少的技术，用于医学和生物研究实验室的各种应用。PCR技术涉及三个主要步骤：变性、退火和扩展。PCR技术有助于对越来越多的疾病进行调查和诊断。定性PCR不仅可以检测人类基因，还可以检测细菌和病毒的基因。PCR也被用于法医实验室，并且特别有用，因为只需要少量的原始DNA。PCR可以识别与癌症发展有关的基因。分子克隆得益于PCR作为一种技术的出现。 基本概念 PCR基本原理简单。顾名思义，它是一个链式反应：一个DNA分子被用来产生两个拷贝，然后是四个，然后是八个等等。这种连续的加倍是由特定的蛋白质完成的，称为聚合酶，这种酶能够将单个DNA构建块串在一起形成长分子链。要完成他们的工作聚合酶需要提供DNA构建块，即由腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)组成的核苷酸。他们还需要一个小的DNA片段，称为引物，他们将构建块以及一个较长的DNA分子连接起来，作为构建新链的模板。如果提供这三种成分，酶将构建模板的精确副本。PCR是一种用于获取任何特定核酸链的许多拷贝的方法。这是一种选择性地扩增DNA特定片段的手段。该片段可能代表DNA大而复杂的混合物的一小部分。人类基因的特定外显子。它可以被认为是分子复印机。PCR可以在~2小时内扩增出可用数量的DNA（通过凝胶电泳可见）。模板DNA不需要高度纯化一个煮沸的细菌菌落。可用限制性内切酶对PC R产物进行酶切，测序或克隆。PCR可以扩增单个DNA分子，例如，从一个精子聚合酶链反应依赖于DNA复制酶在高温下保持稳定的能力。PCR 已经改变了几乎所有需要操纵DNA片段的研究都可能由于其简单和有用而进行的方式。在Mullis的原始PCR过程中，该酶被用于体外。将双链DNA加热至96°C，分离成两条单链DNA。然而，在这个温度下，大肠杆菌DNA聚合酶被破坏，因此在每个循环的加热阶段后，酶必须补充新的新鲜酶。穆利斯最初的PCR 过程非常低效，因为它需要大量的时间、大量的DNA聚合酶，以及整个PCR过程中的持续关注。 PCR技术的步骤

PCR扩增的原理和操作步骤 有哪些

PCR扩增的原理和操作步骤有哪些 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经高温变性;--;低温退火;--;引物 PCR扩增仪 延伸三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。 在环境检测中，靶核酸序列往往存在于;-;个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR技术常与其他技术结合起来使用，如RT-PCR、竞争PCR、槽式PCR、RAPf)、ARDRA等。 到如今，PCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。 PCR原理：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶的作用下，以单链为模版，根据碱基互补配对原则复制成新的单链，与模版配对成为双链分子拷贝。在体外实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计与模板DNA的5端结合的两条引物，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制，多次重复变性解链-退火-合成延伸的循环就可以以几何级数大量扩增特定的基因。而发现耐热DNA聚合酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该类酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技

RCA根本原因分析法

RCA根本原因分析法 在南宁市邕宁区人民医院的培训中，特别邀请台湾医疗质量管理专家顾问任老师开设了根本原因分析法(Root Cause Analysis，简称RCA分析法) 课程。RCA分析法是一种系统性、回溯性的处理法，被国际医疗界认为是提升病人安全的重要方法之一。它是一种结构化的分析问题过程，用以逐步找出问题的根本原因并加以解决，而不是仅仅关注问题的表现。透过逐步探寻可能再次引发类似事故发生的潜在原因，采取有效的纠正和预防的手段，从而达到彻底解决问题的目的，推荐这种分析方法的主要目的是针对医院发生的医疗事故进行原因分析，从而进行医院管理制度的完善，避免相关事故的再次发生。其精神在于建立“持续改进”的组织文化，有效促进了组织内部对话与团队协作，无论对于突发的重大事故还是潜在的异常状态，都具有较好的处理效果。RCA分析法经过三十多年的发展，随后逐渐得到国际医疗界的认同，成为提升病人安全的重要方法之一。JCI机构在对美国以外的医疗机构认证标准中，也明确提出了应采用此类方法找出潜在的系统原因，及时纠正，避免类似事件再次发生。本期课程培训重点与特色，除介绍RCA、工具及步骤外，更以工作坊(Workshop)形式进行实际案例分组演练，透过团队头脑风暴与分享获得实作经验。课后医院选定三件

真实案例进行实际分析，并为期1周详细且有针对性的辅导，最后医院公布竞赛办法与成果展示。 培训课堂中，任老师首先说明了什么是RCA分析法?RCA的用途?哪些事件需要进行RCA分析?并介绍了RCA四个阶段：WHAT（发生甚么事?）-WHY（近端原因为何?）-HOW （根本原因确认）-ACTION（发展改善行动）。任老师还介绍了别的其他分析工具用于这四个阶段的材料收集、资料分析，这些分析工具分别为头脑风暴时间序列表、鱼骨图、原因树（five-whys tree）等分析方法。如何评定医疗不良事件的严重度进行评估呢？医院可以通过制定异常事件严重度 评估矩阵图(SAC，MatrixSeverityAssessment Code，如表一)或者异常事件判定树进行评定。将不良事件进行了事件严重度分类（见表二），再根据风险等级行动建议（图三）进行进一步行动，极重度伤害和重度伤害都高度风险和严重风险都应该进行RCA并整改。表一：异常事件严重度评估矩阵（SAC）Matrix Severity Assessment Code严重度频率分级死亡极重度伤害重度伤害中度伤害轻度伤害无伤害数周 一次一一二三三四1年数次一一二三四四1-2年一次一二二三四四2-5年一次一二三四四四5年以上二三三四四四

什么是根本原因分析RCA

什么是根本原因分析(RCA) 目录 一、RCA的定义 二、RCA发展史 三、RCA的建议流程 1.明确问题 2.制定计划 3.证据收集 4.数据分析 5.明确原因 6.执行整改 一、RCA的定义： 今天我们来说另外一个流程，叫做根本原因分析，英文叫做Root Cause Analysis (RCA)。有人说这个不是维修与可靠性的流程啊，这个还真是有些争议，很多人认为这是一个安全行业的流程。但我们其实不必理会这些学术之争，但也没有必要非要做个亲子鉴定。至少在维修与可靠性这个行业里面，你肯定需要参与很多这个流程。设备坏了，停产了，伤人了，不给老板一个完美的解释，是不会轻易过关的。 说定义其实比较简单，RCA是针对特定问题或事故，识别其发生的根本原因的一类方法。所以RCA流程的第一个特点就是找到根本和真正的原因。 除了这个以外， RCA流程还有一些其他的特性。我们也先大致介绍一下： ?都是遵循一个系统且结构化的流程来进行事故调查，不是拍脑门侃大山 ?重事实将证据，都需要以数据收集作为依据和判断的基础 ?摒弃人为主观因素，所以什么假设，认为，意见等都不能作为论据

?几乎所有的事故根本原因都有人为因素及背后的深层原因存在 ?RCA不是靠个人英雄主义，一定是靠团队合作才可以 二、RCA发展史： 说完了定义，按照我的老毛病，一般先聊聊RCA的发展史，其实是具体方法的发展史。我们既然说RCA是一类方法，那就是有很多种方法都可以归集到RCA领域。有些方法大家耳熟能详，有的可能不太熟悉。先按照年份来吧： ?1958年：5 WHY，发明人是 Sakichi Toyota (一看就知道是日本人) ?1962年：事故树分析法(Fault Tree Analysis(FTA)), 贝尔实验室 ?1968年：鱼刺图分析法，发明人是 Kaoru Ishikawa (又一个日本人) ?1986年：大名鼎鼎的6 Sigma，主要由Motorola出品(当然你也可以认为把6 Sigma扯到RCA里有点拉大旗作虎皮的意思) ?1986年：Latent Cause Analysis (LCA?) ，由Failsafe公司出品 ?1991年：TapRoot?，由–System Improvements, Inc出品 ?1995年：Apollo根本原因分析法，由 ARMS公司出品 ?2000年：Cause Mapping分析法，由–ThinkReliability 公司出品