优化醋酸钾_KAC_法提取蚜虫基因组DNA
优化醋酸钾(KAC)法提取蚜虫基因组DNA
赵丽娟1
,漆永红2
,刘永刚2
,张正英
1
3
(1.甘肃农业科学院生物技术研究所,甘肃兰州730070;2.甘肃农业科学院植物保护研究所,甘肃兰州730070)
摘要 [目的]探索一种简便、有效的单头蚜虫基因组DNA 提取方法。[方法]以从不同地区采集的桃蚜为试材,采用改进的K AC 法和优化的K AC 法提取单头桃蚜的基因组DNA,用紫外分光光度计测定所提DNA 的浓度(以OD 260/280表示),用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提DNA 的纯度,比较2种方法的提取效果;对优化K AC 法所提DNA 进行PCR 扩增和电泳检测。[结果]优化K AC 法提取的单头蚜虫基因组DNA 的OD 260/280为1.6～1.9,浓度为20～50ng/g;改进K AC 法提取的单头蚜虫基因组DNA 的OD 260/280为1.4～1.7,浓度为8～25ng/g;来自同一地方桃蚜的基因组DNA PCR 扩增产物的电泳条带基本相同。[结论]优化改进的K AC 法提取的桃蚜基因组DNA 浓度和纯度均较高。关键词 基因组DNA;桃蚜;提取方法;优化中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)10-04394-02Extraction of Genom e D NA of Aph i d by O pti m ized Pota ssium Aceta te (KAC)
ZHAO L i 2juan et a l (Insititute of B io 2technique,Gansu Academy of Agricultural Science,Lanzhou,Gansu 730070)
Abstract [Objective ]The ai m was t o exp lore a si m p le and effective extracti on method f or extracting genome DNA of single aphid .[Meth 2od ]W ith peach aphids from different areas as the tested materials,the i mp r oved K AC method and op ti m ized K AC method were taken to ex 2tract the genome DNA of single aphids .The concn .of obtained DNA (OD 260/280)was deter m ined by ultravi olet s pectr ophotometer and its puri 2ty was deter m ined by 0.8%agar ose gel electrophoresis .The extraction effects of 2methods were compared .The DNA obtained by op ti m ized K AC method was amp lified with PCR and detected by electrophoresis .[Result]The OD 260/280of single aphids genome DNA extracted with op 2ti m ized K AC method was 1.6-1.9and its concn .was 20-50ng/g .The OD 260/280of single aphids genome DNA extracted with i m p roved K AC method was 1.4-1.7and its concn .was 8-25ng/g .The electrophoresis stri p of PCR amp lificati on p roducts of single aphids genome DNA fr o m the sa me area was si m ilar .[Conclusi on ]The concn .and purity of aphids geno me DNA extracted with opti m ized K AC method were higher .Key words Genome DNA;Peach aphid;Extraction method;Opti m ization
基金项目 甘肃省科技厅事业费(QS0312C31215)。
作者简介 赵丽娟(1979-),女,河北行唐人,硕士,从事种质资源研究工
作。3
通讯作者。
收稿日期 2009201207
蚜虫(Aphidinea )为同翅目(Ho moptera )蚜总科(Aphidoidea )和球蚜总科(Adelg oidea )昆虫,世界已知4700余种[1]
,我国
蚜虫资源丰富,已知的有1000余种[2]
。大多数蚜虫为重要
的农林经济植物害虫[3]
,但也有少数种类的蚜虫如五倍子蚜(Schlechtendalia chinensis (Bell ))是具有较高经济价值的资
源昆虫
[4]
。桃蚜(M yzus persicae (Sulzer ))是同翅目(Ho 2
mop tera )蚜科(Aphididae )的一种杂食性害虫,其寄主植物多
达74科285种,该类蚜虫通过刺吸汁液、传播病害等造成作物植株矮小,叶片黄化、卷缩,产量和品质下降
[5-6]
。蚜虫是
昆虫世界中较为奇特的一个类群,其形态变化大,个体小,且具有多型现象。根据传统的形态学特征对蚜虫进行分类和鉴定时,鉴定过程繁琐复杂,且鉴定技术不易掌握。而近年来发展起来的分子生物学方法能够准确、快捷的鉴定蚜虫形态和生物学特性
[7]
。
单头蚜虫基因组DNA 提取是开展蚜虫分子遗传学研究的前提。蚜虫DNA 的提取方法很多,如B lack 等[8]
采用匀浆法提取蚜虫基因组DNA 并用于RAP D 扩增,我国学者田英芳等[9]
采用S DS 法提取昆虫基因组DNA,杨效文等[10]
采用
醋酸钾(K AC )法提取烟蚜DNA,安瑞生等[11]
对K AC 法进行
了改进。
笔者以安瑞生等的K AC 提取方法为基础
[11]
,根据蚜虫
体型微小,体表有外骨骼等特点,对改进的K AC 法进行了优化,旨在探索一种简便、有效的单头蚜虫基因组DNA 提取方法,解决蚜虫DNA 提取困难且DNA 不稳定等问题,为蚜虫分子生物学研究提供技术支撑。
1 材料与方法1.1 材料
1.1.1 样品采集与保存。供试桃蚜(M yzus persicae (Sulzer ))
于2007～2008年采自甘肃省武威市、定西市、天水市等13个地区的马铃薯植株。将从各地区采集的有翅蚜和无翅蚜分别放入1.5m l 离心管中,用无水乙醇浸泡,-20℃保存。
1.1.2 试剂及仪器。DNA 提取匀浆缓冲液,由A 液、B 液、C
液3部分组成,各溶液现配现用(A 液:Tris 2HCl 0.05mol/L,
NaCl 0.025mol/L,E DT A 0.025mol/L,pH 值8.0;B 液:1%S DS 溶液;C 液:20mg/m l 蛋白酶K )。主要仪器:Heraeus 台
式高速离心机,JY 600+
电泳仪,FTI 2500凝胶成像分析系统,MJ PT C 2100PCR 仪,He λI O S а紫外分光光度计。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA 的提取。将无水乙醇中浸泡的蚜虫置
于无水乙醇、双蒸水中依次漂洗,用吸水纸吸干水分。将漂洗后的单头蚜虫移至1.5m l 离心管中,加入50μl DNA 提取匀浆缓冲液,用灭菌牙签充分研磨,直至虫体完全破碎,再用
150μl 匀浆液分次将牙签冲洗干净。65℃水浴120m in (期
间取出混匀3次),直至混合液清亮。在混合液中迅速加入
100μl K AC 溶液,立即轻摇混匀,-20℃静置1h,12000r pm
离心10m in 。取离心后的上清液,加2倍体积预冷的无水乙醇(使用前-20℃静置1h 以上)充分混匀,-20℃静置5h,
12000r pm 离心15m in,弃上清,得DNA 沉淀。向离心管内
加入200μl 70%乙醇洗涤DNA 沉淀,12000r pm 离心10min,倾去上清液。将离心管倒扣在干净的餐巾纸上,自然干燥后加入无菌1×TE 溶液(pH =8.0)25μl,用手指轻弹使DNA 充分溶解,然后将离心管放入50℃水浴中温浴8h,-20℃保存备用。
责任编辑 常俊香 责任校对 吴晓燕
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri .Sci .2009,37(10):4394-4395,4398
1.2.2 DNA 浓度和纯度检测。DNA 纯度采用0.8%琼脂糖
凝胶电泳检测,上样量3.0μl/孔,电压80V (4V /c m ),电泳时间45m in,电极缓冲液为1×T BE 。0.05%E B 染色,紫外灯下观察、照相、分析,以GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus 为分子量标准。用紫外分光光度计测定DNA 的OD 260值和
OD 260/280值,据此确定DNA 浓度。
1.2.3 PCR 扩增。选用SS R 随机引物myz9(5′-3′)(F:AACCT C ACCT CGTGG AGTT CG,R:CTTGG ATGTGTGTGGGGT 2GC )对所提取的模板DNA 进行扩增。PCR 反应体系为20
μl,其中含2μl 10×Buffer (含Mg 2+),1.6μl 10mmol/L d NTPs,2.4μl 25ng 引物,1.2μl 2.5U Taq 聚合酶,0.8μl
DNA 模板和12μl ddH 2O 。反应条件为:94℃预变性5m in,35个循环:94℃变性45s 、52℃退火45s 、72℃延伸45s,再72℃终延伸10m in,4℃保存。将扩增后的DNA 在1.5%琼
脂糖凝胶中进行电泳,上样量为每孔6.0μl,电压90V
(4V /c m ),电泳时间60m in,电极缓冲液为1×T BE 。0.05%E B 染色,紫外灯下观察、照相、分析。以GeneRuler 100bp DNA Ladder Plus 为分子量标准。2 结果与分析
2.1 优化的KAC 法提取的桃蚜基因组DNA 检测结果 优
化的K AC 法提取的单头桃蚜基因组DNA 的电泳图谱见图
1。由图1可知,DNA 电泳条带基本呈线形,谱带整齐,无拖
尾现象,说明提取的DNA 结构较完整。紫外分光光度计检查结果表明,DNA 样品的OD 260/280值在1.6～1.9之间,说明
提取的DNA 浓度较高,其浓度介于20～50ng/μl,平均为40ng/
μl,
可满足桃蚜分子生物学研究的需要。注:M 为Marker;1～6为桃蚜基因组DNA 。
Note:M.Marker;1-6.Myzus Persicae geno m ic DNA.
图1 优化的KAC 法提取的桃蚜基因组D NA 电泳图谱
F i g .1 The electrophoretogram of M yzus Persicae geno m i c D NA
by opti m i zed Ka li u m Aceti cu m method
2.2 改进的KAC 法提取的桃蚜基因组DNA 检测结果 改
进的K AC 法提取的单头桃蚜的基因组DNA 电泳图谱见图
2。由图2可知,DNA 扩增产物没有聚成条带,拖尾现象严
重,检测不到DNA,说明该方法提取的DNA 量较少,得率低,且杂质多。紫外分光光度计检测结果表明,DNA 样品的
OD 260/280值在1.4～1.7之间,说明DNA 含量低,而其中蛋白
质含量较高。DNA 浓度介于8～25ng/
μl,平均为16ng/μl 。2.3 PCR 扩增结果 用SS R 随机引物myz9对优化后的K AC 法提取的桃蚜基因组DNA 进行PCR 扩增,对扩增产物
进行电泳检测(图3)。由图3可知,同一地方桃蚜的基因组
DNA 扩增的条带基本相同,可见优化的K AC 法提取的DNA
质量较好,扩增产物性质稳定。而改进的K AC 法提取的桃蚜基因组DNA
没有扩增出稳定的条带。
注:M 为Marker;1～7为桃蚜基因组DNA 。
Note:M.Marker;1-7.Myzus Persicae geno m ic DNA.
图2 未优化的改进的KAC 法提取桃蚜基因组D NA 电泳图谱
F i g .2 The electrophoretogram ofM yzus Persi cae geno m i c D NA
by i m proved Ka li u m Aceti cu m
method
注:M 为Marker;1～6为PCR 扩增产物。
Note:M.Marker;1-7.Myzus Persicae geno m DNA.
图3 桃蚜基因组D NA SSR 随机引物PCR 扩增结果
F i g .3 PCR ampli f i cati on results of SSR rando m pri m ers of
M yzus Persi cae geno m i c D NA
3 结论与讨论
运用分子生物学技术从核酸水平研究昆虫的种类和生物学特征是现代昆虫分子系统学和昆虫遗传学的研究热点之一
[12]
。与形态学等基因表达型特征相比,分子遗传特征
是生物的更本质的特征,其变异只来源于DNA 序列的差异,具有稳定性高,受环境条件影响小等特点,非常适合小型昆虫蚜虫的研究
[13]
。该试验对安瑞生等
[11]
改进的K AC 法进
行了优化,优化后的方法能够简便、有效地提取单头蚜虫基因组DNA,且所提取的DNA 质量好、性质稳定,为蚜虫分子生物学研究提供了技术上的保证。
在真核生物中,95%DNA 主要存在于细胞核中,分离提取DNA 总的原则是保证DNA 一级结构的完整性和高纯性。同改进的K AC 法比较,优化的K AC 提取法具有以下优点:①在蚜虫基因组DNA 提取过程中,破碎细胞是关键。该方法在常温下直接用灭菌的一次性牙签捣碎虫体,成本低、不易造成交叉污染且操作简便。②匀浆液分2次加入,确保研磨充分,样品损失少,DNA 得率高。③针对蚜虫体表有外骨骼,消化困难等特点。该方法在提取匀浆液中加入蛋白酶K 促进蚜虫组织彻底消化,同时将水浴时间从45m in 延长至
120m in,提高了蛋白酶K 的活性,促进了RNA 分解。④取消
了平衡酚和氯仿抽提,提高了DNA 得率。⑤延长了DNA 沉淀时间,减少了RNA 干扰。⑥在提取昆虫基因组DNA 时,许多方法采用新鲜或冻存标本,而该研究以酒精浸泡1年多的蚜虫为标本,所提取的DNA 质量好、性质稳定。由此可见,改进K AC 法提取蚜虫基因组DNA 操作简单,对试剂设备要求较低,是一种较好的有效提取蚜虫DNA 的方法。
(下转第4398页)
5
934 37卷10期 赵丽娟等 优化醋酸钾(K AC )法提取蚜虫基因组DNA
2.3 NAA浓度对柽柳无根苗生根培养的影响 将24号继代培养基上产生的无根苗接种于29～34号培养基上进行生根诱导,观察结果见表3。接种7d以后不定根陆续产生,在NAA水平为0时,尽管发根较快,但主根和侧根数量少,吸收面积小,不利于壮苗。当NAA浓度为0.50和1.00mg/L时,主侧根发生不明显,并且在无根苗基部有愈伤组织产生。因而柽柳生根培养时,采用MS培养基时NAA适宜添加浓度为0.05mg/L。
表3 不同NAA浓度对柽柳无根苗生根的影响
Table3 Effects of di fferent concen tra ti on s of NAA on rooti n g
培养基编号Mediu m nu mber NAA
mg/L
生根最早时间∥d
Earliest ti m e of r ooting
主根数∥条
Main r oots nu mber
主根长∥c m
Main r oots length
侧根数∥条
Lateral r oots nu mber
其他
O thers
29071.53.03.0
300.0172.02.33.9
310.0574.53.58.1
320.2593.13.38.8
330.5016--很多愈伤组织341.0020--很多愈伤组织
3 结论与讨论
在以柽柳幼嫩枝条为外植体的诱导培养过程中,发现在不添加外源激素的1号培养基上大多能够产生少量的不定根,说明在柽柳内源激素中生长素类水平较高,2号及其他不添加NAA的培养基,其培养效果也验证了这一结论。因此,当柽柳以嫩枝方式进行离体快繁时,诱导培养仅用BA就可取得良好效果,不仅操作简单,成本降低,而且速度快,效率高。BA最适宜的浓度为2.00mg/L。
植物生长调节物质在试管苗增殖中起决定性作用。在实际操作中,一般高浓度的细胞分裂素和低浓度的生长素配比,既能提高腋芽的增殖速度,也能保证腋芽健壮生长,为后续的生根培养打下基础[10]。从柽柳的继代培养过程也验证了这一结论:BA和NAA二者配合使用,要比单独应用BA增殖的效果好,但是NAA的浓度又不能太高,否则丛生芽的质量就受到影响。柽柳最适宜的继代培养基成分是:MS+BA 0.50mg/L+NAA0.01mg/L。
从柽柳生根培养中可以看出,根产生的时间早晚与NAA 浓度呈负相关。从形成的柽柳根系质量和茎枝发育状况来看,当NAA浓度较低时,根系较为正常,植株发育良好,随着浓度的提高,主侧根不明显,根量虽然大,但根弱,枝条细嫩,分枝少。所以,当NAA浓度为0.05mg/L时最好,主侧根明显且数量大,枝条色绿、粗壮、分枝多。这可能是因为适当降低外源生长素的含量,有助于内源细胞分裂素的激活[9],可使生根的同时枝条能保持旺盛的营养生长。
参考文献
[1]朱跃,许鹏.柽柳及其推广价值[J].山西林业,2001(6):22-23.
[2]张立宾,宋曰荣,吴霞.柽柳的耐盐能力及其对滨海盐渍土的改良效果
研究[J].安徽农业科学,2008,36(13):5424-5426.
[3]王景志,盖文杰,刘岩山,等.柽柳的绿化价值与栽培[J].林业实用技
术,2002(8):11-12.
[4]卫芙蓉,郭美蓉,吴全忠.浅谈盐碱地柽柳的园林应用[J].山西林业科
技,1999(3):39-41.
[5]滕士远,李鹏.柽柳应用前景及其栽培技术[J].林业科技开发,2005,19
(2):62-64.
[6]宋恩泰,李军元,梁盛名.干旱沙区柽柳扦插育苗技术[J].甘肃科技,
2008,24(5):630-631.
[7]陈涛.柽柳育苗造林技术[J].青海农林科技,2005(3):68-69.
[8]张莹花,徐延双,齐力旺,等.不同激素及浓度处理多枝柽柳嫩枝插穗
对其扦插育苗的影响[J].西部林业科学,2007,36(4):710-712.
[9]顾信河,曹兆阳,陈军.柽柳扦插繁殖技术[J].林业科技开发,2007,21
(4):67-69.
[9]程磊,周根余.柽柳的组织培养与快速繁殖[J].上海师范大学学报:自
然科学版,2001,30(2):67-71.
[10]曹孜义,刘国民.实用组织培养技术教程[M].兰州:甘肃科学技术出
版社,1996:52.
(上接第4395页)
参考文献
[1]VON DOHLE N,RO WE C A,HEI E O E.A test of mor phol ogical hy pothe2
ses f or tribal and subtribal relati onshi ps of Aphidinae(I nsecta:He mi ptera: Aphididae)usingDNA sequences[J].Molecular Phyl ogenetics and Ev olu2 ti on,2006,38:316-329.
[2]乔格侠,张广学.中国蚜虫多样性初步研究(分类和地理变异)[M].北
京:科学出版社,2004.
[3]张广学.西北农林蚜虫志[M].北京:中国环境科学出版社,1999.
[4]张广学,乔格侠,钟铁森,等.中国动物志(昆虫纲l4卷同翅目纩蚜科,
瘿绵蚜科)[M].北京:科学出版社,1999.
[5]ZI T OUD I K,MARG ART OP OULOS J T,MA MUR I S Z.Genetic variati on
in Myzus Persicae populati ons ass ociated with host2plant and life cycle cat2 eg ory[J].Ent o mol ogia Ex peri m ental Applicata,2001,99:303-311. [6]LE2FE UVRE R R,RA MREZ C C,OLE A N.Effect of an ti m icr obial pep2
tide indoliciclin on the green peach aphid M yzus per sicae(Sulzer)[J].
Joural of Applied Ent o mol ogy,2007,131(2):71-75.[7]LOADALE H D,LUS HA I G.Molecularmarkers in ent o mol ogy[J].Bulletin
of Ent o mol ogical Research,1998,88:577-600.
[8]BLACK I V W C,DUTE AU N M,P UTERK A G https://www.360docs.net/doc/3817000988.html,e of the rando m
a mp1ified poly mor phic DNA poly merase chain reacti on(RAP D2PCR)t o
detect DNA poly mor phis ms in aphids[J].Bulletin Ent o mol ogical Re2 search,1992,82:151-159.
[9]田英芳,黄刚,郑哲民.一种简易的昆虫基因组DNA提取方法[J].陕
西师范大学学报:自然科学版,1999,27(4):82-84.
[10]杨效文,张孝羲,陈晓峰,等.不同寄主植物上烟蚜DNA多态性的
RAP D2PCR分析[J].植物保护学报,1999,26(2):147-152.
[11]安瑞生,谭声江,陈晓峰.小型昆虫DNA提取时匀浆方法的改进[J].
昆虫知识,2002,39(4):311-312.
[12]张迎春,郑哲民.6种瓢虫的RAP D分析及在分类上应用的研究[J].
西北大学学报:自然科学版,2002,32(4):409-412.
[13]龚鹏,杨效文,谭声江,等.分子遗传标记技术及其在昆虫科学中的应
用[J].昆虫知识,2001,38(2):86-9l.
8934 安徽农业科学 2009年
人类基因组计划.doc
【篇一】人类基因组计划随着人类基因组计划的完成 随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。从最初第一代以Sanger 测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005 年，以Illumina 公司的Solexa技术和ABI 公司的SOLiD 技术为标志的新一代测 序(next-generation sequencing，NGS) 的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。2009 年3 月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着NGS 测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。同年，《Nature》发表了采用NGS 技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3 致病基因突变和《Nat Genet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。此后，通过NGS 技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS 技术已成为里程碑式的进步。2010 年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范
植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根)
植物基因组DNA提取试剂盒 1 取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分研磨。 2 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 3 加入700 μL氯仿，充分混匀，12,000 rpm（~13,400×g）离心5 min。 注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。 4 小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，充分混匀。 5 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。） 6 向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7 向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8 重复操作步骤7。 9 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。 10 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。 注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μL，体积过小影响回收率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置 2 min，12,000 rpm （~13,400×g）离心2 min。
人类基因组计划研究的进展及其意义
人类基因组计划研究的进展及其意义 摘要：文章综述了人类基因组计划研究和进展的情况 关键词： 正文： 定义 人类基因组计划(human genome project, HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。按照这个计划的设想，在2005年，要把人体内约4万个基因的密码全部解开，同时绘制出人类基因的谱图。换句话说，就是要揭开组成人体4万个基因的30亿个碱基对的秘密。命人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。被誉为生科学的"登月计划"。 人类基因组计划(英语:Human Genome Project, HGP)是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程。其宗旨在于测定组成人类染色体(指单倍体)中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。基因组计划是人类为了探索自身的奥秘所迈出的重要一步，是继曼哈顿计划和阿波罗登月计划之后，人类科学史上的又一个伟大工程。截止到2005年，人类基因组计划的测序工作已经完成。其中，2001年人类基因组工作草图的发表(由公共基金资助的国际人类基因组计划和私人企业塞雷拉基因组公司各自独立完成，并分别公开发表)被认为是人类基因组计划成功的里程碑。 背景 20世纪是物理学和化学的世纪,21世纪是生物学的世纪。生命科学将取代物理学和化学成为带头学科,从而为其他学科的研究和发展提供新的思路和方法,生物工程产业将成为支柱产业。早在上世纪中叶,生物技术就被称作是21世纪的关键技术。许多科学家预言,生物技术将与信息技术、材料技术以及能源技术共同构成新的技术革命的基础,生物技术将重塑医学、农业以及生命科学研究本身,进而改造社会,改变人类的生活方式。一些重大的研究项目如人类基因组计划、体细胞克隆技术、转基因技术等的影响已超出了学科的范围,引起了公众的广泛关注。在生命科学领域随着分子生物学研究的不断深入,80年代末出现了一个新的研究领域———基因组学(Genomics)。基因组研究被称作是20世纪末21世纪初最重大的全球性的科研项目,其中以人类基因组计划(HGP)最为重要 人类基因组计划研究的目的,是获得人类染色体的物理图谱和基因图谱以及测定核苷酸的全序列 进展 人类基因组计划是由美国国立研究院和能源都1990年发起,后来有德、日、英、法、中等国科学家加入,有至少16个实验室及1100名生物学家、计算机专家和技术人员参与,预计耗资30亿美元,在15年内完成。人类基因组计划正式启动以来,受到人类各界的极大关心,经过全球科学家的努力,各阶段进展一再提前,已提前完成绘制出基因的遗传图谱和物理图谱的草图,现在已进入大规模的测序阶段。目前已完成了人类基因组约50%的测序,预期在2005年将能
基因组DNA提取方法
1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE 溶液中，置4oC保存备用。 2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE （50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。 3 1) 细菌培养：细菌接种于5ml 液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP 管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O 也行)。3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。7) 抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。
(整理)人类基因组计划.
人类基因组计划 HGP(Human Genome Projects) 1、HGP简介 ?人类基因组计划是由美国科学家于1985年率先提出、于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一价值达30亿美元的人类基因组计划。这一计划旨在为30多亿个碱基对构成的人类基因组精确测序，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息。 ?诺贝尔奖获得者Renato Dulbecco于1986年发表短文 《肿瘤研究的转折点：人类基因组测序》（Science, 231: 1055－1056）。 ?文中指出：如果我们想更多地了解肿瘤，我们从现在起必须关注细胞的基因组。…… 从哪个物种着手努力？如果我们想理解人类肿瘤，那就应从人类开始。……人类肿瘤研究将因对DNA 的详细知识而得到巨大推动。” 什么是基因组(Genome) ?基因组就是一个物种中所有基因的整体组成 ?人类基因组有两层意义： ——遗传信息 ——遗传物质 ?从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系。 人类染色体 HGP的诞生 ?1984年12月Utah州的Alta,White R受美国能源部的委托，主持召开了一个小型会议，讨论DNA重组技术的发展及测定人类整个基因组的DNA序列的意义。 ?1985年6月，在美国加州举行了一次会议，美国能源部提出了“人类基因组计划”的初步草案。?1986年6月，在新墨西哥州讨论了这一计划的可行性。随后美国能源部宣布实施这一草案。?1987年初，美国能源部与国家医学研究院（NIH）为“人类基因组计划”下拨了启动经费约550万美元，1987年总额近1.66亿美元。同时，美国开始筹建人类基因组计划实验室。 ?1989年美国成立“国家人类基因组研究中心”。诺贝尔奖金获得者J.Waston出任第一任主任。?1990年，历经5年辩论之后，美国国会批准美国的“人类基因组计划”于10月1日正式启动。美国的人类基因组计划总体规划是：拟在15年内至少投入30亿美元，进行对人类全基因组的分析。 HGP诞生过程中的质疑 ?计划的必要性问题 ?计划的现实性问题 ?科学研究领域的选择问题 ?为什么不选择基因组小的或有经济意义的生物 ?认为?°制图?±是在沙漠里建公路，?°测序?±是把?°垃圾?±分类，选择?°模式动物?±是拼凑?°诺亚方舟?±。
人类基因组研究的几个伦理问题
收稿日期:2003-03-29 修回日期:2003-07-20 作者简介:姚建国(1960 ),男,江西贵溪人,讲师,从事医学教学管理;雷锦程(1964 ),男,江西东乡人,副教授,主要从事医学伦理与法 律研究。 人类基因组研究的几个伦理问题 姚建国,雷锦程 (江西医学院,江西南昌 330006) 摘 要:人类基因组研究伴生诸多伦理问题。个人或家族的基因隐私权是不受他人侵犯的自然权利;基因歧视侵犯了人的基本权利和基本自由,社会应运用立法来防止基因歧视;对基因功能的认识属于科学发现的范畴,不应有基因专利;基因决定论以及在此基础上的 优生学 会导致伦理灾难;对基因技术的运用,伦理学评价应置于优先地位。 关键词:基因隐私权;基因歧视;基因专利;基因决定论;伦理 中图分类号:B82-057 文献标识码:A 文章编号:1006-0448(2003)05-0031-04 在当代高科技中,生物技术具有最诱人的前景,诸如细胞工程、基因工程、克隆技术、人类基因组计划等,仿佛给人类展现出十分美好的未来。无怪乎许多科学家和技术官员都欢欣鼓舞地宣称:21世纪是生物科学的世纪。然而,正当科学家信心百倍地向生物技术深入挺进时,伦理学家和社会学家却忧心忡忡。生物技术比人类历史上拥有过的任何技术都更为深入地侵扰、干预了自然秩序,人类正面临着前所未有的伦理挑战。在诸多的生物技术中,人类基因组研究被誉为人类生命科学史上最伟大的工程,它可与人类登月计划和曼哈顿计划相媲美。由于不可估量的商业价值和技术本身诱惑力的驱动,人类基因组研究正飞速发展,相关伦理问题已引起了生命伦理学界和全世界的高度关注。本文试图从基因隐私权及知情权、基因组图谱的信息使用与人的社会权利、基因专利与资源争夺、基因决定论与优生学、基因组研究成果应用的不可预测性等角度来谈谈人类基因组研究中存在的伦理问题。 一 个人及家族遗传信息的权利归属问题 人类基因组计划的一个主要目标是绘制遗传链锁图。研究者在利用不同来源的基因资源绘制遗传 链锁图时,可能获得对某些家族或个人来说有意义的预警信号 该家族对某一种疾病具有易感性,患该种疾病的几率相对较大。这时就会产生问题:涉及该家族特有遗传信息的信息权利归属于谁?是归属于提供基因资源来源的个人或其家族?抑或归属于研究者?个人或家族对自身的信息有否知情权?知情权如何实现?研究者是否应当像医生尊重病人的隐私权一样充分尊重该家族的遗传信息隐私权并履行保密义务?研究者是否应向该家族发出预警信号,甚至采取保护性、预防性措施呢?有论者认为应该以实行隐私权为主,只有当医学上确定会出现严重的、不可避免的疾病时,才可解除保密,告知当事家族。 笔者以为,有关个人或家族特有遗传信息,特别是涉及某些遗传性疾病的信息,其信息所有权应当归属于个人或家族,这是人的自然权利的一种 基因隐私权。研究者所做的工作仅仅是揭示了这些信息的含义。这和医生在治病过程中了解到病人的病情与病人的隐私一样,医生不因此而获得病人病情信息的所有权。研究者作为生物医学专家,他有能力理解并揭示遗传信息的含义,并不等于他就此拥有了这些信息并有权随意处置这些信息。人类社会生活中存在这样的情形,一个有文化的人帮助一 第34卷第5期2003年9月南昌大学学报(人社版) JOU RN AL OF N AN CHA NG U NI VERSIT Y Vol.34No.5Sep.2003
植物基因组DNA提取
植物基因组DNA提取 一、实验目的 1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。 2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验仪器及试剂 实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。 实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸（EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。 四、实验步骤 1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。 2.将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。 3.加入700 l的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。 4.置于65℃的水浴中，每隔10 min轻轻摇动，30 min后取出。
5.加入200 μl KAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30 min。 6.10000 rpm离心5 min，上清移至新离心管中，12000 rpm离心5 min。 7.上清移至新离心管中，加入700 μl异丙醇，-20℃冰箱30 min。 8.10000 rpm离心5 min，弃上清，加入500 μl 70%乙醇漂洗。 9.弃液体，晾干。 10. DNA纯度与浓度测定（使用nanodrop）。 （1）DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。 OD260/OD280 ≈ 1.8：说明较纯； OD260/OD280 > 1.8：说明可能有RNA污染； OD260/OD280 < 1.8：说明可能有蛋白质污染。 五、注意事项 1. 叶片磨得越细越好。 2. 注意移液器的正确使用。 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 六、结果与分析 1.植物DNA提取所用试剂的作用？ 2.植物DNA提取的关键步骤有哪些？ 3.植物DNA提取后的用途有哪些？ 4.从化学结构、化学性质、存在场所以及功能等方面比较DNA和RNA的异同。
人类基因组计划论文
人类基因组计划的重要性 “以破解人类遗传和生老病死之谜，解决人类健康问题为目的的人类基因组计划，对人类自身的生存和发展具有重要的意义。其旨在通过测定人类基因组DNA约3×109对核苷酸的序列，探寻所有人类基因并确定它们在染色体上的位置，明确所有基因的结构和功能，解读人类的全部遗传信息，使得人类第一次在分子水平上全面认识自我。” 基因作为掌控人类自身性状、特征和遗传的根本因子，以其简单的双螺旋结构、复杂的排列方式，使全世界范围内的每一个人类都有着相同的本质和不同的特质。基因的轰动范围极为广泛，我们身上的每一处体态特征几乎都由基因所决定，大到一个人的身高、外貌，小到一颗牙形的状，甚至是一根头发的直径都与基因有着密不可分的联系。众所周知，基因由五种碱基对以庞大的数量按一定顺序排列组合而成，其本质是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。在一个活跃的细胞内，特定的基因通过解旋、转录、翻译等一系列过程，来实现RN A、蛋白质等相应物质的合成，这些数以万计的不同形态不同功能的RN A、蛋白质在细胞内外发挥出他们自身的作用，从而达到控制人类机体、完善结构功能、协调组织器官运作的神奇效果。 由以上的事实我们可以看出，要想解开人类自身的秘密，就要从破解基因的密码做起。 人类基因组计划便应运而生了。该计划是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。按照这个计划的设想，在2005年，要把人体内约10万个基因的密码全部解开，同时绘制出人类基因的谱图。换句话说，就是要揭开组成人体4万个基因的30亿个碱基对的秘密。人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波1罗计划并称为三大科学计划。 “HDP（人类基因组计划）的目的是解码生命、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。”
基因组DNA提取步骤
基因组DNA提取步骤 1.从无水乙醇中取出少许组织（约50mg）加入干净灭菌的EP管中， 剪碎； 2.加入400ul 1％的SDS，8ul（20mg/ml）的蛋白酶K，充分浸润， 入55℃摇床（100转/分），期间振荡助溶至澄清（5-6h）； 3.取出消化液，加入6mol/L的NaCl300ul，氯仿200ul，轻柔正反 颠倒，使其充分乳化，4℃13000转/分离心30min； 4.取出上清（约400ul），加入等体积氯仿抽提一次，轻柔颠倒后， 4℃13000转/分离心10min； 5.上清加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一 般无影响，可省略该步骤）。 6.取上清加入等体积异丙醇，轻柔混匀后-20℃沉淀10min； 7.4℃13000转/分离心15min，弃上清； 8.用75％乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心2min），弃上 清； 9.冰冻无水乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心4min）弃上 清，自然晾干或烘干，DDW溶解，30-50ul。 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，
基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 从植物组织提取基因组DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和 1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、RnaseA母液：配方见第一章。 5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步骤： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下5000rpm离心5分钟。 5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转
人类后基因组计划及研究进展
人类后基因组计划及研究进展 摘要：2003年4月14日生命科学诞生了一个新的重要里程碑，人类基因组计划完成，后基因组时代正式来临。着重介绍了人类基因组计划的提出、目标与任务、实施与进展等方面的基本情况，讨论了后基因组时代的时间界定，分析展望了后基因组时代与人类基因组计划密切相关的生物信息学、功能基因组学、蛋白质组学、药物基因组学等几个重要研究领域。 关键词：人类基因组计划；研究进展 2003年4月14日，美国人类基因组研究项目首席科学家Collins F博士在华盛顿隆重宣布：人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划(human genome project，HGP)的所有目标全部实现。这标志“人类基因组计划”胜利完成和“后基因组时代”(post genome em，PGE)正式来l临，在举世庆祝“DNA双螺旋结构”提出50周年之际，生命科学诞生了一个新的里程碑。HGP被誉为可与“曼哈顿原子弹计划”、“阿波罗登月计划”相媲美的伟大系统工程，是人类第一次系统、全面地解读和研究人类遗传物质DNA的全球性合作计划。人类基因组序列图的成功绘制是科学史上最伟大的成就之一，奠定了人类认识自我的重要基石，推动了生命与医学科学的革命性进展。在后基因组时代，生命科学关注的范围越来越大，涉及的问题越来越复杂，采用的技术越来越高，取得的成就将越来越多，生命科学及其相关科学将大有作为。 1人类基因组计划的产生与目标 1984年12月，美国犹他大学的Wenter受美国能源部的委托，主持讨论了DNA重组技术及测定人类整个基因组DNA序列的意义．1985年6月，美国能源部提出“人类基因组计划”(Humangenome project，HGP)的初步草案．最早提出测定人类基因组序列的是美国科学家罗伯特·辛西默(Robert Sinshimer)．1986年3月，美国的诺贝尔奖获得者雷纳多·杜尔贝柯石(Renato Dulbecco)在《科学》杂志上发表的短文中率先提出“测定人类的整个基因组序列”的主张[1]，后经世界性的讨论取得共识．1987年，美国开始筹建“人类基因组计划”实验室．1988年，科学家开始讨论如何才能更快、更多、更好地研究与人类的生老病死有关的所有基因——全部的人类基因组．1989年，美国成立“国家人类基因组研究中心”，诺贝尔奖获得者、DNA分子双螺旋结构模型的提出者Jamse Wateson担任第一任主任．1990年10月，美国首先正式启动“人类基因组计划”(HGP)，完成人类全部DNA分子核苷酸序列的测定．1993年，美国对这一计划做了修订，其中最重要的任务就是人类基因组的基因图构建与序列分析，需最优先考虑、必须保质保量完成的是DNA序列图．随后，英国、法国、日本、加拿大、前苏联、中国等许多国家积极响应，都开始了不同规模、各有特色 的人类基因组研究。 1999年12月1日，人类首次成功地完成人体染色体基因完整序列的测定．2000年6 月26日，六国科学家公布人类基因组工作框架图，成为人类基因组计划进展的一个重要里程碑．2001年2月12日，人类基因组图谱及初步分析结果首次公布．2003年4月15日，美、英、德、日、法、中6个国家共同宣布人类基因组序列图完成，人类基因组计划的所有目标全部实现，提前2年实现了目标。 2人类基因组计划的内容
人类基因组计划的成果
类基因组计划的成果（一） 谁来当“亚当”---人类基因组多样性与个体医学已在进行的人类基因组计划，可以说是“代表性个体”人类基因组计划。在美国，现在用于用于绘制人类DNA序列的DNA 来自于几个“无名氏”的男性。这在当时还曾有过争论，谁可以做“亚当”？这个问题也重要也不重要。人类的所有个体、所有的人，在遗传上都是平等的。所有的人类基因组不管是在基因组中的位置，即基因位点，还是每一个基因的结构都是很相似的，绝对不存在好坏优劣之分。不管从哪一个人身上分离到的一个位点上的DNA片段，可以用于任何种族任何个体的这一位点的研究，这一位点致病等位基因的鉴定，将来可能的基因诊断与基因治疗。因此，我们说人类只有一个基因组，不存在黄种人基因组、白种人的基因组之分。一个基因被鉴定、分离了，进而被专利，就是全人类的这一基因组被专利了，我们不能说你专利的是白种人的基因，我们再来专利一个黄种人或中国人的基因。但人与人是不同的，这就是人类在“同一性”的前提下的“多样性”，多样性体现在每个人身上，称为“基因多样性”或“个体特异性”，一般每个人之间5%位点的等位基因不同有0.1%的序列不同。体现在黄种人棗白种人这一人种族差异上，可称为“种族多样性”，体现在民族（遗传上称为“族群”）上，称为“族群多样性”。将来的某一天，如果需要每一个人的全基因的全核苷酸序列也许能不费多少钱就测定了，并且记录在一个光盘上，要诊断疾病就方便啦。医生先把这个光盘装进计算机，检查几个有关的“候选基因”，看看要注意什么，譬如说，某种药物，有人用灵验，有人不灵验，这就是个体差异。这一差异很多是基因决定的，也就是“多样性”决定的，这对医生诊病很有帮助。当然，也许不需要了解一个人的整个基因组棗大家都大同小异，而把重要区域、重要基因、重要位点的“多样性”较高的区域搞清就行了。“全基因组”信息非同小可，表达了每一个人有关生、老、病、死的重要信息，它是一个人全部隐私中的最重要的隐私，可不是一个人一般生理指标，如身高、体重、胸围、血型等等，因此，它的使用可得慎之又慎。
实验六 印记基因v1(1)
实验六印记基因 一．实验目的 学习印记基因的鉴定方法。 二．实验原理 （一）背景知识 基因组印记是指组织或细胞中，基因的表达具有亲本选择性的现象，即只有一个亲本的等位基因表达，而另一亲本的等位基因不表达或很少表达，相应的基因则称为印记基因。只表达父本而不表达母本等位基因的印记基因称为母本印记基因；只表达母本而不表达父本等位基因的印记基因称为父本印记基因。 B830012L14Rik是一个非编码RNA基因，位于12号染色体上的印记基因簇中，目前该基因功能尚不明确。在该基因的第一外显子序列中存在一个SNP位点，在B6小鼠中该位点为A（AA），在ICR小鼠中则为碱G（GG）。而B6与ICR小鼠的子代杂交个体中则为AG。 若该基因非印记表达，则在子代个体的cDNA基因型为AG。而该基因若印记表达，则在子代杂合个体的cDNA基因型为OA或OG。通过对比父本或母本的基因型，便可判断该印记基因的表达模式。 （二）技术原理： 1. PCR 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是一种分子生物学技术，用于体外扩增特定的DNA片段。 PCR技术主要过程是，通过人类合成的一小断单链DNA片段（叫做引物）与模板DNA特定的区域特异性结合，进而以四种dNTP为底物，通过DNA聚合酶沿着引物和模板形成的双链部分的3’端聚合形成DNA片段实现DNA体外扩增的过程。其中，最重要的是热稳定的DNA聚合酶，由于该酶在97度以上的高温也能保持稳定，所以我们可以通过94～97度这个温度范围内处理DNA形成单链，然后降温（根据引物不同而有差异，一般为50-55度）直至适量的引物结合到模板上。最后温度提升至72度，聚合酶聚合形成双链DNA。
动物基因组DNA的提取
动物基因组DNA的提取 [实验原理] 在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。 通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。 [仪器、材料与试剂] (一)仪器 1.台式离心机 2.玻璃匀浆器 3．高压灭菌锅 4．恒温水浴 (二)材料 1．1.5mL微量离心管 2．微量取样器和吸头 3．无菌过滤器(一次性) 4．10 mL注射器 5．鼠肝 6．三羟甲基氨基甲烷(Tris) 7.十二烷基硫酸钠(SDS) 8．乙二胺四乙酸(EDTA)
9．蛋白酶K 10．RNA酶 11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物 (三)试剂 1、1.5 mol／L NaCl 2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.0 3．0.5 mol／L EDTA pH8.0 4．3 mol／L NaAc pH5.2 以上均高压灭菌。 5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制) 6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0) 7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS 8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存 9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0) 10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比) 11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比) 12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液
人类基因组计划的历史背景
人类基因组计划的历史背景 问题的提出 尽管生物机体的尺寸有限,但并未能为研究工作带来任何容易之处。人们经过了不懈的努力,渴望解开生命之谜这个多年的愿望并未向前推进多少,谜仍是个谜!以往研究的艰履或失败教训使人们头脑开始清醒地认识到,任何仅依靠单一学科如细胞学、发青学、肿瘤学、人类遗传学或分子生物学的独自努力都无济于事,都太局限了,难以完成人类对自身的认识和保护。美国曾投巨资但基本上以失败告吹了的肿瘤十年计划也说明了这个问题。所以,要知道某事物的局部作用机制最好先知道全局的看法逐渐主导了人们的认识(Dulbecco R,1986)。在绕了一大段弯路后,人们回过头来决定开始进行人的所有基因即基因组的研究,全面探讨这个“摸得到,猜不透',的人体奥秘,由此形成了基因组学(genomics)和人类基因组计划(Human Genome Project,HGP),其最终目的是对生命进行系统地和科学地解码,以此达到了解和认识生命的起源,种间和个体间存在差异的起因,疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象(Under ES,1996)。人类基因组计划以前的遗传学或称基因学(genetics)偏重于单个基因的研究,而人类基因组计划则是把目光投向整个基因组的所有基因,从整体水平去考虑基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系等。随着数理化、信息和材料等学科的渗透以及具有时代特征的工业化技术管理模式的引进,HGP真正成为了生命科学领域的第一项大科学工程,其规模和意义远远超过阿波罗(Apollo)登月计划和曼哈顿(Manhatton)原子弹计划口HGP的正式启动也就标志着解码生命的真正开始也就很自然地成为人们关注的焦点。 历史的回顾 对人类基因组的研究在70年代已具有一定的雏形,在80年代在许多国家已形成一定规模,并在以下的几个事件的影响下形成了投资额最多、最具规模的美国人类基因组计划。 1984年在Utah州的Aita,White R和MendelSOIlhn M受美国能源部(DOE)的委托主持召开了一个小型专业会议讨论测定人类整个基因组的DNA序列的意义和前景(Cook-y明n则,1989)。1985年5月在加州antaCruz由美国能说部的SindeimerRL主持的议上提出了测定人类基因组全序列的动议,由此形成了美国能源部的“人类基因组计划”草案。1986年3月,在新墨西哥州的Santa Fe 讨论了这一计划的可行性,随后美国能源部宣布实施这一草案。1986年著名遗传学家McK1Mick V 提出从整个基因组的层次研究遗传的科学称“基因组学"。1986年3月7日,诺贝尔奖获得者Dulbecco R在Science杂志上发表的一篇有关开展人类基因组计划的短文。1986年6月在美国冷泉港,另两位诺贝尔奖获得者GIbedW及Berg P主持了有关“人类基因组计划”的专家会议。1987年初,美国能源部与国家健康研究院(NIH)为“人类基因组计划"下拨了启动经费约550万美元(1987年全年1.66亿美元),并开始筹建人类基因组计划实验室。1988年2月,国家科学研究委员会(NRC)的专家撰写了“人类基因组的作图与测序(mapping andsequencing the human genome)”的报告,全面地介绍了有关这项史无前例的、看起来似“胆大妄为',计划的内容(Nati?ml Research Council,1988)。同年,美国成立了“国家人类基因组研究中心",由因提出DNA 分子双螺旋模型的贡献而获诺贝尔奖的沃森(Watson J)出任第一任主任。 Duibeeco短文的功绩 Dulbecco R于1986年在Science杂志上发表的题为“癌症研究的转折点——人类基因组的全序列分析”的短文,回顾了70年代以来癌症研究的进展,使人们认识到包括癌症在内的人类疾病的发
人类基因组计划(Human Genome Project)
人类基因组计划 （Human Genome Project,HGP） 1．什么是人类基因组计划： 人类基因组计划是由美国能源部和NIH联合做出的，自1990年开始，争取在15年内完成的目标。 即：鉴定人体DNA估计约8万个基因，测序构成人DNA的30亿个碱基，贮存这些信息于databases(数据库)并发展data analysis的工具。 （1）实际包括两部分工作，一是mapping，一是sequencing，故先前叫做“Mapping and Sequencing the human genome”.而Mapping又分为遗传连锁图谱和物理图谱。（2）HGP是第一个庞大的科学事业，会引起一些由此计划暴发出来的伦理、法律、社会学上的诸多争论。（DOE熟悉大科学模式；生物学家习惯小科学模式，应完美结合。 该计划会引发出许多商业和法律，社会学和论理学方面的问题。） （3）为了有助于这些目标的实现，还要研究一些非人生物体的遗传图谱。（包括E.coli、酵母、秀丽隐杆线虫、果蝇、实验用小鼠等模式生物。） （4）在植物方面，美国农业部集中研究玉米和南芥菜（Arabidopsis）基因组，我国科学家提出了水稻基因组计划。 2．背景： 早在1984年Utah州Alta城的专业会议（DOE环境与健康研究办公室，OHER 和国际环境诱变剂和致癌物防护委员会，ICPEMC协办）。开始讨论HG DNA全序列测定的前景。 1985年5月由Sinsheimer组织专门会议提出测定HG全序的动议。 DOE为何操办：（1）DOE承担低水平辐射和其它环境因素引起的遗传性损伤的监测，即需要在108bp的DNA中检测出一个碱基的改变，此项任务与HG全序列测定有关并且
(一)细菌基因组DNA的提取
（一）细菌基因组DNA的提取 1.试剂 1）CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80mL H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100mL。2）其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶K (20mg/mL或粉剂)，5mol/L NaCl。 2.操作步骤： 1）100mL 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 2）加9.5mL TE悬浮沉淀, 并加0.5 mL 10% SDS, 50 μL 20mg/mL(或1mg干粉)蛋白酶K, 混匀, 37℃保温1小时。 3）加1.5mL 5mol/L NaCl, 混匀。 4）加1.5mL CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。 5）用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。6）用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7）加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。 8）用玻棒捞出DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1mL TE, -20℃保存。如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心, 使DNA沉淀。 （二）细胞基因组DNA的提取 Each sample + TNES buffer 500 μL +proteinase K 25 μL → 55 °C, 750 rpm, 2hr →+150 μL 6M NaCl, vortex → spin 5 min, Max, romm temperature (RT) →isolate supernatant + 600 μL cold ethanol (95%), vortex → spin 5 min, Max, RT→ precipitation + 75% ethanol, RT, Vortex → spin 5 min, Max, RT →precipitation+50 μL TE buffer (10× stock solution), keep in 4 °C. （三）Chelex法抽提DNA 1.用无菌棉签取双侧颊粘膜拭子，室温下自然干燥过夜，在无菌容器中保存。 2.取1.5mL试管，加双蒸去离子水1mL，将对应的颊粘膜棉签拭子插入试管内，浸泡20 分钟,其间用力搅动棉签，再将棉签用眼科镊挤干取出 3.12000rpm离心5分钟，弃上清 4.加5% chelex-100 200μL、蛋白酶K 5μL，置50℃水浴中30分钟，再置沸水浴中10分钟， 灭活蛋白酶K，冰浴3分钟，使DNA复性 5.取出后12000rpm离心5分钟，取上清液移至另一管中，-20℃保存备用
论人类基因组计划的现状与未来
论人类基因组计划的内容、现状与未来 摘要：近年来人类基因组计划广泛的引起了人们的关注，我们大学生对这个计划的了解去还是有限的，我们应该了解它的内容、进程、未来，这样才能对我们未来生物基因学的发展产生良好的推进作用。本文通过浅显易懂的语言向大家简述人类基因组计划的内容、现状及未来。 关键词：人类基因组计划；内容；现状；未来 人类基因组计划是人类历史上的一次伟大的壮举。自1990年10月1号美国国会批准美国人类基因组计划正式启动以来，意大利、英国、法国、德国等国也陆陆续续的加入这一次史无前例的科学研究之中。1999你那我国也开始在研究人类基因组计划中占得一席之地——我们得到完成人类3号染色体短臂上一个约为30Mb区域的测序任务。虽然这项任务仅占整个计划的1％，但我国仍然是参与这个计划的唯一一个发展中国家。那么，我们的人类基因组计划究竟是有着怎样的意义和作用？研究它对人类的发展将会做出怎样的贡献呢？人类基因组计划其实是与我们的生活息息相关的，未来的它会对基因组学、社会、 法律、伦理研究、生物信息学和计算生物学，甚至教育培训等方面产生重大影响[A]。对于 传统的农业和食品部门来说也是极其重要的，比如我们食品学院的学生以后就可能学习通过大规模生产和加工基因食品的方式生物技术和制药合并。我们所接触到的领域将不仅仅是简单的从化学的角度去分析食品的安全与营养，而是以基因的角度从人体发展与生长的根源去对食品进行研究和改造，以达到把不可预见性降到最低从，根源解决病从口入的问题。由此看来，人类基因组计划的力量是不可低估的。 1 人类基因组计划的内容 HGP(人类基因组计划)的主要任务其实就是人类的DNA测序，绘制人类基因图谱。这其中就包括了多种多样的测序图谱，其顺序为遗传图谱、物理图谱、序列图谱、基因图谱。其中遗传图谱与物理图谱是整个测序工作中最为重要的两个部分。下面我就重点来介绍一下这两个部分。 1.1 遗传图谱 遗传图谱以是具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。[A]通过6000多个遗传标记把人类的基因组分成6000多个区域，这样一来就为我们遗传图谱的绘制创造了条件，提高了测序的效率。通过定向的把遗传基因（例如致病基因分成）进行定向与分类研究，能够有目的的，有效的找出致病基因，定向的从根源的解决该类疾病。 1.2 物理图谱 对于物理图谱而言，我们要通过对工程基因组的DNA链上的定位将DNA链上的分子进行测定，进而绘制出物理图谱。通过限制性内切酶水解出一段DNA链，再把其有关基因的遗传信息系统化的排列出来绘成图谱。由于DNA的物理图谱是DNA分子结构的特征之一，所以找出能够切出特定的DNA分子链的限制性核算内切酶也是一个关键。绘制物理图谱的同时也要对DNA分子进行测序，这就使得物理图谱的绘制成了测序工作中的第一部，也是最为重要的一部。完成了这一步，测序工作的大部分工作就完成了。