小鼠创伤后感染海洋细菌实验模型的建立_郝秀红
[文章编号]1005-1139(2005)03-0208-03
小鼠创伤后感染海洋细菌实验模型的建立
郝秀红1,马聪1,李娜1,虞积耀2,段蕴铀3,王大鹏4
(海军总医院,北京1000371.检验科;2.病理科;3.呼吸科;4.海战伤研究中心)
[摘要]目的:建立小鼠腿部创伤后海水浸泡实验模型并检测海洋细菌对其感染能力。方法:45只CD-1 (ICR)VAF小鼠,随机分为实验组(浸泡于含有海洋细菌的人工海水)和阴性对照组(浸泡于不含微生物的人工海水)。致伤后浸泡45m i n,放入动物洁净饲养柜中饲养,观察浸泡后6h、12h、24h、48h、72h的生命指标及白细胞计数、血培养、伤口分泌物培养。3d活杀或死亡后立即取心,肝,肺等脏器压印培养,病理检查及核酸指纹图分析。
结果:实验组致伤浸泡后小鼠精神萎靡,呼吸急促,弓背竖毛,但症状轻重及持续时间因菌种不同而有差异。12h内两组白细胞升高,实验组明显,24h后两组均渐恢复,48h后缓慢接近伤前水平。实验组伤口分泌物培养阳性率100%,副溶血弧菌组12h血培养阳性。实验组小鼠心,肝,肺压印培养分离出的细菌,经DNA指纹图分析证实与相应浸泡菌一致。病理学检查实验组皮下及横纹肌内大量嗜中性粒细胞浸润,肌纤维破坏,蜂窝组织炎形成,对照组少量中性粒细胞散在浸润,横纹肌组织正常。结论:该模型对探讨海洋细菌致病性具有良好的应用前景。
[关键词]海水;模型;生物学;多处创伤
[中图分类号]R37[文献标识码]A
Establis h m ent of an experi m ental m odel to evaluate the sea bacillus.infectious ability to wounded mouses
HAO X iu-hong,MA Cong,LI Na,YU J i-yao,DUAN Yun-you,WANG Da-peng(D epart m ent of Labora tory,Na-vy G eneralH os p ital,B eijing100037,China)
[Ab strac t]O b ject i ve:T o estab lish a w ound-and-d i p m ode l to ev al uate t he i nfecti ous ability of sea bac ill us t o w ounded m ouses.M e thod s:45wounded SPF m ouses we re random l y div i ded into t wo groups:t he exper i m ent groups(d i pped i n m anual seaw ater w i th d ifferent sea bacill us)and the control g roup(d i ped i n t he m anual sea w ate r w ithoutm icrobe).A fter being wounded, m ouses w ere d i ped f o r45m i nutes,t hen feeded i n c l ean feed i ng cages.6、12、24、48h and72h after d i pp i ng,life i ndexes、leuco-cyte counti ng、blood cu lti va ti on、wound secre tion culti va ti on w ere observed.Be i ng dead or k ill ed t hree days l a ter,the ir hearts,liv-ers,l ungs w ere taken out i m m ed iate l y to pe rf o r m v iscera bacter i a culture、pa t ho l og ica l exam i nation and nuc l e ic a icd fi nger m ark a-na l y si s.R esu lts:T he experi m ent groups we re d isprited,short-brea t hed,back-arch i ng and f u r-erecti ng w it h certa i n d iffer-ence a m ong d ifferent bac ill us.L eucocy te counti ng r i sed i n both groups i n the first12hours wh ile exper i m ent groups w ere m ore obv i ous.l eucocyte counting beg an to recover24hours l a ter and nearly reached befo re-wounded leve l48hours later.W ound se-creti on cu lti va tion in experi m ent groups had a100%pos itive rate wh ile b l ood cu lti va ti on had a po siti ve result in V i bro.parahae-m o l y ti cus group at12hours on l y.B acill us separated fro m v iscera cu ltured organs o f exper i m ent groups we re the sa m e k i nd w it h the d i ppi ng bac ill us,w hich w as confir m ed by DNA fi nge r m ark ana l ysis.Subcutaneous and t he str i ped m usc l e o f experi m ent groups we re soaked by nume rous neutroph iles and m uscle fi ber dest o ried,a l veo late tissue i n fla mm ati on for m ed.In contro l group, there were only few neutroph ile i n subcutaneous and the str i ped m usc l e w ith muscle fi ber no r m a.l Conclusions:T hism ode l had a prom isi ng va l ue i n the i nffectious st udy o f sea bacill us.
[K ey words]seaw ater;mode;l b i o log i ca;l m ultiple trau m a
关于陆地创伤继发细菌感染已有大量报道[1~3],
[收稿日期]2004-08-02[修回日期]2004-09-07
[基金项目]/十五0军队科研基金资助项目(01L011)
[作者简介]郝秀红(1964-),女,河北廊坊人,1991年第三军医大学毕业,医学学士,主管技师,发表论文10余篇。电话:(010) 66958164但海水浸泡腿部创伤继发细菌感染的实验研究目前尚属空白,更无现成的动物实验模型,本实验旨在建立海水浸泡腿部创伤动物模型,探讨沿海某地分离出的细菌有否致病性。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1实验动物45只健康CD-1(I CR)VAF小鼠[4],雌雄搭配,体重18~22g,饲养3d后随机分为3组,实验组40只,阴性对照组5只。许可证编号SEXK(京)2002-0003。
1.1.2实验材料军医动字第B98017号。自沿海某地分离出的副溶血弧菌及海鱼弧菌。生物梅里埃公司提供血培养基。
1.1.3仪器V I TEK微生物分析仪(法国生物梅里埃公司)。35e恒温孵箱(型号78-1湖北黄石市医疗器械厂生产)。细菌摇床Seri e s25I N CUB A-TOR SHARKER(U SA)。
1.2方法
1.2.1动物感染模型制作在洁净工作台内完成以下操作:将实验动物固定于高压灭菌的固定板上。乙醇消毒小鼠左后腿背面,无菌剪刀备皮后用无菌刀片做/十0字形切割伤,直径1c m,深度至皮下。致伤后小鼠固定浸泡在3组人工海水中。
1.2.2分组实验1组:副溶血弧菌组,菌液浓度(1.4@106CFU/m l),20只。实验2组:海鱼弧菌组,菌液浓度(1.0@106CFU/m l),20只。阴性对照组:人工配制的无菌模拟海水,5只。上述3组小鼠致伤后立即放入海水中浸泡,将伤肢固定在固定器上,使其充分浸泡45m i n。
1.2.3细菌复苏方法2001年4月我们自沿海某地分离的副溶血弧菌、海鱼弧菌,经鉴定后菌种保存在脱脂乳培养基中,-20e低温冰箱保存。实验前保存菌种的冰冻培养基复融,取出细菌,接种于血平板,传两代后使其复苏。
1.2.4实验用细菌浓度以该海域海水中实测细菌浓度为本实验应用浓度。
1.2.5细菌悬液配制及计数从复苏的培养基中,挑取一个菌落于40m l无菌肉汤中,放置在35e 250r/m i n摇床24h,然后从中取其一定量加到人工海水中,调整细菌浓度至实验浓度。细菌计数方法:吸取上述菌悬液0.5m l加到4.5m l生理盐水中,倍比稀释成七种不同的菌液浓度,再从中吸取各菌液0.1m l加入到90mm计数培养基中,用/L0棒均匀涂布整个平板,35e培养18~24h,计数菌落数,推算CFU值,换算原菌液实际浓度。
1.2.6培养基预处理计数培养基用前在35e温箱中烘30m in,除去多余水分。
1.2.7人工海水配制实验用人工海水配制按照中国国家海洋局,第三海洋研究所海洋化学研究室提供的我国沿海某地海水主要成分,渗透压1250~ 1350mmo l/L,ph8.2,海水相对体积质量(比重)为1.05~1.06。实验室温度25e,海水温度维持在22e,高压蒸汽灭菌。
1.3结果观察及监测指标
1.3.1结果观察将打捞出水的小鼠放入过滤帽鼠笼中,在层流柜中饲养,观察6h、8h、12h、24h、48h、72h其炎性反应。
1.3.2监测指标1白细胞计数及血培养。o伤口感染细菌培养。?组织病理学检查。
1.3.3细菌来源鉴定由军事医学科学院五所微生物研究中心检测,提供检测报告。
2结果
2.1存活情况副溶血弧菌组致伤浸泡后第25h,死亡1只,死亡率5.0%;其余两组均存活至72h。2.2一般情况实验组浸泡前,精神状态良好,运动活跃,绒毛洁白光滑。浸泡后均有精神萎靡、呼吸急促、弓背竖毛,但症状轻重及持续时间因菌种不同而有差异,尤以副溶血弧菌组症状最重,持续时间长(达72h),其次为海鱼弧菌(12h)。实验组体重在第1天下降0.5~0.6g,,24h后缓慢恢复至伤前水平。阴性对照组体重无变化,仅在浸泡后6h以内,出现一时精神萎靡,轻微弓背,竖毛,但6h后很快恢复正常。实验中小鼠无非特异性死亡。
2.3致伤浸泡前后白细胞改变情况副溶血弧菌组致伤浸泡后即刻至12h白细胞平均值有明显升高,其余组无明显变化(表1)。
表1各组动物致伤前后白细胞改变情况
T ab1T he change of leucocyte after each group an i m al da mage(109/L)
Group Before each group
ani m al da m age
T i m e ofm ari nat er after da m age
6h12h24h48h72h
V i b ri o.parah ae m ol yti cu s group9.713.713.011.911.812.8 V i b ri o.da m s ela group 6.57.94.1 4.95.97.8 Negetive control group7.68.211.68.09.510.9
2.4致伤浸泡前后小鼠各种培养情况2种菌伤口培养均为阳性。实验组浸泡6h伤口轻微红肿; 12h红肿加剧,并有脓性分泌物渗出,尤以副溶血弧菌组分泌物较多;48h约有50%伤口渐变干燥,有少许脓性分泌物;72h有80%伤口结痂。海鱼弧菌组浸泡后6h,伤口肿胀,24h后渐形成结痂。
2种菌中副溶血弧菌组12h血培养阳性,阳性率10%,经细菌鉴定与浸泡中的细菌一致,余各组血培养阴性。实验鼠观察3d后活杀,取出心、肝、肺、脾、肾、肠脏器压印培养。副溶血弧菌20只鼠中有2只(10%)肺、心、肝、肾、肠出现细菌生长。其他两组均阴性。
2.5组织病理学变化实验组致伤浸泡后各脏器均发生组织细胞水肿、变性、白细胞渗出、聚集、灶性坏死,其中以肾脏损坏最为严重。
2.6核酸指纹图分析浸泡前(自某沿海海域分离出的2株弧菌)菌株,及致伤浸泡后从动物伤口、血液及脏器中分离出的菌株,经V I TE K微生物分析仪鉴定,表型一致;并经中国军事医学科学院五所核酸指纹图分析为同一株细菌。
3讨论
多年来,创伤后继发细菌感染均采用普通陆地伤模型[5,6],特别是由于海水高盐、低温等特殊性质,使其微生物的生长及检出受到局限,复杂的标本采集,繁琐的培养方法以及一系列检测设备尚需完善,从而使人们对伤后海水浸泡继发细菌感染模型缺乏深入的研究,对此我们做了初步的实验。
本实验根据海水浸泡的特点,在该模型的实施中,为防止小鼠伤口离开水面,我们将小鼠固定在自制的无菌固定架上,同时考虑到小鼠生性好舔的习性,将小鼠致伤在后腿背面。结果证明,实验组致伤浸泡后,小鼠均出现精神萎靡,呼吸急促,弓背竖毛,尤以副溶血弧菌组症状重,持续时间长,并且副溶血弧菌组12h血培养阳性,剖解后脏器培养阳性,同时两组伤口培养均分离出浸泡菌。
浸泡前菌株及致伤浸泡后从伤口、血液及剖解后脏器分离出的菌株,经法国生物梅里埃公司生产的V I T EK微生物分析仪鉴定,表型一致,并经中国军事医学科学院五所进行核酸指纹图分析确认为同一株细菌。综上所述,本实验所建立的小鼠创伤后海水浸泡继发海洋细菌感染的动物模型是成功的,而且也进一步证实了自沿海某地分离出的海鱼弧菌可致小鼠局部伤口感染,副溶血弧菌不仅可致小鼠局部伤口感染,而且可造成败血症和和多脏器广泛性感染,对此应引起高度重视。
(感谢:军事医学科学院第五研究所杨瑞馥主任对细菌核酸指纹图分析工作给予的帮助;解放军总医院周贵民主任和空军总医院马复先主任对本课题的指导)
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例2,女,年龄60d,患儿因发热2d,伴双小腿及足背肿胀,于2002年6月10日入小儿科。既往史:家属叙述不清。入院查体:T38.4e,R35/m i n,P140/m in。营养,发育中等。躁动不安。全身浅表淋巴结轻度肿大。双手掌棕黄红色细小脱屑皮疹,双足底脱皮。面色苍白,双眼睑轻度浮肿,口周发青,咽赤。心界不大,心前区无隆起,心率140/m i n,2~3肋间可闻及2级收缩期杂音。双肺未闻及异常。腹膨隆,肝肋下3cm,质韧,脾肋下1c m。双小腿及足背肿胀,四肢甲床及末梢发绀。实验室检查:血常规:W BC26.2@109/L,W-SCR0.53,W-LCR0.47,LBC5.59@1012/L,HGB167G/L。入院诊断:1败血症;o先天梅毒?入院后给予抗炎,抗病毒及能量合剂,丙种球蛋白等治疗。入院第2天检查RPR(+),T P HA(+),ALT139U/L,TBIL,DB I L,T P,ALB正常范围, A LP168U/L,临床确诊:先天梅毒。给以普鲁卡因青霉素G30万U,1/d,静点,连用2周。
2讨论先天梅毒皮肤损害多样性,可表现为膜样脱皮、脱屑、疱疹、脓疱疹、暗红色斑丘疹、出血点等,以四肢远端多见,尤其掌跖发疹。本例特点:1全身症状较明显,例1伴有严重的肝损害、贫血、淋巴细胞增高、各项酶明显增高。例2发烧,肝脾大,可疑/败血症0收入小儿科。o皮肤黏膜损害:全身或掌跖不同程度的脱屑性斑疹,例1复发性皮疹呈隆起性皮色斑疹,且眼睑发红,治疗后可消退。?例1患儿父母在梅毒治疗其间孕产患儿。