用TUNEL法检测植物原生质体的凋亡_周军

细胞凋亡试验常用的方法

细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法） （一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法： 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率 抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。 （二）荧光法： 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 （三）DNA琼脂糖凝胶电泳法： 1、DNA提取： 用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳： TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。 60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。

细胞凋亡实验步骤及注意事项

细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着

常用细胞凋亡检测方法(图)

常用细胞凋亡检测方法（图） 转载请注明来自丁香园 发布日期：2012-02-16 13:41 文章来源：丁香通 关键词：丁香园生物专题义翘神州细胞培养点击次数：951 一、细胞凋亡的形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜 ①未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 ②染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA 特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10 ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3、透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细核红染。因此将Annexin-V 与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 方法

植物原生质体相关材料

植物原生质体相关材料 2013-9-2 From HZB 一、植物材料 研究表明，几乎从植物的所有部位都能得到原生质体，其中以叶片为多。根尖组织也是植物原生质体的重要来源，它可由各种植物的种子萌发后取得。花粉经特异酶处理也能得到原生质体，在单倍体遗传育种中有特殊的用途。 但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。 1. 细胞悬浮培养物 在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织： 取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2,4－D 2-4mg/L的MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2-4d转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80-120r/min，在25±1℃下暗培养。通常经悬浮培养3～4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。 2. 叶肉细胞 叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良好的培养材料，下列外界因素是需要着重考虑的： （1）光强为3000-6000lx。 （2）温度为20-25℃培养。 （3）相对湿度在60％-80％左右。 植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。 3. 植物材料的预处理 对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。这些处理包括：暗处理、预培养、低温处理等。 例如，把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1～2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂。在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再去壁；经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也解体。龙胆试管苗的叶片只有用4CC低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。但在很多情况下材料不必经过专门的预处理。 二、酶 1. 酶的种类 构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁干重的25％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。 ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶（包括C1、CX、B一葡萄糖苷酶等）、果胶质、半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。 日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。即二步法降解。 2. 渗透稳定剂

植物原生质体培养方法

植物原生质体培养方法 1 植物原生质体培养的简史 植物细胞原生质体, 在植物学上指植物细胞通过质壁分离后, 可以和细胞壁分开的那部分细胞物质。原生质体分离纯化后, 须在适当的培养基上应用适当的培养方法, 才能再生细胞壁, 并启动细胞持续分裂, 直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗, 最终再生完整植株。其中, 选择合适的培养方法始终是原生质体培养中最基础也是最关键的一环。 植物原生质体培养方法起源于植物单细胞培养方法。早在1902 年,Haberlant 通过实验就预言: 体外培养单个细胞可通过其分裂得到培养组织。直到1954 年, 植物单细胞培养才获得成功。M uir 将培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上而得到了它们的单细胞克隆, 并建立了看护培养的方法。悬滴培养由De Ropp1954 年开创, 1960 年Jones 等完善了这一技术, 并建立了微室培养的方法。同年, Cock ing 应用酶法分离原生质获得了成功, 从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现, 原生质体的培养方法也得到了不断的改进, 现在常用的液体浅层培养、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等技术, 使原生质体培养获得了极大的成功。 2 原生质体培养方法 2. 1 液体培养法 2. 1. 1 液体浅层培养(L iquid th in culture) 这是目前较常用的原生质体培养方法, 一般适用于容易分裂的原生质体, 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层, 封口进行培养。这种方法操作简单, 对原生质体损伤较小, 且易于添加新鲜培养物。用这种方法, J.T rmeouillaax 等成功地培养长春花冠瘿组织的激素自养型的原生质体单细胞克隆; H isato Kunitake 等也在改良的M S 培养基上培育了Eustom a g rend if lorum (龙胆科, 原产美国) 原生质体再生植株。但这种方法也常使原生质体分布不均匀, 发育的原生质体之间产生粘连而影响其进一步的生长和发育, 尤其是难以定点观察单个原生质体的命运。王吉吉之等认为液体浅层培养在培养过程中, 应经常轻轻晃动培养基, 以增强通气, 促进愈伤组织形成。 2. 1. 2 微滴培养(D rop let culture) 微滴培养是由液体浅层培养发展起来的一种方法, 它克服了后者局部密度过高和原生质体粘聚的缺点。此方法是将0. 1m l 或更少的原生质体悬浮液用滴管滴于培养皿底部, 封口后进行培养。为避免微滴蒸发, 可将培养器皿置于湿润的环境中, 或在微滴上覆盖矿物油。此法适用于融合体及单个原生质体培养, 尤其适用于较多组合的实验。为了比较黄瓜两个品系在不同的植板密度以及在不同的激素水平下原生质体生长情况, Z. K. Punja 等选用了此方法获得很好的效果; 同样, S. V essabutr 等培养百脉根时也比较了不同预处理、不同酶液组合对原生质体培养的影响。 2. 2 固体培养—— 琼脂糖平板法(A grose beadmethed) 固体培养作为凝固剂的物质可以是琼脂、琼脂糖或Gellan gum , 近来很多实验证明, 琼脂糖尤其是低熔点的琼脂糖是一种良好的培养基凝固剂, 并且具有促进原生质体细胞分裂的作用。琼脂糖平板法是将原生质体纯化后悬浮在液体培养基中, 然后与热融并冷却到45℃的琼脂糖按一定比例混合, 轻轻摇动使原生质体均匀分布, 凝固后封口培养。由于原生质体彼此分开并固定了位置, 就避免了细胞间有害代谢产物的影响, 既便于定点观察, 又有利于追踪原生质体再生细胞的发育过程。Z. K. Punja 等证明琼脂平板法比微滴培养及液体浅层培养具有更高的植板率; 甘霖等也得出同样结论。但此种方法对操作技术要求比较严格, 尤其是温度一定要适宜; 添加低渗透压的培养基和转移再生愈伤组织也比较繁琐, 而且培养的原生质体极易褐变死亡。 2. 3 液体2固体结合培养 2. 3. 1 双层培养法(A grose2liquid doublelayer) 这种方法即在培养皿的底部先铺一薄层含或不含原生质体或细胞的固体培养基,

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞： 姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没染上颜色。 苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258，DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。 PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但PI不能通过正常细胞膜，Hoechst则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调

亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别

实验14-细胞凋亡的诱导和检测

实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。

形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

植物组织培养 第十章 原生质体培养

第十章原生质体培养 ?教学目的与要求： ?深入了解植物细胞结构功能与细胞全能性表达的关系，掌握原生质体的分离以 及培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术。 第一节、原生质体研究概况 一、原生质体的概念 ?原生质体(p r o t o p l a s t)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露 细胞。 二、原生质体研究进展 ?据统计，目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再 生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。 三、原生质体研究的意义 ?1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟 了道路。2、原生质体可摄入外源D N A，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。 第二节、原生质体的制备 1、用于分离原生质体的材料准备 ?无菌试管苗叶片 ?上胚轴和子叶 ?培养细胞 2、酶处理 ?原生质体分离常用的商品酶 ?纤维素酶类 ?果胶酶类 ?半纤维素酶 酶溶剂及其渗透压 ?酶溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 ?渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 ?酶浓度及酶解时间 ?酶解时间 ?酶浓度酶解温度 3、原生质体的收集和纯化 ?飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、P e r c o l l、F i c o l l。 ?P e r c o l l是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低(<20m o s m／k g H2O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／m l密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于P e r c o l l 扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，P e r c o l l不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。

植物原生质体培养

原生质体的培养 1. 原生质体的分离与纯化 原生质体培养的意义 (1)再生植株由原生质体再生生成植株，不论在进行有关细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组织培养实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体； ②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1～2个小时。 原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。 (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。 一、原生质体(protoplast)的分离 （一）材料来源 原生质体是通过质壁分离与细胞壁分开的部分，是能存活的植物细胞的最小单位。自从1960年用酶法制备大量植物原生质体首次获得成功以来，原生质体培养成为生物技术最重要的进展之一。通过大量的试验表明，没有细胞壁的原生质体仍然具有"全能性"，可以经过离体培养得到再生植株。原生质体的分离研究较早，1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。 （二）分离方法 1.机械分离法 1982年，Klercker第一次用机械方法从Stratiots aloides中获得原生质体.他们的做法是首先使细胞发生质壁分离,然后切开细胞壁释放出原生质体. 2.酶法分离 (1)酶的种类及特点 构成植物细胞壁的三个主要成分是： ①纤维素酶类：占细胞壁干重的25％至50％不等。 ②半纤维素酶类：平均约占细胞壁干重的53％左右。 ③果胶酶类：一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素 酶和果胶酶。

细胞凋亡的几种检测方法

细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发

生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，

实验一植物原生质体的分离和培养一教学目标 了解植物原生质

实验一植物原生质体的分离和培养 一．教学目标：了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解原生质体活性鉴定的原理。掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。二．重点：掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。 三．难点：分离和培养原生质体的技术。 四．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。 五．教学内容: 实验原理 植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性, 使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳定原生质膜。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂和再生植株。 测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。 细胞计数一般用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。 从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康的原生质体，

TUNEL法检测细胞凋亡

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA 断裂时，暴露的3'-0H 可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deox yn ucleotidyl Tran sferase,TdT）的催化下加上荧光素（FITC）标记的dUTP（fluorescein-dUTP），从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL 法检测细胞凋亡的原理。 TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂（和细胞凋亡时的断裂方式不同）。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把 射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。 针对问题2（TUNEL法的实验原理是什么？）： 基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细 胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3 -0H结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP 上的biot in 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biot in 分子），最后用DAB 过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情 况。■ 1. TUNEL工作原理：简单说就是一一TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。 其原理是；生物素（biot in ）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT En zyme）的 作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3' - 0H末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的 链霉亲和素（Streptavidin-HRP ）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通 显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-0H形成，很少能够被染色。 针对问题3 （TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）： 1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min ;而水化用梯度乙 醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀； 2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min, 几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和 抗体进入胞内。 3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1h,你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h,但要结合你最终的背景着色。 4. DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过 30min;我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。 5. PBS的充分清洗。我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加 次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。 6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经 验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的 特异性染色。 针对问题5.细胞通透的原理、通透剂的浓度、孵育时间及其配制方法？ 1. 蛋白酶K是消化膜蛋白，从而起打孔作用，增加

(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项

(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 编辑整理： 尊敬的读者朋友们： 这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项）的内容能够给您的工作和学习带来便利。同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。 本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项的全部内容。

常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 大家常把细胞凋亡和细胞坏死混淆,其实两者是不同的细胞死亡形式，大家可以在死亡细胞的形态、生化和分子指标上将二者区分开来，细胞凋亡检测的方法不少，这里就总结下几种常用的检测方法. 细胞凋亡检测更多详情，点击查看不可不知的细胞检测方法——MTT 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落. (2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等.凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ～1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1）。 3 透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro—apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations)的空泡结构(图2）；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 图2

细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法

细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法 一、定性和定量研究 只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜） 进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。 二、区分凋亡和坏死 可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。 不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等。 三、样品来源不同选择 组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。 四、细胞凋亡检测 1、早期检测: 1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素C的定位检测 4) 线粒体膜电位变化的检测 2、晚期检测： 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在 180-200 bp 的DNA片段。 对于晚期检测通常有以下方法： 1) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记) 2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 3) T elemerase Detection (端粒酶检测) 3、生化检测： 1）典型的生化特征：DNA 片段化 2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记） 4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。 4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，

细胞凋亡的几种检测方法

细胞凋亡的几种检测方 法 Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】

细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、 DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规

律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，

植物原生质体融合方法的研究进展

龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/404969408.html, 植物原生质体融合方法的研究进展 作者：李琦 来源：《种子科技》2018年第06期 摘要：原生质体融合（protoplast fusion）是指通过物理或化学方法使两个细胞的原生质体进行融合，经培养获得具有双亲全部或部分遗传物质后代的方法。应用植物原生质体融合技术，可以克服远缘杂交不亲和的障碍，打破物种之间的生殖隔离，扩大杂交亲本范围，实现基因在物种间的转移和遗传重组，培育新品种和创造新物种。主要就植物原生质体融合的方法进行了阐述。 关键词：植物原生质体；融合方法；研究进展 文章编号： 1005-2690（2018）06-0038-02 中图分类号： Q943 文献标志码： A 原生质体是组成细胞的一个形态结构单位，原生质体是指被去掉了细胞壁后的被细胞膜包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的主要材料。1960年英国科学家Cocking第一次用酶法大量制备原生质体，Cocking采用的方法是在番茄幼苗的根组织中加入可降解细胞壁的等渗酶液，在一定条件下培养一段时间后，发现大部分细胞的细胞壁被降解，从而制备出大量有活力的原生质体。 1 原生质体融合的目的及意义 原生质体融合技术可克服不同原生质体间的排斥力，使两种不同种属的原生质体间发生膜融合、胞质融合和核融合，进而形成具有含两种遗传物质的杂交细胞，克服远缘杂交的不亲和性和子代不育等障碍。另外，可转移优良的生物性状，实现基因重组，而改良现有品种。目前原生质体融合所改良的目标性状包括抗冻、抗干旱、抗病毒、抗虫、耐高盐等，还可按照人们预先的期望创造出新物种。 2 原生质体的融合方法 2.1 自发融合 在酶解细胞壁形成原生质体的过程中，相邻的原生质体会因细胞间胞间连丝的扩展和粘连而彼此融合形成同核体（homokaryon）。每个同核体内可包含两个或多个核，这种类型原生质体的融合被称作为自发融合。多核融合体常出现在植物幼嫩叶片或分裂旺盛的培养细胞制备的原生质体中。如在玉米胚乳愈伤组织细胞和玉米胚悬浮细胞原生质体中，大约有50%是多核融合体。 2.2 高pH-高Ca2+法