出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法

出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法

出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法

食品商务网 2005-12-14 12:00:00.0

中华人民共和国进出口商品检验行业标准

SN 0169-92 代替 ZB X09 002一88

Method for examination of coliform, fecal coliform and escherichia coli in food for export

1 主题内容与适用范围

本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。

本标准适用于出口食品的检验。

2 设备和材料

2.1 吸管: 1mL,具0.1mL刻度;5mL和10mL,具1mL刻度。

2.2 水浴箱:44.5±0.5℃。

2.3 培养箱:36±1℃,44.5±0.5℃。

2.4 冰箱: 0~5℃和-15~-20℃。

2.5 均质器。

2.6 乳钵和研棒。

2.7 平皿:直径90mm。

2.8 天平:感量0.1g。

2.9 显微镜。

2.10 稀释瓶:100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。

2.11 玻璃珠:直径约5mm。

2.12 菌落计数器。

3 培养基及试剂

3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤。

3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。

3.3 EC 肉汤。

3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。

3.5 营养琼脂斜面。

3.6 色氨酸肉汤。

3.7 MR-VP培养基。

3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。

3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。

3.10 Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。

3.11 生理盐水。

3.12 革兰氏染色液。

3.13 Kovacs氏靛基质试剂。

3.14 甲基红指示剂。

3.15 Voges-pros kauer(V-P)试剂。

4 样品制备

4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。若不

能及时检验,应将冷冻样品置于-15℃保存;非冷冻而易腐的食品,应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2~5℃ 18h内解冻,或在45℃以下15min内解冻。

4.2 不同食品样品匀液的制备

4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠), 以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10的样品匀液。

4.2.2 固体和半固体食品

以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1~2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。

4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。

5 大肠菌群的测定

5.1 大肠菌群MPN值的测定

5.1.1 对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。

5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h。

5.1.3 观察试管的产气情况:检查倒管内是否有气泡产生,记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气,则可报告为大肠菌群阴性;如有产气者,则进一步作证实试验。

5.2 大肠菌群的证实试验

5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。

5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。

5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。

5.2.4 结果报告:按BGLB肉汤产气管数,查MPN表[见附录B (补充件)]报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。

6 粪大肠菌群测定

6.1 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。

6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。

6.3 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性;不产气管为粪大肠菌群试验阴性。

6.4 结果报告:按产气管数,查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。

7 大肠杆菌测定

7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h。

7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。

7.3 如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落;如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18~24h。

7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。

7.4.1 色氨酸肉汤:在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2~0.3mL,上层出现红

色为靛基质阳性反应。

7.4.2 MR-VP培养基:在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL至13mm×100mm 试管中,加5%α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40%氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。

将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。

7.4.3 Koser氏枸椽酸盐肉汤:于36±1℃培养96h记录有无生长。

7.4.4 LST肉汤:于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。

7.4.5 革兰氏染色:取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。

7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下:靛基质 MR VP 枸椽酸盐鉴定(型别)

++--典型大肠杆菌

-+--非典型大肠杆菌

++-+典型中间型

-+-+非典型中间型

--++典型产气肠杆菌

+-++非典型产气肠杆菌

如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做重复试验。

7.5 结果报告:大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为++--或-+--,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN 值。

8 大肠菌群固体培养基测定法

8.1 样品制备同第4章。

8.2 计数

8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液,每个稀释度接种两个灭菌平皿,每皿1mL。另取1mL稀释剂加入一个灭菌平皿中,作空白对照。

8.2.2 将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10~15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀。

8.2.3 待琼脂凝固后,再加3~4mL VRBA覆盖平板表层。

8.2.4 翻转平板,置于36±1℃培养18~24h。

8.2.5 选用有30~150个菌落的平板,计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。

8.2.6 证实

8.2.6.1 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,移种于BGLB肉汤管内, 36±1℃培养24h和48h,观察产气情况。

8.2.6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管,应进行革兰氏染色,以便排除革兰氏阳性杆菌。

8.2.7 结果报告

经最后证实为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌) 的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。

例:10**-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:

100×6/10×10**-4/g(mL)=6.0×10**5/g(mL)

附录 A

培养基和试剂 (补充件)

A1 月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤

胰蛋白(月示)或胰酪胨(Trypticase) 20g

氯化钠 5.0g

乳糖 5.0g

磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g

磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g

月桂基硫酸钠 0.1g

蒸馏水 1000.0mL

将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。

A2 煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤

蛋白胨 10.0g

乳糖 10.0g

牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液 200.0mL

0.1%煌绿水溶液 13.3mL

蒸馏水

将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中,pH7.0~7.5),用蒸馏水稀释到975mL,调pH7.4。再加入0.1%煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到20mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管)中,每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH7.2±0.1。

A3 EC肉汤

胰蛋白(月示)或胰酪(月示) 20.0g

3号胆盐或混合胆盐 1.5g

乳糖 5.0g

磷酸氢二钾(K2HPO4) 4.0g

磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5g

氯化钠 5.0g

蒸馏水 1000.0mL

将以上成分溶解于蒸馏水中,分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管),每管8mL。121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.1。

A4 伊红美蓝琼脂(EMB)

蛋白胨 10.0g

乳糖 10.0g

磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.0g

琼脂 15.0g

伊红γ(水溶性) 0.4g或2%水溶液20mL

美蓝 0.065g或0.5%水溶液13mL

蒸馏水 1000.0mL

在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂,加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶100mL或200mL,高压灭菌15min。最终pH7.1±0.2。使用前将琼脂融化,于每100mL 琼脂中加5mL灭菌的20%乳糖水溶液、2mL的2%伊红γ水溶液和1.3mL0.5%的美蓝水溶液,摇匀,冷至45~50℃倾注平皿。

A5 营养琼脂斜面

牛肉膏 3.0g

蛋白胨 5.0g

琼脂 15.0g

蒸馏水 1000.0mL

将各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解。分装合适的试管。121℃高压灭菌15min。最终pH7.3±0.1。灭菌后摆成斜面备用。

A5 色氨酸肉汤

胰胨或胰酪胨 10.0g

蒸馏水 1000.0mL

加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管,每管5mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.9±0.2。

A7 MR-VP培养基

(月示)胨 7.0g

葡萄糖 5.0g

磷酸氢二钾(K2HPO4) 5.0g

蒸馏水 1000.0mL

将各成分溶于蒸馏水中,分装试管,121℃高压灭菌15min,最终pH6.9±0.2。

A8 Koser氏枸椽酸盐肉汤

磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 1.5g

磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g

硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2g

枸椽酸钠(含2H2O) 3.0g

蒸馏水 1000.0mL

将各成分溶解于蒸馏水中,分装试管,每管10 mL,121℃高压灭菌15min。最终pH6.7±0.2。

A9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)

蛋白胨 7.0g

酵母膏 3.0g

乳糖 10.0g

氯化钠 5.0g

胆盐或3号胆盐 1.5g

中性红 0.03g

结晶紫 0.002g

琼脂 15~18g

蒸馏水 1000.0mL

将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调至pH7.4±0.1。煮沸2min,将培养基冷至45~50℃倾注平板。临用时制备,不得超过3h。

A10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液

贮存液磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g

蒸馏水 500mL

将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中,用1 mol/L氢氧化钠约175 mL调至pH7.2。用蒸馏水加至1000mL贮存于冰箱。

稀释液取贮存液1.25mL,

用蒸馏水稀释至1000mL,分装于合适容器后,121℃高压灭菌15min。

A11 生理盐水

氯化钠 8.5g

蒸馏水 1000.0mL

将氯化钠溶于蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。

A12 革兰氏染色液

结晶紫染色液:

结晶紫 1.0g

95%乙醇 20.0mL

1%草酸铵水溶液 80.0mL

将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。

革兰氏碘液:

碘 1.0g

碘化钾 2.0g

蒸馏水 300.0mL

将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。沙黄复染液:

沙黄 0.25g

95%乙醇 10.0mL

蒸馏水 90.0mL

将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。

染色法

a. 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1min,水洗。

b. 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。

c. 滴加95%乙醇脱色约15~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。

d. 滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。结果:革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。

A13 Kovacs氏靛基质试剂

对二甲氨基苯甲醛 5.0g

戊醇 75.0mL 盐酸(浓) 25.0mL

将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后慢慢加入浓盐酸即可。

A14 甲基红指示剂

甲基红 0.1g

95%乙醇 300mL

将甲基红溶解于300mL乙醇中,加水稀释至500mL。

A15 Voges-Pros kauer(V-P)试剂

甲液

α-萘酚 5.0g

无水乙醇 100.0mL 乙液

氢氧化钾 40.0g 用蒸馏水加至 100.0mL

附录 B

1g检样中最近似值(MPN)表

(补充件) 使用三管法,接种量分别为0.1,0.01和0.001g。阳性管数阳性管数 0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001

0 0 0 <3 2 0 0 9.1

0 0 1 3 2 0 1 14

0 0 2 6 2 0 2 20

0 0 3 9 2 0 3 26

0 1 0 3 2 1 0 15

0 1 1 6.1 2 1 1 20

0 1 2 9.2 2 1 2 27

0 2 3 12 2 1 3 34

0 2 0 6.2 2 2 0 21

0 2 1 9.3 2 2 1 28

0 2 2 12 2 2 2 35

0 2 3 16 2 2 3 42

0 3 0 9.4 2 3 0 29

0 3 1 13 2 3 1 36

0 3 2 16 2 3 2 44

0 3 3 19 2 3 3 53

1 0 0 3.6 3 0 0 23

1 0 1 7.

2

3 3 1 39

1 0

2 11

3 0 2 64

1 0 3 15 3 0 3 95

1 1 0 73 3 1 0 43

1 1 1 11 3 1 1 75

1 1

2 15

3 1 2 120

1 1 3 19 3 1 3 160

1 2 0 11 3 2 0 93

1 2 1 15 3 2 1 150

1 2 2 20 3 2 2 210

1 2 3 24 3 2 3 290

1 3 0 16 3 3 0 240

1 3 1 20 3 3 1 460

1 3

2 24

3 3 2 1100

1 3 3 29 3 3 3 >1100

注: ①本表采用3个稀释度 [0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)],每个稀释度接种3管。

②表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时,则表内数字应相应增加10倍,其余类推。

实验一 食品中大肠菌群的测定

大肠菌群(M.R.N.)的测定 一、实验目的: (1)了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义 (2)学习并掌握大肠菌群的检验原理和方法,以判别食品的卫生质量 二、实验原理: 大肠菌群系指一群能在37℃经24h能发酵乳糖,产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染,同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 食品中大肠菌群数系以每100g(或ml)检样内大肠菌群最近似数(the most p robable number-简称MPN)表示。最近似数(most probable number-简称MPN)法是一种将样品“多次(管)稀释至无菌”的计数方法。将3个稀释梯度的检样稀释液接种于9支或15支试管培养基中,每个稀释度接种3支或5支。经培养后,根据结果查阅MPN检索表,就可得到原样品中微生物的估计数量。MPN测定方法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数。 三、材料 1、样品 乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 2、菌种 大肠埃希氏菌(Escherichia coli) 产气肠杆菌(Enterobacteria aerogenes) 3、培养基及试剂 单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂(EMB)、

革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯(MA) 4、其它设备和材料 温箱(36土1)℃、水浴锅(44土0.5)℃、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。 四、实验步骤 (一)检验程序 大肠菌群检验程序见图 (二)操作步骤 1.采样及稀释(具体材料) ①以无菌操作鲜橙多饮料(具体根据实验室提供的确定)25g(或25mL)放于含有225mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器,以8000r/mjn—10000r/min的速度处理1min,做成1:10的稀释液。

大肠菌群测定方法

大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名,而是卫生细菌领域的用语,它不代表某一个或某一属细菌,而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌,这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致,其定义为:需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广,在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明,大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方,人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主,而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的,主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低,表明了粪便污染的程度,也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物,其中有健康人粪便,也有肠道患者或带菌者的粪便,所以粪便内除一般正常细菌外,同时也会有一些肠道致病菌存在(如沙门氏菌、志贺氏菌等),因而食品中有粪便污染,则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性,潜伏着食物中毒和流行病的威胁,必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一,目前已被国内外广泛应用于食品卫生工

作中。 二、大肠菌群检验方法:由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌,即:需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 (一)国家标准:国家标准采用三步法,即:乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验:样品稀释后,选择三个稀释度,每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h,观察是否产气。分离培养:将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上,36±1℃培养18-24h,观察菌落形态。证实试验:挑取平板上的可疑菌落,进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h,观察产气情况。报告:根据证实为大肠杆菌阳性的管数,查MPN表,报告每100ml(g)大肠菌群的MPN值。 具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》 (二)原国家商检局制订的行业标准,等效采用美国FDA的标准方法,用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法:推测试验:样品稀释后,选择三个稀释度,每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h,观察是否产气。证

10食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程

食品中大肠菌群计数测定的标准操作规 程 1目的 规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。 2范围 本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms )计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 3术语和定义 大肠菌群coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 最可能数most probable number ,MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 4责任 质量部组织制订、化验室负责实施。 5内容 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: 恒温培养箱:36 C± 1 Eo 冰箱:2 E?5 Eo 恒温水浴箱:46 E± 1 Eo 天平:感量g o 均质器。 振荡器。 无菌吸管:1 mL (具mL刻度)、10 mL (具mL刻度)或微量移液器及吸头。 无菌锥形瓶:容量500 mLo

无菌培养皿:直径90 mm

pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 菌落计数器。 培养基和试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(Lauryl Sulfate Tryptose , LST )肉汤:见附录A 中。 煌绿乳糖胆盐( Brilliant Green Lactose Bile 结晶紫中性红胆盐琼脂( Violet Red Bile Agar 磷酸盐缓冲液:见附录 A 中。 无菌生理盐水:见附录 A 中。 无菌1 mol/L NaOH :见附录A 中。 无菌1 mol/L HCl :见附录 A 中。 大肠菌群MPN 计数法 检验程序 大肠菌群MP 计数的检验程序见图1。 图1大肠菌群MPN 计数法检验程序 操作步骤 样品的稀释 固体和半固体样品:称取 25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌均质杯内,8000 r/min ?10000 r/min 均质1 min ?2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min ?2 min ,制成1:10的样品匀液。 液体样品:以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成 1:10 的 样品匀液。 样品匀液的pH 值应在? 之间,必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调 节。 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL ,沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液 面),振摇试管或换用 1 支1 mL 无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成 1:100 ,BGLB 肉汤:见附录A 中。 ,VRBA :见附录A 中。

SN出口食品中大肠菌群粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法

SN0169-92代替ZBX09002一88 Methodforexaminationofcoliform,fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexport 1、主题内容与适用范围 本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。 本标准适用于出口食品的检验。 2、设备和材料 2.1 吸管:1mL,具0.1mL刻度;5mL和10mL,具1mL刻度。 2.2 水浴箱:44.5±0.5℃。 2.3 培养箱:36±1℃,44.5±0.5℃。 2.4 冰箱:0~5℃和-15~-20℃。 2.5 均质器。 2.6 乳钵和研棒。 2.7 平皿:直径90mm。 2.8 天平:感量0.1g。 2.9 显微镜。 2.10稀释瓶:100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。 2.11玻璃珠:直径约5mm。 2.12菌落计数器。 3、培养基及试剂 3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(胨)(LST)肉汤。 3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。 3.3EC肉汤。 3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。 3.5 营养琼脂斜面。

3.6 色氨酸肉汤。 3.7MR-VP培养基。 3.8Korser氏枸椽酸盐肉汤。 3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。 3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。 3.11生理盐水。 3.12革兰氏染色液。 3.13Kovacs氏靛基质试剂。 3.14甲基红指示剂。 3.15Voges-proskauer(V-P)试剂。 4、样品制备 4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验,应将冷冻样品置于-15℃保存;非冷冻而易腐的食品,应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2~5℃18h内解冻,或在45℃以下15min内解冻。 4.2 不同食品样品匀液的制备 4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠),以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇),制成1:10的样品匀液。 4.2.2 固体和半固体食品 以无菌操作取25g样品,放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1~2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。 4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10-2、10-3、10-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。 5、大肠菌群的测定 5.1 大肠菌群MPN值的测定 5.1.1 对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。 5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h。

总大肠菌群数量测定

总大肠菌群 在饮用水的微生物安全监测中,普遍采用正常的肠道细菌作为粪便污染指标,而不是直接测定肠道致病菌。 总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的,在37℃生长时能使乳糖发酵,在24h内产酸产气的革氏阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。 一多管发酵法 1应用范围 1.1本法适用于饮用水、水源水,特别是浑浊度含量高的水质中总大肠菌群的测定。 1.2水样中总大肠菌群数的含量,表明水被粪便污染程度,而且间接地表明有肠道致病菌存在。 2原理 根据总大肠菌群应具有的生物特性, 产气,能在选择性培养基上产生典型菌落。 3仪器 3.1显微镜 3.2革兰氏染色用有关器材。 3.3高压蒸汽灭菌器。 3.4干热灭菌箱。 3.5恒温箱。

3.6冰箱。 3.7放大镜。 3.8试管、平皿(直径 4培养基 4.1乳糖蛋白胨培养液 4.1.1成分 蛋白胨10g 牛肉膏3g 乳糖5g 氯化钠5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 蒸馏水1000ml 4.1.2制法 将蛋白胨、牛肉膏、 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液, 灭菌20min,贮存于冷暗处备用。 4.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。4.3品红亚硫酸钠培养基(供多管发酵法用)4.3.1成分 蛋白胨10g

乳糖10g 磷酸氢二钾3.5g 琼脂15~30g 蒸馏水1000ml 无水亚硫酸钠5g左右 5%碱性品红乙醇溶液 4.3.2储备培养基的制备如革兰氏阴性无芽胞杆菌, 9cm)、刻度吸管等,置于干热灭菌箱中 1ml 1000ml蒸馏水中加热溶解, 充分混匀,分装于装有倒管的试管中,在37℃24h内能发酵乳糖并产酸160℃灭菌2h 调整pH为7.2~7.4,再加入1ml置高压蒸汽灭菌器中,以115℃乳糖及氯化钠置于 20ml 先将琼脂加至900蒸馏水中,加热溶解,然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨,混匀使之溶解,再以蒸馏水补足至1000ml,调整PH值为7.2~7.4,趁热用脱脂棉或绒布过滤,再加入乳糖,混匀后定量分装于烧瓶内,置高压蒸汽灭菌中以115℃灭菌20min,贮存于冷暗处备用。 4.3.3平皿培养基的配制 将上法制备的储备培养基加热融化,根据烧瓶内培养基的容量,用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液,置于灭菌空试管中。再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内,加灭菌水少许使其溶解后,置于沸水浴中煮沸10min以灭菌。

食品中大肠菌群的测定附mpn检索表)

实验六食品中大肠菌群的测定一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分,大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖,产酸、产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成,即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属,其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表

注:+,表示阳性;—,表示阴性;+/-,表示多数阳性,少数阴性。 由上表可以看出,大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是,对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”,通常称为典型大肠杆菌;而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年,沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见,因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后,塞乌博耳德“斯密斯(Theobold.Smith)氏指出,大肠杆菌因普遍存在于肠道内,若在肠道以外的环境中发现,就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的;从此,就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现,成人粪便中的大肠菌群的含量为:108个/g一109个/g。若水中或食品中发现有大肠菌群,即可证实已被粪便污染,有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由,就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时,也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然,有粪便污染,不一定就有肠道病原菌存在,但即使无病原菌,只要被粪便污染的水或食品,也是不卫生的,不受人喜欢的。 2.粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性,才能起到比较正确

大肠菌群检测方法

大肠菌群检测方法 进入无菌室步骤 1.进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌,时间为0。5—1小时。 2.关灯后0?5小时后放可进入。 3.进入更衣间更换衣服,佩带口罩、帽子、鞋套 实验步骤 1,进入无菌室后,先把酒精灯点燃,然后在用酒精棉进行手部消毒。(酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成) 2,准备双料管3根,单料管6根,培养皿7个。 3,直接从原液中吸取10ml放入双料管,(3根每根各10ml) 4,再吸取原液1ml放入单料管中(3根每根各1ml) 5,再吸取原液1ml放入培养皿中(2个培养皿各1ml) 6,再吸取原液1ml放入盐水管中制成-1梯度的样液 7,更换一根吸管,从-1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中(3根每根各1ml) 8,再吸取-1梯度样液1ml放入培养皿中(2个培养皿各1ml) 9,再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允(注另作3个培养皿:空气空白,把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白,把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白,吸1ml生理盐水放入培养皿中,倒入营养琼脂平铺底部摇匀。) 10,把全部作好的放入培养箱中,温度36C+-1×C,大肠24H+-2H,菌落48H+-2H,(待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中) 11,梯度:-1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成 -2梯度为1ml-1梯度样液加入9ml生理盐水配成 -3梯度-4梯度配制方法和-1、-2梯度的配制方法一样 12,如果大肠初发酵产生气泡,用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C,24H+-2H 。(接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面) 13,取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌,放入乳糖复发酵管中,然后再培养36C+-1C,24H++-2H。 14,再在伊红美兰平板之字形上挑菌,放到载玻片上作镜检。(方法见标准) 15,只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下,才能断定这根管是不合格。16,清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌,121C,0。5小时同时不能放气。

出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法

出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法 食品商务网 2005-12-14 12:00:00.0 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 SN 0169-92 代替 ZB X09 002一88 Method for examination of coliform, fecal coliform and escherichia coli in food for export 1 主题内容与适用范围 本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。 本标准适用于出口食品的检验。 2 设备和材料 2.1 吸管: 1mL,具0.1mL刻度;5mL和10mL,具1mL刻度。 2.2 水浴箱:44.5±0.5℃。 2.3 培养箱:36±1℃,44.5±0.5℃。 2.4 冰箱: 0~5℃和-15~-20℃。 2.5 均质器。 2.6 乳钵和研棒。 2.7 平皿:直径90mm。 2.8 天平:感量0.1g。 2.9 显微镜。 2.10 稀释瓶:100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。 2.11 玻璃珠:直径约5mm。 2.12 菌落计数器。 3 培养基及试剂 3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤。 3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。 3.3 EC 肉汤。 3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。 3.5 营养琼脂斜面。 3.6 色氨酸肉汤。 3.7 MR-VP培养基。 3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。 3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。 3.10 Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。 3.11 生理盐水。 3.12 革兰氏染色液。 3.13 Kovacs氏靛基质试剂。 3.14 甲基红指示剂。 3.15 Voges-pros kauer(V-P)试剂。 4 样品制备 4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。若不

食品中大肠菌群的测定(附MPN检索表)

实验六食品中大肠菌群的测定 一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分,大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖,产酸、产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成,即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属,其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表 由上表可以看出,大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是,对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”,通常称为典型大肠杆菌;而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年,沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见,因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后,塞乌博耳德“斯密斯(Theobold.Smith)氏指出,大肠杆菌因普遍存在于肠道内,若在肠道以外的环境中发现,就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的;从此,就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现,成人粪便中的大肠菌群的含量为:108个/g一109个/g。若水中或食品中发现有大肠菌群,即可证实已被粪便污染,有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由,就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定

食品的卫生质量而进行检验时,也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然,有粪便污染,不一定就有肠道病原菌存在,但即使无病原菌,只要被粪便污染的水或食品,也是不卫生的,不受人喜欢的。 2.粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性,才能起到比较正确的指标作用。 ①存在于肠道内持有的细菌,才能显示出指标的特异性。 ⑧在肠道内占有极高的数量,即使被高度稀释后,也能被检出。 ⑧在肠道以外的环境中,其抵抗力大于肠道致病菌或相似,进入水中不再繁殖。 ④检验方法简便,易于检出和计数。 在食品卫生微生物检验中,可作为粪便污染指标菌依据的上述条件,粪便中数量最多的是大肠菌群,而且大肠菌群随粪便排出体外后,其存活时间与肠道主要致病菌大致相似,在检验方法上,也以大肠菌群的检验计数简便易行。因此,我国选用大肠菌群作为粪便污染指标菌是比较适宜的。 另外,作为粪便污染的指标细菌还有:分叉杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、乳酸菌、肠杆菌科中的梭状芽胞和底群链球菌等,据报道,拟杆菌是人体肠道内第二个较大的菌群;厌气性乳酸菌占人体肠道内细菌组分的50%以上,一般粪便中该菌量为109个/g —1010个/g。肠道内属于肠杆菌科的细菌,除上述的细菌外,还有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌和副大肠杆菌等,也可以充当粪便污染指标菌。很多研究者认为,在冷踪食品或冷冻状态照射处理过的食品中,大肠杆菌可比其他多种病原菌容易死亡,因此,像这类食品,用大肠菌群作为指标菌就不够理想,而底群链球菌对低温抵抗力强,作为这类食品的粪便污染指标菌就比较适宜。上述的这些肠道内的其他细菌,虽与粪便有关,因均比不上大肠菌群所具备的指标特异性,所以目前还没有列入作为公认的粪便污染的指标细菌。 当然,大肠菌群作为粪便污染指标菌也有一些不足之处: ①饮用水中含有较少量大肠菌群的情况下,有时仍能引起肠道传染病的流行。 ⑧大肠菌群在一定条件下能在水中生长繁殖。 ②在外界环境中,有的沙门氏菌比大肠菌群更有耐受力。 3.大肠菌群作为粪便污染指标菌的意义 粪便污染的食品,往往是肠道传染病发生的主要原因,因此检查食品中有无肠道菌,这对控制肠道传染病的发生和流行,具有十分重要的意义。 许多研究者的调查证明,人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主

大肠菌群测定的操作细则(DOC)

大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱:36±1℃。 1.2 冰箱:0~4℃。 1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。 1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。 1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3 操作步骤 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL 灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。

食品中大肠菌群检测方法的比较

食品中大肠菌群检测方法的比较 【摘要】随着近年来食品安全问题的突出,作为食品检测的重要检测对象,食品中大肠杆菌群检测也变得越来越重要。目前检测大肠杆菌群的方法随着技术进步也越来越多。本文比较了三中检测大肠杆菌群的方法,即发酵法、平板计数法、测试片法三种大肠杆菌群的检测方法,分析其优缺点,以便对大肠杆菌群的不同检测方法形成比较全面系统的认识,对以后的食品检测中检测大肠杆菌群有所帮助。 【关键词】大肠杆菌群;检测方法;比较 食品安全与人们的健康紧密相关,食品检测已经成为反映食品加工、运输、贮存等各个环节卫生和侵权状况的重要手段。大肠杆菌群作为食品、饮用水以及其他公共卫生的重点检验对象,其检测方法的有效性将大大提高食品检测的效率。随着近年来科学技术的进步,大肠杆菌群的检测方法也不断发展,各国建立了大肠杆菌群的标准检测方法和快速检测方法。但是不同方法其检测原理和检测手段的不同,都会影响检测的灵敏度、准确性和快速性。为此在本文中,我们比较了发酵法、平板计数法、测试片法三种大肠杆菌群的检测方法,分析其优缺点,以便对大肠杆菌群的不同检测方法形成比较全面系统的认识,对以后的食品检测中检测大肠杆菌群有所帮助。 1.发酵法 发酵法是检测食品中大肠杆菌群的一种比较传统的方法,这种技术已经得到世界各国的普遍认可。最具有代表性的是美国环保局(EPA)和法国标准化联合会(FSA)分别早在20世纪90年代就已批准在本国实施该技术,并为此制定了相应的判别标准[1]。 目前发酵法检测食品中大肠杆菌群主要采用的是国标GB4789.3-2010大肠菌群测定,是用月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)配置的肉汤管放在温度为(36±1)摄氏度的恒温培养箱中培养(24±2)小时,先观察倒管内是否有气泡产生,然后(24±2)小时后进行产气复发酵试验,如果未产气则需要继续培养(48±2)小时,产气者进行复发酵试验。在复发酵试验中,用接种环从产气的LST肉汤管中各取取培养物1环,移到含有煌绿乳糖胆盐(BGLB)的肉汤管中,放在(36±1)℃恒温培养箱中培养(48±2)h,观察产气的情况。产气的就计为大肠菌群阳性管。由于该方法操作繁锁,耗费较大的物力财力人力,所以不太适应大量检测工作的需求[2]。 2.平板计数法 大肠杆菌平板计数法检测分为两个阶段。在初培养中,选取2~3 个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿接种1mL。同时取1mL生理盐水加入另外的无菌平皿作阴性对照。迅速将15mL~20mL冷却至46℃的结晶

水中大肠菌群的测定上课讲义

水中大肠菌群的测定

水中大肠菌群的测定 报告题目水中大肠菌群的测定作者姓名 班级生科1104班 指导教师 完成时间2013年6月 生物学实验教学中心

目录 引言 (2) 1 实验材料 (2) 2 实验步骤 (2) 2.1 (3) 2.2 (4) 2.3 (4) 2.4 (5) 2.5数据分析与结果处理 ...................................... 错误!未定义书签。 3 结果与分析 (5) 3.1图片.................................................................. 错误!未定义书签。 3.2........................................................................... 错误!未定义书签。总结 .. (6) 参考文献 (10)

水中大肠菌群的测定 (指导老师:) (湖北师范学院生命科学学院生物技术1104班湖北黄石 435002) 摘要:测定青山湖水中的大肠菌群的含量。将待测水分别稀释10倍、100倍、1000倍3种梯度在三倍浓缩培养基 37℃培养24h后挑选出产酸或产气的 菌画线接种到伊红美蓝平板中37℃培养24h,将培养基中表现为阳性的菌 落做革兰氏染色镜检为阴性的菌种接种到乳糖蛋白胨培养基中37℃培养 24h,挑选大肠杆菌阳性菌。结果稀释10倍的水有3管大肠杆菌阳性菌, 稀释100倍的水有3管,稀释1000倍的有2管,即青山湖水中大肠杆菌 的含量为MPN=11000. 关键词:大肠杆菌、多管发酵法青山湖水

大肠杆菌的测定

水中总大肠杆菌的测定 来源:加入时间:2010-3-30 12:15:51 1 原理 总大肠杆菌群可用多管发酵法或滤膜法检测。多管发酵法的原理是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖,产酸产气以及具备革兰氏染色阴性,无芽孢,呈杆状等有关特性,通过三个步骤进行检验,求得水样中的总大肠菌群数,实验结果以最可能数(most probable number),简称MPN表示。 2仪器 2.1 高压蒸汽灭菌器。 2.2 恒温培养箱,冰箱。 2.3 生物显微镜,载玻片。 2.4 酒精灯,镍铬丝接种棒。 2.5 培养皿(直径100mm),试管(5×150mm),小倒管,吸管(1,5,10ml),烧杯(200,500,2000ml),锥形瓶(500,1000ml),采样瓶。 3 培养基及染色剂的制备 3.1 乳糖蛋白胨培养液: 将10g蛋白胨、3g牛肉浸膏、3g乳糖和5g氯化钠加热溶于1000mL蒸馏水中,调节pH为7.2-7.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混匀,分装于试管(内有倒管)中,于121℃高压灭菌器中灭菌15min,贮存于冷暗处备用。 3.2 三倍浓缩蛋白胨溶液: 按上述乳糖蛋白胨培养液的制备方法制备。除蒸馏水外,各组分用量增加至三倍。 3.3 品红亚硫酸钠培养基 3.3.1 贮备培养基的制备 于2000mL烧杯中,先将20-30g琼脂加到900mL蒸馏水中,加热溶解,然后加入3.5g磷酸氢二钾及10g蛋白胨,混匀,使其溶解,再用蒸馏水补充到1000mL调节溶液pH至7.2-7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤,再加10g乳糖,混匀,定量分装于250或500mL锥形瓶内,置于高压灭菌器中,在121℃灭菌15min,贮存与冷暗处备用。 3.3.2 平皿培养基的制备 将上法制备的贮备培养基加热融化。根据锥形瓶内培养基的容量,用灭菌吸管按1:50比例吸取5%碱性品红乙醇溶液,置于灭菌空试管中;再按1:200比例称取无水亚硫酸钠,置于另一灭菌空试管内,加灭菌水少许使其溶解,再置于沸水浴中煮沸10min(灭菌)。用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液,滴加于碱性品红乙醇溶液内至深红色再褪至淡红色为止(不宜加多)。将此混合液全部加入已融化的贮备培

大肠菌群测定方法

大肠菌群测定方法 Company number:【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】

大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名,而是卫生细菌领域的用语,它不代表某一个或某一属细菌,而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌,这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致,其定义为:需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广,在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明,大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方,人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主,而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的,主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低,表明了粪便污染的程度,也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物,其中有健康人粪便,也有肠道患者或带菌者的粪便,所以粪便内除一般正常细菌外,同时也会有一些肠道致病菌存在(如沙门氏菌、志贺氏菌等),因而食品中有粪便污染,则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性,潜伏着食物中毒和流行病的威胁,必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一,目前已被国内外广泛应用于食品卫生工 作中。 二、大肠菌群检验方法:由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌,即:需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。 目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 (一)国家标准:国家标准采用三步法,即:乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验:样品稀释后,选择三个稀释度,每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h,观察是否产气。分离培养:将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上,36±1℃培养18-24h,观察菌落形态。证实试验:挑取平板上的可疑菌落,进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h,观察产气情况。报告:根据证实为大肠杆菌阳性的管数,查MP N表,报告每100ml(g)大肠菌群的M PN值。 具体操作参见《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》 (二)原国家商检局制订的行业标准,等效采用美国FDA的标准方法,用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法:推测试验:样品稀释后,选择三个稀释度,每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48± 2h,观察是否产气。证实试验:将产气管培养物接种煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中,36±1℃培养48±2h,观察是否产气。以BGLB产气为阳性。查MPN表,报告每ml(g)样品中大肠菌群的MPN值。具体操作参见SN0169-92《中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》三、说明:

大肠菌群检测方法(中文翻译)

大肠菌群检测方法(中文翻译)

3 定义和简介 3.1 定义 所有的大肠菌群均是发酵乳糖,革兰氏阴性,无牙孢的杆菌。官方的对大肠菌群的定义可能以培养温度(30、32、35、37)不同作评价;或以确定是否发酵乳糖产气作为定义的一个特征.大多数ISO和其他官方标准是利用发酵乳糖产气作为一个定义特征。而在ISO 4832 中则利用了在VRBL上的菌落大小作为其唯一的定义特征。 鉴于这些定义的不同,建议实验室根据相关定义用相应的适当方法。 ●国际标准:样品分析是否符合国际交易规范 ●官方主市场调整定义:样品分析是否符合地方标准 ●一般定义:样品分析是否符合一般规范。 任何必要方法的调改必须通过市场实验室质量确认中心和雀巢研究中心食品安全微生物组的协助。 以下为一些官方定义例子: *ISO 4831大肠菌群是通过其在选择性肉汤上的生长和发酵乳糖产气能力来定义*AOAC INTERNATIONAL, APHA/FDA定义大肠菌是指发酵乳糖产酸产气(T=32或35度)革兰氏阴性杆菌 *ISO 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小(最小5mm直径)和产酸情况。(T=30或35或37℃) 3.1.1 液体培养基中 ISO 4831 大肠菌群是根据其在选择性肉汤中生长能力和发酵乳糖产气情况来定义.(T=30或35或37℃) AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。(T=32或35℃) 由LI第一章概述,大肠菌群是指发酵乳糖气微生物群。 3.1.2 固体培养基中 IOS 4832大肠菌群定义是根据其在VRBL-agar(30or35or37度)的菌落大小(最小5mm直径)和产酸情况。(T=30或35或37℃) AOAC INTERMATIONAL,APHA/FA中大肠菌群是指发酵乳糖产酸产气革兰氏阴性杆菌。基于以上定义可知大肠菌群在VRBL培养基上会形成5mm以上直径的红色菌落且在确认试验中发酵乳糖产气 由LI第二章概述,大肠菌群是指在VRBL琼脂培养基上会形成特征性菌落且在确认试验中发酵乳糖产气微生物群。 3.2 简注 BGLB:亮绿乳糖胆盐培养基肉汤 LST:月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 MPN:最可能数 VRBL:紫红胆汁琼脂 4 安全防范 大肠菌群不表现为无害,注意实验室的良好操作。 5 参考资料 5.1 LIs中提到的及其它心要文件 LI-00.700 LI-00.702

食品大肠菌群的检测

【GB/T 4789.3—1994】 食品卫生微生物学检验大肠菌群测定 1 主题内容与适用范围 本标准规定了食品中大肠菌群的测定方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的测定。 2 术语 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 3 引用标准 GB 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 4 设备和材料 4.1 温箱:36±1℃。 4.2 冰箱:0~4℃。 4.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。 4.4 天平。 4.5 显微镜。 4.6 均质器或乳钵。 4.7 平皿:直径为90mm。 4.8 试管。 4.9 吸管。 4.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 4.11 玻璃珠:直径约5mm。 4.12 载玻片。 4.13 酒精灯。 4.14 试管架。 5 培养基和试剂 5.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 5.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25沥规定。 5.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 5.4 EC肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 5.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。 5.6 生理盐水。 5.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 6 检验程序 大肠菌群检验程序如下: (图略) 7 操作步骤

7.1 检样稀释 7.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1∶10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000~10000r/min 的速度处理1min,做成1∶10的均匀稀释液。 7.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1∶100的稀释液。 7.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。 7.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度接种3管。 7.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 7.3 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养18~24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。 7.4 证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1~2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。 7.5 报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。 8 粪大肠菌群(faecal coliform) 8.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见7.2条)转种于EC 肉汤管内,置44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃培养18~24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。 8.2 结果报告 根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。 大肠菌群最可能数(MPN)检索表 (图略) 续表 (图略) 续表 (图略) 附加说明: 本标准由卫生部卫生监督司提出。 本标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。

大肠杆菌的检测

大肠杆菌的检测:大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱:36±1℃。1.2 冰箱:0~4℃。1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。1.4 天平。1.5 显微镜。1.6 均质器或乳钵。1.7 平皿:直径为90mm。1.8 试管。1.9 吸管。1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。1.13 酒精灯。1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。 3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置 36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 3.3 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养 18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。 3.4 证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。 3.5 报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。

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