MTHFR 基因多态性与非综合征性唇腭裂的遗传易感性

◇论 著◇

M TH FR基因多态性与非综合征性唇腭裂的遗传易感性赵如冰1,刀京晶1,朱文丽1,闫丽盈1,李书琴2,苏　力2,李　勇1

【摘要】　目的　探讨M TH FR基因热敏感性多态性在非综合征性唇腭裂(N SCL P)发病以及遗传

易感性中的作用。方法　应用聚合酶链反应2限制性片段长度多态性(PCR2R FL P)方法检测M TH2

FR热敏感性基因型;对29个N SCL P核心家庭进行以父母为对照的病例对照研究,计算TD T和

HHRR;另外对该29例N SCL P患儿及其父母和58例正常儿童及其父母进行了成组病例对照研

究,分别计算M TH FR热敏感性纯合突变对N SCL P的比值比。结果　核心家庭分析显示TD T

(?2)=3.56,P>0.05,HHRR(成组?2)=1.69,P>0.05;患儿及其母亲、父亲M TH FR热敏感性

纯合突变对N SCL P的相对危险度OR值分别为0.72、1.11和0.75,P>0.05。结论　M TH FR

基因热敏感性多态性可能不是N SCL P的遗传易感性因素。

【关键词】　唇裂 遗传学;疾病易感性

【中图分类号】R782.21;R596.3　【文献标识码】A　【文章编号】100826013(2003)0120011203

A study on the a ssoc i a tion between M THFR gene poly m orph is m and NSCL P susceptibility　

ZHAO R u2b ing1,DAO J ing2jing1,ZHU W en2li1,YAN L i2ying1,L I Shu2qin2,SU L i2,L I Yong1.

　1.D ep a rt m en t of N u trition&F ood H y g iene,S chool of P ublic H ea lth,B eij ing U n iversity,B ei2

j ing　100083,Ch ina;2.S econd C lin ica l M ed ica l Colleg e,Ch inese M ed ica l U n iversity,S heny ang

　110003,Ch ina

【Abstract】　Objective　To investigate the effect of M TH FR thermo lab ile po lymo rph is m on ge2

netic su scep tib ility of N SCL P in no rth Ch ina popu lati on.M ethods　M TH FR geno types w ere de2

term ined by PCR2R FL P,29N SCL P nuclear fam ilies w ere analyzed th rough case2paren tal con tro l

study,from w h ich tran s m itted disequ ilib rium test(TD T)and hap lo type2based hap lo type relative

risk(HHRR)w ere calcu lated;29N SCL P cases and58con tro ls w ith their paren ts w ere analyzed

OR of homozygou sM TH FR.Results　①N uclear fam ily analysis show ed:TD T(?2)=3.56,P>

0.05,H H R R(paired?2)=1.69,P>0.05;②Homozygo tic m u tan t of M TH FR in cases vs con2

tro ls:OR=0.72(95%C I0.28～1.89),P>0.05and that in case mo thers vs con tro l mo thers:

OR=1.11(95%C I0.37～3.29),P>0.05;③T here w as no sign ifican t difference abou t the fre2

quency of m u tati onal allele betw een case paren ts and con tro l paren ts.Conclusion s　T hese resu lts

did no t indicate linkage disequ ilib rium in N SCL P nuclear fam ilies,no r did they indicate increased

risk fo r N SCL P among ch ildren and their paren ts homozygou s fo r the C677T geno type.

【Key words】　cleft li p genetics;disease su scep tib ility

(C h in J D is C on trol P rev2003,7(1):11213)

非综合征性唇裂伴或不伴腭裂(non2syndrom ic cleft li p and o r p alate,N SCL P)是指不伴发其他系统、器官畸形的、不在综合征之内的唇裂、唇裂合

【基金项目】国家重点基础研究发展规划“973”项目(编号: G1999055904)

【作者单位】1北京大学公共卫生学院营养与食品卫生学系,北京　100083

2中国医科大学第二临床医学院,辽宁沈阳　

110003

【作者简介】赵如冰(1968-),女,辽宁抚顺人,讲师,在读博并腭裂的总称,在我国它的发病率仅次于神经管畸形,居第二位。N SCL P的病因尚不明确,但越来越多的研究显示,其发生与环境、遗传及其相互作用有关,具有多基因遗传的特点,属于“遗传易感性”疾病1,2。孕妇叶酸缺乏 代谢障碍可能是其病因之一,因为有研究显示受孕早期增补叶酸可以部分预防N SCL P的发生3。5,102亚甲基四氢叶酸还原酶(M TH FR)是叶酸代谢循环中的关键酶之一,其作用是催化5,102亚甲基四氢叶酸还原成体内最主要的甲基供体:52甲基四氢叶酸。M TH FR基因C667T

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1

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疾病控制杂志2003年2月第7卷第1期

677CT T T时,都会导致酶活性不同程度的降低,最终诱发胚胎各种畸形发生(如N TD)。M TH FR基因C677T多态性是否为N SCL P的遗传易感性因素,到目前为止,国内外的各项相关研究还不能明确M TH FR基因与N SCL P的病因学关联。本研究的目的旨在应用分子生物学方法进行遗传流行病学研究,探讨M TH FR基因热敏感性多态性在N SCL P 遗传易感性中的作用。

1　材料与方法

1.1　研究对象和标本来源　N SCL P核心家庭标本由中国医科大学第二临床医学院采集,为来自辽宁省沈阳、清原、朝阳、阜新等市县的手术患者,共29例。其中男性16例,女性13例;含腭裂12例。唇裂8例,唇裂合并腭裂9例,并排除了其他系统畸形或综合征性内的唇腭裂病例,如N TD伴发的唇裂。对照核心家庭标本由辽宁省妇幼保健院采集,分别来自相同地区的正常儿童及其父母。共收集有效核心家庭标本67个,随机抽取58个。所有标本均为外周静脉血,保存于-20℃。

1.2　基因型检测　PCR2R FL P方法,引物设计及反应条件参照文献4(正链5’2T GA A GG A GA A GG T GT CT G CGG GA23’,负链5’2A GG A CG GT G CGG T GA GA G T G23’);DNA提取方法为快速盐吸法;PCR反应体系为10Λl,退火温度为56℃。基因型检测所用内切酶为H inf ,于37℃水浴3h,12%PA GE凝胶电泳后紫外灯下观察结果。

1.3　研究设计　利用核心家庭资料进行以父母为对照的1∶1配对病例对照研究(case2p aren tal con2 tro l study);以N SCL P患儿及其父母为病例、正常儿童及其父母为对照,进行成组比较的病例对照研究。

1.3　统计分析方法　①配对资料的M c N em er检验,计算传递失衡指数(tran s m itted disequ illib rium test,TD T);②按成组资料整理数据,计算单模单染色体相对危险度(hap lo typ e2based hap lo typ e rel2 ative risk,H H R R);③计算N SCL P患儿及其父母纯合突变的O R值,并进行显著性检验。

2　结果

2.1　M THFR基因扩增结果和基因型分析　M TH FR基因扩增目的片段为198bp,H inf 酶切后显示三种带型,仅出现198bp条带者为正常纯合子,出现198bp、175bp和23bp三条带者为杂合子,出现175bp和23bp两条带者为突变纯合子(图1)

。

图1　M THFR C677T基因型酶切分析结果

F igure1　Restr iction analysis for the M THFR677C→T. Geno types:+ +homozygous m utant,+ -heterozygous,- -homozygous w ild type

2.2　核心家庭分析　以患儿染色体等位基因为病例,以父母未遗传给患儿的一对等位基因为对照进行1∶1配对的病例对照研究(表1),按成组病例对照研究方法整理资料(表2)。

表1　M THFR基因与NSCL P的配对病例-父母对照研究(a) Table1　Pa ired case-paren tal con trol study(a)

A llele that parents couldn’t

trans m it to the offsp ring

A llele of N SCL P

+-

+205

-1320　

TD T(?2)=3.56,P>0.05

表2　M THFR基因与NSCL P的成组病例-父母对照研究(b) Table2　Case-paren tal con trol study between groups(b)

A llele

M utati onal N o rm al

To tal

A llele parents trans m itted

to the offsp ring

322658

A llele parents couldn’t

trans m it to the offsp ring

253358

To tal5759116　OR=1.63,95?C I=0.78～3.38;H H R R(?2)=1.69,P>0.05

2.3　NSCL P患儿与正常儿童基因型的比较　29例患儿中纯合突变10例,占总例数的34.5%;杂合突变12例,占41.4%;野生基因型7例,占24.1%。纯合突变频率与正常对照组的27.6%相比,差异无显著性(P>0.05)(表3)。

表3　NSCL P患儿与对照M THFR基因型构成的比较

Table3　D istr ibution of M THFR genotypes

i n NSCL P cases and con trols

Geno type

W ild type

(%)

H eterozygous

type(%)

Homozygous

type(%)

To tal

(%)

N SCL P cases7(24.1)12(41.4)10(34.5)29(100.0) Contro ls12(20.7)30(51.7)16(27.6)58(100.0) OR=0.72,95?C I=0.28～1.89;P>0.05

2.4　NSCL P患儿父母与正常儿童父母基因型的比较　分别比较病例组和对照组母亲和父亲基因型构成比,均未见差异有显著性(P>0.05)。两组间父亲和母亲基因型构成比的差异不显著(表4)。

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2

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?Ch in J D is Con trol P rev　2003　Feb;7(1)

表4　NSCL P患儿父母与对照父母M THFR基因型构成的比较Table4　D istr ibution of M THFR genotypes i n paren ts of

NSCL P cases and con trols

Geno type

W ild type

(%)H eterozygous

type(%)

Homozygous

type(%)

To tal

(%)

N SCL P mo ther8(27.6)15(51.7)6(20.7)29(100.0) Contro ls mo ther11(19.0)34(58.6)13(22.4)58(100.0) N SCL P father7(24.1)14(48.3)8(27.6)29(100.0) Contro ls father13(22.4)32(55.2)13(22.4)58(100.0) N o te:mo ther:OR=1.11(95%C I0.37～3.29),P>0.05;father:OR=0.75 (95%C I0.27-2.11),P>0.05

2.5　病例组和对照组父母总突变等位基因频率的比较　从表5可见,N SCL P父母突变等位基因频率为49.1%,对照组为50.9%,二者差别经检验无显著性(P>0.05)。

表5　病例组与对照组父母突变等位基因频率的比较

Table5　Frequency of mutan t allele i n paren ts of cases and con trols

M utational allele Father M other Total N umber of chro2

mosome(2N)

Frequency of muta2

tional allele(%)

Parents of N SCL P30275711649.1 Parents of controls5860118　23250.9

Z test,P>0.05

3　讨论

我国N SCL P发生率较高(约1.7%),但目前国内对于N SCL P易感基因及其与环境暴露因素、其他基因之间交互作用的研究非常少。人群干预实验研究证实妇女孕前后期增补叶酸可以降低新生儿唇腭裂的危险性,M TH FR是叶酸代谢的关键酶,因此有理由怀疑M TH FR基因多态性与N SCL P也存在病因学关联。本次研究对29个N SCL P核心家庭计算了“传递失衡系数”(TD T)和“单模单染色体相对危险度”(H H R R),其统计量双侧检验P 值均大于0.05。这一结果表明,M TH FR第677位核苷酸突变等位基因(T)在N SCL P核心家庭中不存在遗传失衡现象。本研究进一步对该29例N SCL P患儿的外周血标本进行M TH FR C677T 基因型的检测,同时选择与病例来自于同一地区的58个正常儿童作为对照,相对危险度为0.72(P> 0.05);单独分析患儿及对照儿童父亲和母亲的基因型,结果显示差异均无显著性(P>0.05);将父母双方合在一起分析,结果患儿父母与对照儿童父母的总突变等位基因频率差异无显著性(49.1%vs 50.9%,P>0.05)。上述研究结果说明,M TH FR C677T基因多态性可能不是N SCL P的遗传易感性因素。

国外在该方面的研究也很有限,且结果并不一致;总的来说,阳性结果少而阴性结果较多5～7,而且M artinelli等7的研究结果虽然提示母亲M TH2 FR纯合突变与生育N SCL P儿有关,但对N SCL P核心家庭的分析未发现突变等位基因的遗传失衡现象。M unger等1曾在夏威夷这个民族聚居的地方,对不同民族的N SCL P进行分析,发现其发生存在种族差异,来自不同国家的报道也证实了这一点。提示N SCL P的发生存在遗传背景的差异。最近普遍的观点认为,N SCL P的遗传方式复杂,可能存在不同基因、不同位点以及其与环境因素的交互作用,即其发病受多遗传基因的调控。M TH FR是否参与N SCL P的发病,它参与作用的机制和途径如何,它是否与其他叶酸代谢相关基因多态性位点存在交互作用,对这些问题的深入研究将有助于揭示叶酸代谢相关基因与N SCL P的病因学关系。

本次研究所采集的病例均来自中国东北地区,不能代表全部中国人的情况。因为包括M TH FR在内的大部分基因多态性在不同国家、同一国家不同地区、同一地区不同种族人群都存在差异,在以后的研究中应扩大样本量,尽量排除种族、地区及环境等的影响因素,以进一步阐明该多态性位点与N SCL P的关系。

【参考文献】

1　M unger R G,L idralA C,Basart AM,et al.T heM sx21hom e2 obox gene and risk of iso lated o rofacial clefts:an effect modi2

fied by m aternal vitam in use[J.A m J Ep id e m iol,1995,141

(S):74.

2　Chenevix2trench G,Jones K,Green A C,et al.C left w ith o r w ithout cleft palate:associati ons w ith transfo rm ing grow th

facto r alpha and retino ic acid recep to r loci[J.A m J H um

Genet,1992,51(5):1377.

3　Itikala PR,W atk ins M L,M ulinare J,et al.M aternal m ulti2 vitam in use and o rofacial clefts in offsp ring[J.T eratology,

2001,63:79286.

4　F ro sst P,B lom HJ,M ilo s R,et al.A candidate risk facto r fo r vascular disease:a common m utati on in m ethylene2

trahydrofo late reductase[J.N atu re Genet,1995,10:1112

113.

5　P resco tt N J,W inter RM,M alco l m S.M aternal M TH FR geno type contributes to the risk of non2syndrom ic cleft li p and

palate[J.J M ed Genet,2002,39(5):3682377.

6　B lanto SH,Ko lle BS,H ech t JT,et a l.N o evidence suppo rt2 ing M TH FR as a risk facto r in the developm ent of fam ilial

N SCL P[J.A m J M ed Genet,2000,92(5):3702371.

7　M artinelli M,Scapo li L,Pezzetti F,et al.C667T variant fo rm at the M TH FR gene and CL P:a risk facto r fo r mo thers

[J.A m J M ed Genet,2001,98(4):3572360.

(收稿日期　2002207229)

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疾病控制杂志2003年2月第7卷第1期