日本结缕草胚性愈伤诱导与植株再生_简报_

文章编号:1007-0435(2005)03-0257-03

日本结缕草胚性愈伤诱导与植株再生(简报)

齐春辉,梁小红,韩烈保

(北京林业大学草坪研究所,北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室,100083)

Embryogenic Callus Induction and Plant Regener ation of Zoysia J aponica

QI Chun-hui,LIANG Xiao-hong,HAN Lie-bao

(Institut e of T ur fgr ass Science Beijing F or estry Univer sity,T he Key Labora tor y for Silvicultur e and

Conservation of Minist ry of Education,Beijing F or estr y Universit y,Beijing 100083,China )

关键词:日本结缕草;胚性愈伤;植株再生

Key wor ds :Zo ysia j aponica ;Em br yogenic callus;P lant r egener ation 中图分类号:Q 943 文献标识码:A

日本结缕草(Zoysia japonica Steud.)作为低耗水量、抗性强、管理粗放的暖季型草坪草种越来越受到关注。但其绿期短、对褐斑病、刺线虫等病虫害抵抗力较弱。与冷季型草坪草相比,暖季型草坪草更难诱导胚性愈伤组织并再生植株[1]。虽然已有结缕草愈伤诱导植株再生的报道[2~4]

,但缺乏系统研究。本试验拟探讨多个可能影响日本结缕草组织培养的因素,建立其植株再生体系,为下一步的外源基因转化奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

日本结缕草:Zenith 、Qingdao 2个品种,分别由TMI (T ur f Merchants ,Inc )和北京市种子公司提供。1.2 方法

1.2.1 材料处理

成熟种子用次氯酸钠溶液(>5%活性氯,加入1~2滴吐温20),在磁力搅拌器上消毒1h,无菌水冲洗3~5次,4℃下浸泡若干天。

1.2.2 愈伤诱导与继代

种子用无菌滤纸吸干多余水分后接种于不同固体培养基上,黑暗状态下28℃诱导愈伤。每处理设3个重复。1个月后统计愈伤诱导率,继代培养基与愈伤诱导培养基相同,2个月后统计胚性愈伤率。愈伤每月继

代1次。各培养基以MS 基本培养基为基础,蔗糖3%,琼脂7%,pH 值5.8,121℃高压灭菌15min 。

1.2.3 愈伤组织的分化与植株再生

挑选淡黄或白色、结构致密、颗粒状的胚性愈伤组

织(0.5mm)转入不同再生培养基培养,光照强度

2000~3000Lux,光照周期12h,温度25~28℃,1个月后统计植株再生率。待小植株形成后,转入1/2MS 培养基上壮苗。根系强壮后,打开瓶盖炼苗3d,再以自来水小心洗去根部琼脂,移栽入由砂(0.25~0.5mm )与草炭土混合物基质中,混合比例为9∶1。1.3 数据统计

愈伤诱导率=形成愈伤种子数/接种种子数×100%胚性愈伤率=胚性愈伤数/接种愈伤数×100%植株再生率=再生植株愈伤数/接种愈伤数×100%

2 结果与分析

2.1 预处理对成熟种子愈伤诱导率的影响

除品种Qingdao 未去皮种子需浸泡14d 以上外,其余种子消毒后在4℃下浸泡2~3d 提高愈伤诱导率。品种Zenith 去皮种子处理后愈伤诱导率最高达74.

67%,未去皮的则为66.5%;Qingdao 4℃浸泡3d 愈伤诱导率达45.5%,未去皮的浸泡14d 后为30.50%。未去皮与去皮的愈伤诱导率有差异;而浸泡时间过长也

收稿日期:2004-09-07;修回日期:2004-11-24

基金项目:国家高技术发展计划(863计划)项目(2001AA244082)

作者简介:齐春辉(1977-),女,博士研究生,主要从事草坪生物技术研究;*通讯作者Author for cor resp on dence ,E -m ail :han lb @https://www.360docs.net/doc/3e17488887.html,

第13卷 第3期 

Vol .13 No .3草 地 学 报

ACT A AGRESTIA SINICA

2005年 9月

 Sept . 2005

会降低种子活力,从而影响愈伤诱导率(图1)

。图1 4℃浸泡处理对成熟种子愈伤诱导率的影呼Fig.1 Effect of 4℃imbibing on seed callus indnclion r ate

2.2 基因型对愈伤诱导的影响

Qingdao 和Zenith 的种子经同样处理后接种于

MS+2,4-D 5mg/L 培养基中。在愈伤诱导率与胚性愈伤率方面,Zenith 都明显好于Qingdao(表1)。2.3 2,4-D 对愈伤诱导的影响

2,4-D 在2mg /L 浓度下愈伤诱导率最高,‘Zenith ’为76.60%,‘Qingdao ’为45.97%,并随着2,

4-D 浓度的升高,愈伤诱导率下降。2,4-D 也影响愈伤

的状态,在2mg /L 浓度下愈伤易长出无成苗能力根状物,在8mg /L 浓度下愈伤则趋向于水渍状,在5mg /L

浓度下2个品种胚性愈伤率达到最高,分别为2.68%和1.12%(表2)。一旦愈伤形成,即第1次继代时将2,

4-D 浓度降至2mg /L 将有利于胚性愈伤的形成,而继

续维持在5mg/L 浓度时常出现愈伤含水量过大现象。

表1 基因型对愈伤诱导的影响

Table 1 Effect of genotype on callus induct ion

品种Cultivars 接种种子数No .of s eeds

愈伤数No .of callus

愈伤诱导率(%)Callus ind uction rate

胚性愈伤数

No .of embryogen ic callu s

胚性愈伤率(%)

Em bryogen ic callus in duction rate

Zenith 15011274.673 2.68Qingdao

199

89

44.68

1

1.12

表2 2,4-D 对愈伤诱导的影响T able 2 Effect of 2,4-D on callus induction

‘Zenith ’

2,4-D 浓度(mg/L)2,4-D concentration

258‘Qingdao ’

2,4-D 浓度(mg/L )2,4-D concentration

25

8接种种子数No.of seeds

201150160200199198愈伤数No .of callus

154112113928986愈伤诱导率(%)Callus in duction rate (%)76.6074.6770.6345.9744.6843.51胚性愈伤数No .of embr yog enic callus

432110胚性愈伤率(%)Embryogenic callus induction rate (%)

2.60

2.68

1.77

1.09

1.12

表3 KT 和6BA 对愈伤诱导的影响

Table 3 Effect of KT and 6BA on callus induction

品种Cultivar KT 浓度(mg/ml)Concentration 接种数No.of seed s 愈伤数No.of callu s 愈伤诱导率(%)Callus indu ction r ate 胚性愈伤数No.of emb ryogenic callus 胚性愈伤率(%)

Em bryogenic callus in duction rate

KT

Zenith

015011274.673 2.680.0120014572.502 1.380.0520015175.509 5.960.116011068.755 4.550.220014070.00128.570.519913366.505 3.7508944.681 1.12Qing-dao

0.0120010753.5010.930.0519410351.903 2.910.120011457.003 2.630.22008944.503 3.370.52009949.501 1.016BA

Zenith

015011274.673 2.680.0120014371.504 2.730.0520013467.00139.70.120012562.507 5.60.220012160.503 2.450.520012160.502 1.65Qing-dao

01998944.681 1.120.0120010251.0010.980.051948644.331 1.160.12009045.002 2.220.22008542.502 2.350.52009246.001 1.08

258

草 地 学 报

第13卷

2.4 细胞分裂素对愈伤诱导的影响

低浓度的细胞分裂素可提高胚性愈伤率(表3)。Zenith在附加0.2mg/L KT或0.05mg/L6-BA时胚性愈伤率最高,分别为8.57%和9.7%;Qingdao在0.2mg/LKT或0.2mg/L6-BA时胚性愈伤率最高,分别为3.37%和2.35%。但实验中也发现,随着KT 或6-BA浓度的提高,胚性愈伤率反而下降,而浓度过高(0.5mg/L)会导致愈伤褐化甚至死亡,6-BA在这方面的负作用比同等浓度KT明显。

2.5 CuSO4?5H2O对愈伤诱导的影响

CuSO4?5H2O可提高结缕草愈伤诱导率和胚性愈伤率(表4),‘Zenith’和‘Qingdao’在浓度为1.25 mg/L时愈伤诱导率和胚性愈伤率最高,‘Zenith’分别为79.25%和3.85%,‘Qingdao’分别为56.28%和3.57%。但当浓度达到5mg/L时易出现白色坚硬的愈伤组织,有时甚至有黑色斑块出现,影响愈伤质量。

2.6 不同培养基对植株再生的影响

选择胚性愈伤组织转接入不同再生培养基中,7d 后愈伤出现绿色芽点,并逐渐分化为小植株。各培养基中成苗率差异不大(表5),说明植株的再生是由愈伤状态决定。植株炼苗后移栽土壤中,成活率达87.5%。

表4 Cu2+浓度对愈伤诱导的影响

Table4 Effect of Cu2+concentr ation on ca llus induct ion

‘Zenith’

Cu2+浓度(mg/L)Cu2+concentration(m g/L) 0.025 1.25 2.55

‘Qingdao’

Cu2+浓度(mg/L)Cu2+concentration(m g/L) 0.025 1.25 2.55

接种种子数No.of seeds201164121160200199197160

愈伤数No.of callus154130851179211210270

愈伤诱导率(%)Callus in duction rate76.6079.2570.2573.1345.9756.2851.7843.75胚性愈伤数No.of E.C.45221431

胚性愈伤率(%)Rate of E.C. 2.60 3.85 2.35 1.71 1.09 3.57 2.94 1.42

表5 不同培养基对植株再生的影响

Table5 Effect of culture medium on plant regener ation

培养基Medium

‘Zenith’

接种愈伤数

No.of callus

成苗愈伤

No.of regenerat i ng callus

再生率(%)

Regenerat ion rate(%)

Qingdao

接种愈伤数

No.of callus

成苗愈伤

No.of regenerating callus

再生率(%)

Regeneration rat e(%)

MS1204940.831203730.83 1/2MS+KT0.2mg/L1205445.001204033.33 MS+BA0.2mg/L1205243.331203529.17 MS+BA0.1mg/L+

NA A0.05mg/L

1204638.331203327.5

3 讨 论

3.1 日本结缕草组培中首先遇到的是除去种子外皮障碍问题。研究中采用4℃浸泡方法,经重复实验证明是可行的。水分浸泡使种子外壳软化,不再阻碍发芽,从而提高愈伤诱导率。而经长时间浸泡,种子处于无氧呼吸状态,则影响种子活力,导致愈伤诱导率下降。3.2 日本结缕草品种间组培离体培养反应能力存在差异。在所有实验中,Zenith均好于Qingdao,说明基因型是一个决定因素,在遗传转化试验中,可通过选择表现好的基因型来提高转化效率。

3.3 激素的协同作用有利于草地早熟禾、多年生黑麦草愈伤组织质量的提高[5,6],日本结缕草组培也需要生长素与细胞分裂素的协同作用。铜离子有助于结缕草愈伤诱导率与胚性愈伤率的提高,但浓度高于5mg/L 则会产生不良影响。

3.4 胚性愈伤组织的挑选与继代是重要环节。每次继代时,仔细选择白色或黄色、颗粒状、结构致密而相互间松散的胚性愈伤组织继代,并注意去除含水量大的非胚性愈伤组织。试验观察到胚性愈伤组织的再生多为体细胞胚发生途径,与胚性愈伤的挑选有紧密联系。而再生培养基中1/2MS+KT0.2mg/L的选择符合体细胞胚的生长规律,有利于芽和根的同时发育。

参考文献

[1] 柴明良.草坪草转基因研究进展[J].科技通报,2002,18(1):

67-72

[2] Al Kharyi J M,Huang F H,Th om pson L F,Kin g J W.In vitro

plant r egeneration of Zoysiagras s(Z o y s ia jap onica Steud.)[J].

In Vitro.1987,23:3

[3] As ano Y.Somatic embryogenesis and protoplast culture in

Japan es e lawngrass(Zoysia japonica)[J].Plant Cell Reports,

1989,8(3):141-143

[4] 柴明良,胡叔良.结缕草试管增殖与筛选[J].植物生理学通讯,

1995,3:205

[5] 佘建明,张保龙,陈志一,倪万潮.草地早熟禾成熟胚离体培养

植株再生技术的研究[J].草地学报.2003,11(3):58-62

[6] 张万军,王 涛.多年生黑麦草组织培养与植株再生研究[J].草

地学报.2003,11(3):219-222

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第3期齐春辉等:日本结缕草胚性愈伤诱导与植株再生

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