凯氏定氮法测定蛋白含量原理解析
凯氏定氮法测定蛋白含量原理解析
牛司锋，山东公司品管部
凯氏定氮法是目前蛋白质测定最常用的方法，通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。由于样品中含有少量非蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，因此，此法的结果称为粗蛋白质含量。凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一，可用于所有动、植物食品的分析及各种加工食品的分析，可同时测定多个样品，故国内外应用较为普遍，是个经典分析方法。
凯氏定氮法的原理是食品与浓硫酸、催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据盐酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即可计算出食品中的蛋白质含量。
一、实验试剂
1．40%氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠溶于60mL蒸馏水中；
2．4%硼酸溶液：称取4g硼酸溶于蒸馏水中稀释至l00mL；
3．0.1mol/L盐酸标准滴定溶液；
4．甲基红次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液(1g/L)与甲基红乙醇溶液(1g/L)按1+2体积比混合；
5．蒸馏水；
6．硫酸铜；
7．硫酸钾；
8．浓硫酸。
二、实验步骤及相关原理
1．样品处理
称取充分混匀的固体试样0.2~2g、半固体试样2~5g或液体试样10~25g（约相当于30~40mg 氮），精确至0.0001g，移入干燥的100mL、250mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜、6g 硫酸钾及20mL浓硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5~1h。取下放冷，小心加入20mL水。放冷后，移入100mL容
量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。
同时做试剂空白试验。
在此过程中，主要发生蛋白质与浓硫酸在催化剂作用下进行的氧化分解反应，离子反应方程式为：
-NH2＋(浓)H2SO4→(NH4)2SO4 (1)
2．定氮装置的检查与洗涤
装好并检查定氮蒸馏装置是否装好，向水蒸气发生器内装水至2/3处，加入数粒玻璃珠或沸石，滴加数滴甲基红指示剂及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾。
测定前定氮装置如下法洗涤2~3次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭上方夹子，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开下方夹子由橡皮管排出，如此数次，即可使用。
3．碱化蒸馏
向接收瓶内加入10.0mL硼酸溶液，加入混合指示剂2~3滴，并使冷凝管的下端插入液面下，根据试样中氮含量，准确吸取2.0~10.0mL试样处理液由小玻杯注入反应室，以10mL蒸馏水洗涤小玻杯并使之流入反应室内，随后塞紧棒状玻塞。将10.0mL氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小玻杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏。蒸馏10min后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下蒸馏液接收瓶。
以盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中2份甲基红指示剂与1份亚甲基蓝指示剂，颜色由紫红色变成灰色，pH为5.4；1份甲基红指示剂与5份溴甲酚绿指示剂，颜色由酒红色变成绿色，pH5.1。
同时作试剂空白实验。
在此过程中，主要发生氨气的释放与收集，以及用盐酸标准溶液对接收液的滴定反应，反应方程式为：
(NH4)2SO4＋2NaOH＝2NH3＋2H2O＋Na2SO4 (2)
2NH3＋4H3BO3＝(NH4)2B4O7＋5H2O (3)
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3 (4)
4．结果计算
(5)
式中：X—试样中蛋白质的含量（g/100g）；
V1—试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积（mL）；
V2—试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积（mL）；
V3—吸取消化液的体积（mL）；
c—硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）；
0.0140—1.0mL硫酸[c(1/2H2SO4)＝1.000mol/L]或盐酸[c(HCl)＝1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量（g）；
m—样品的质量（g）；
F—氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；纯乳与纯乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高梁为6.24；花生为5.46；大米为5.95；大豆及其粗加工制品为5.71；大豆蛋白制品为6.25；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30；复合配方食品为6.25。
三、注意事项：
1.本法不仅适用于固体样品检测，也适用于半固体样品与液体样品检测。半固体试样一般取样范围为
2.00g~5.00g；液体样品取样10.0mL~25.0mL（约相当氮30~40mg）。若检测液体样品，结果以g/100mL表示。
2.消化时，若样品含糖高或含脂及较多时，注意控制加热温度，以免大量泡沫喷出凯氏烧瓶，造成样品损失。可加入少量辛醇或液体石蜡，或硅消泡剂减少泡沫产生。
3.消化时应注意旋转凯氏烧瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，对样品彻底消化。若样品不易消化至澄清透明，可将凯氏烧瓶中溶液冷却，加入数滴过氧化氢后，再继续加热消化至完全。
4.硼酸吸收液的温度不应超过40℃，否则氨吸收减弱，造成检测结果偏低。可把接收瓶置于冷水浴中。
5.加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。
6.如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因
此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。
7.混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。
8.氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。
9.吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。
10.以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。
11.向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深蓝色的结合物[Cu(NH3)4]2+。
12.这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。
13.在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
14.以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，蛋白质含量≥1g/100g时，结果保留三位有效数字；蛋白质含量<1g/100g时，结果保留两位有效数字。