中国卫生检验杂志

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[基金项目] 湖南省教育厅课题(402JY02C401)

[作者简介] 陈云生(1961-),男,副教授,主要从事卫生理化检验新技术新方法研究。

3通讯联系人,E-mail:hat81541@1261com 【论著】

共振光散射法测定人尿中痕量萘酚

陈云生,杨红梅,何爱桃3

(南华大学公共卫生学院卫生检验教研室,湖南衡阳 421001)

[摘要] 目的:建立共振光散射测定尿中痕量萘酚新方法。方法:在稀硫酸介质中,萘酚与溴酸钾、吖啶橙发生反应形成聚集离子,产生共振散射光谱,且导致共振光散射显著增强。结果:α-萘酚和β-萘酚最大的共振光散射峰均为46810n m;线性范围分别是1141×10-7~2180×10-5mol/L,1128×10-7~3100×10-5mol/L;相关系数分别为r1= 019996,r2=019993,检出限分别为01422×10-7mol/L和01385×10-7mol/L。将其用于测定人尿中痕量α-萘酚,相对标准偏差为418%~713%,平均回收率为9517%。结论:新建方法灵敏、简单、快速,尿样测定结果满意。

[关键词] 共振光散射;萘酚;吖啶橙;尿样

[中图分类号] O657132 [文献标识码] A [文章编号] 1004-8685(2009)01-0001-03

D eter m i n a ti on of trace naphthols i n hu man ur i n e by resonance li ght sca tter i n g

Chen Yun2Sheng,Yang Hong2M ei,He A i2Tao3

(College of Public Health,University of South China,Hengyang421001,China)

[Abstract] O bjecti ve:To devel op a novel method f or the deter m inati on of trace naphthols1M ethods:I n the dilute H2S O4medi2 u m,Naphtholscan reacted with potassiu m br omate and acridine orange(AO)t o f or m i on-ass ociati on comp lexes,which p r oduced res onance light scattering(RLS)s pectra and resulted in the great enhance ment of RLS1Based on this,the method was p r oposed f or the deter m inati on of trace naphthols1Results:The enhanced intensity of RLS at468nm was in p r oporti on with naphthols in the range of1141×10-7~2180×10-5mol/L forα-naphthol,1128×10-7~3100×10-5mol/L forβ-naphthol1The relative co2 efficient and the li m its of detecti on were019996and01422×10-7mol/L,019993and01385×10-7mol/L f orα-naphthol and β-naphthol,res pectively1The urine sa mp les analysis of the relative standard deviati on was418%~713%and the average re2 covery was9517%(n=6)1Conclusi on:The method is sensitive,si m p le and rap id1Satisfact ory result is obtained for the deter m i2 nati on of trace naphthols in hu man urine1

[Key words] Res onance light scattering;Naphthol;Acridine orange;U rine

多环芳烃(polycyclic ar omatic hydr ocarbons,P AH s)是环境中广泛存在的一类有机污染物,因其具有致癌,致畸,致突变等特性而引起人们的普通关注[1];而萘是多环芳烃中挥发性最高的一种物质,其代谢产物α-萘酚和β-萘酚已被广泛用作人和动物暴露于P AH s环境下的生物标志物[2,3],因此测定尿中萘酚的含量对于P AH s环境暴露水平、健康风险评价等具有重要的意义[4]。

目前测定萘酚的方法主要是HP LC-F D[5]、MS-GC[6]和其它改进方法[7],但这些方法仪器昂贵,难以在基层普及。自1993年Pasternack等[8]用共振光散射(res onance light scattering RLS)技术对卟啉类化合物在核酸上的聚集进行研究后,揭开了RLS技术在分析检测方面应用的序幕,现已成功用于生化、环境、食品等分析领域[9~12],但目前尚未见有RLS法测定萘酚的报道。

本实验研究了在稀硫酸介质中,萘酚对溴酸钾-吖啶橙体系的RLS有明显增强作用,且在一定浓度范围内其RLS增强的强度与萘酚的浓度在一定范围内有良好的线性关系,据此建立了测定萘酚的新方法。该方法仪器设备简单,操作方便快速,灵敏度高,易于推广,用于人尿中痕量萘酚的测定,结果令人满意。

1 材料与方法

111 仪器与试剂

H itachi-F4500荧光分光光度计(日本日立公司); UV8500型紫外-可见分光光度计(上海天美仪器有限公司); AB204-S电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);三用电热恒温水浴箱(北京市永光明医疗仪器厂)。

α-萘酚和β-萘酚(天津市元立化工有限公司,A1R)标准液:贮备液浓度为5100×10-3mol/L,工作液浓度为1100×10-5mol/L;吖啶橙(AO,A1R,上海化学试剂采购供应站进口分装)贮备液:1100×10-3mol/L,使用液:1100×10-4mol/L;溴酸钾使用液:0110mol/L(K B r O

3

,A1R,广东汕头市西拢化工

厂);硫酸使用液:0114mol/L(H

2

S O4,A1R)。其它试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水。

112 实验方法

于5m l 比色管中依次加入0160m l 1×10-4

mol/L AO,0180m l 0114mol/L H 2S O 4,1120m l 011mol/L K B r O 3及一定量的1100×10-5mol/L 的萘酚标准溶液,混合均匀,稀释至刻度后摇匀,立即放入60℃水浴中,加热反应20m in 后,取出用冰水冷却。然后在荧光分光光度计上以λe m =λex 进行同步扫描,得到RLS 光谱。在最大的RLS 峰46810n m 处测量溶液的RLS 强度I 和试剂空白的I 0,D I =I -I 0。激发和发射狭峰宽度为10n m 。

2 结果与讨论211 光谱性质

21111 吸收光谱 图1为AO 、AO -K B r O 3、AO -H 2S O 4-K B r O 3的吸收光谱,从图中我们可以看到AO 的最大吸收峰位

于49012n m,当在AO 溶液中加入氧化剂K B r O 3后体系的吸收强度减弱,加入稀硫酸后AO 最大的吸收峰消失

F i g1 Absorpti on spectra of AO -H 2S O 4-KBr O 3syste m

11AO;21AO -K B r O 3;31AO -H 2S O 4-K B r O 3;AO (1210μmol/L );H 2S O 4(010224mol/L );K B r O 3(01024mol/L )

21112 荧光光谱 AO 、AO -H 2S O 4、AO -K B r O 3、AO -H 2S O 4

-K B r O 3体系的荧光光谱如图2所示。实验结果表明:(1)AO

在稀硫酸介质中的荧光光谱与它本身的荧光光谱完全重合,

这说明两者并无作用且AO 的荧光强度不受稀硫酸的影响(曲线1);(2)在AO 溶液中加入氧化剂K B r O 3后导致体系的荧光减弱(曲线2);加入稀硫酸后体系的荧光猝灭,伴随着出现新的RLS 峰(曲线3)

F i g2 Resonance li ght sca tter i n g(RL S)spectra of AO -H 2S O 4-KBr O 3naphthol system and fluorescene spectra fluorescene s pectra:11AO (1210μmol/L );21AO (1210μmol/L )+K B r O 3(01024mol/L );RLS s pectra:3~81AO -H 2S O 4-K B r O 3naphthol (c naphthol /μmol/L:010,014,018,112,116,210)

21113 RLS 光谱 AO -H 2S O 4-K B r O 3-萘酚的RLS 光谱如

图2,从图中可以看到该体系有2个较大的RLS 峰,分别为

46810n m 和49310n m 处,且RLS 增强的强度与萘酚在一定浓

度内呈良好的线性关系,本文选择46810n m 作为测定波长。从RLS 光谱和吸收光谱的比较中可以看出RLS 位于其吸收带内,在这种情况下,可以认为它是一个吸收-散射-吸收的过程。根据Anglister [18]等人的理论认为该体系增强的散射光被认为是共振光散射。

实验结果表明:α-萘酚和β-萘酚有相同的光谱性质,最大散射峰波长均为468n m,故以下实验中均以α-萘酚为例来研究,选择468n m 作为测定波长。212 实验条件的优化21211 pH 的影响 该反应体系必须在酸性条件下进行,分别试验了H 2S O 4,HCl,H 3P O 4和CH 3COOH 4种酸性介质,结果表明,体系在H 2S O 4介质中,ΔI RLS 最大,因而灵敏度最高,且ΔI RLS 与萘酚的浓度线性关系好,故选择H 2S

O 4作为反应介质。在0114mol/L H 2S O 4溶液用量为0170~0190m l 之间时,体系的ΔI RLS 最大且基本一致,超出此范围时,ΔI RLS 值均会下降(见图3)。本实验中酸性太弱或太强时均不利于体系反应的发生,结合定量试验的原则,选择加入0180m l 的0114mol/L H 2S O 4来控制溶液的酸度

F i g3 Effect of H 2S O 4volu m e on the RL S i n ten sity

21212 AO 的用量影响 研究了AO 用量对反应体系的影响,

实验结果如图4所示。结果表明:当AO 用量不足时,形成的聚集体不够,ΔI RLS 偏低;而当AO 过量时,反应时间延长,试剂空白也明显增加,导致ΔI RLS 值偏低。当AO 在0150~

0170m l 即浓度为1100×10

-4

mol/L 时,体系的ΔI RLS 值稳定且

最大,故本实验选择AO 的用量为0160

m l 。

F i g4 Effect of AO volu m e

21213 K B r O 3的用量影响 研究了K B r O 3的用量对反应体系

的影响,实验结果如图5所示。结果表明:当K B r O 3的用量过少时,形成的聚集体不够且反应所需时间长,体系的ΔI RLS 值较小;而用量过多时反应快,但空白值增加,ΔI RLS 值也偏小。当K B r O 3用量在1110~1130m l 即K B r O 3浓度为0110mol/L 时,体系的ΔI RLS 最大且稳定。故本实验选择K B r O 3的用量为1120m l 。

F i g5 Effect of KBrO3volu m e on the RL S

21214 反应温度及时间的影响 按照实验方法配制溶液,分别控制反应体系的温度在20℃~70℃范围内,发现随着温度

的升高,反应加快。当反应温度为60℃时体系的ΔI

RLS

值最

大,而后随着温度的增加反应速率增加,但ΔI

RLS

却减小,使得灵敏度降低,故选择60℃作为反应体系的最佳温度。在反应温度60℃时的条件下,研究了加热时间对反应体系的影响,实

验结果表明:加热时间在10~20m in内,ΔI

RLS

值达到最大且灵

敏。加热时间不够时,反应进行不完全,从而使得体系ΔI

RLS 值偏小;当加热过久,虽反应进行完全,但由于空白值增加也

导致ΔI

RLS

值偏小,同时发现该体系RLS强度在2h内稳定不变。故实验选择加热反应时间为10m in,在2h内完成测定。213 工作曲线、检出限及精密度

在实验确定的最佳条件下,α-萘酚的线性范围在1141×10-7~2180×10-5mol/L时,β-萘酚的线性范围在1128×10-7~3100×10-5mol/L时,均与体系ΔI RLS呈线性关系。测定

α-萘酚的线性回归方程为ΔI

RLS

=863117C(×10-6mol/L)-71381,β-萘酚的线性回归方程为ΔI RLS=918170C(×10-6mol/L)+11120,相关系数分别为r1=019996和r2= 019993。经11次空白平行测定,按照C L=3S b/k(S b表示空白溶液的标准偏差,k表示工作曲线的斜率)公式计算出α-萘酚的检出限为01422×10-7mol/L,β-萘酚的检出限为01385×10-7mol/L。分别对α-萘酚和β-萘酚的014×10-6mol/L和116×10-6mol/L两种标准溶液进行7次平行测定的相对标准偏差为417%,118%和318%,114%,实验结果充分表明本方法精密度良好。

214 共存物质的影响

在AO,H

2

S O4,K B r O3及α-萘酚的浓度分别为112×10-5mol/L,010224mol/L,0124mol/L和112×10-6mol/L的最佳条件下,根据可能共存的实际情况,考察了多种干扰物质对测定结果的影响,当误差不大于5%时:20000倍的Na+、S O2-4,2000倍的K+、I-、Cl-、Ba2+、F-、Ca2+、A l3+、NH+4、NO-3、尿素、葡萄糖、乙醇,100倍的HCO-3、柠檬酸、正己烷,50

倍的NO-

2

、Fe3+、Cu2+、草酸、BS A,20倍的Fe2+,20倍的苯酚、苯胺、间二苯酚、对二苯酚不干扰测定。结果表明共存物质对萘酚测定的影响较小,说明本方法抗干扰能力强,有良好的实用价值。

215 样品处理及分析

本实验参照文献[13]的方法采用碱水解法处理尿样,并作适当改进,具体操作如下:将尿样充分混匀后,立即取25m l置于50m l具塞比色管中,加入1215mol/L的氢氧化钠溶液5m l,于沸水浴中避光水解4h后,用盐酸调节pH2~3;分别取正己烷各15m l提取两次,合并有机相于50m l具塞比色管中,30℃下吹氮浓缩至近干。加015m l乙醇-水(体积比1: 1)溶解残渣。

因测定α-萘酚和β-萘酚的线性范围、检出限等参数相类似,故应用本方法,以α-萘酚为例分析了锅炉工、厨师及停车场工人及学龄前儿童各一份共4份尿样,其中3份尿样检出萘酚,而学龄前儿童未检出。尿样测定结果(以α-萘酚计算)并与高效液相色谱对比,结果见表1,用配对设计资料的t 检验计算所得t=-1149,而查表得t

0105(5)

=21571,t

表1 尿样测定结果(n=6)

Sample

O riginal

C(mol/L)

Added

C(mol/L)

Total found

C(mol/L)

HPLC

C(mol/L)

Recovery

(%)

RSD

(%) 12126×10-7210×10-7411×10-72130×10-79612615 22186×10-7210×10-7417×10-72191×10-79617418 32114×10-7210×10-7319×10-72110×10-79412713

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(收稿日期:2008-09-22)

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