大鼠脑缺血模型及缺血再灌注模型

大鼠脑缺血模型及缺血再灌注模型
大鼠脑缺血模型及缺血再灌注模型

线栓法大鼠脑缺血再灌注模型(MCAO)制备方法.pdf

线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备 前言 相信不少神经内科的研究生都作过或将要作大鼠线栓模型,都有一个从查文献了解方法到跟师兄、师姐学习再到自己体会摸索直至熟练的过程,在模型制作的过程中可能的经历了从模型不成功的郁闷到熟练后成功的喜悦(我们是有这样的感觉)。为了缩短各位将要作或刚开始作MCAO模型的战友的摸索过程,提高模型制作的成功率,我们愿意将自己的经验与大家分享,相信各位战友看过后将对制作大鼠线栓模型有更深的认识,并以其为乐趣,同时欢迎各位熟练的战友与我们交流经验。 第一部分线栓模型制备理论及经验 ⒈ 插线法局灶性脑缺血模型简介 八十年代 Koizumi 和 Longa 创用了不开颅的大鼠 MCA 可逆性脑梗塞模型,此后,应用插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的方法不断改进和完善,已渐趋成熟,目前该法已逐渐取代开颅法而成为最流行的方法。该模型先阻断颈外动脉(ECA)及其分支,且阻断翼腭动脉(PPA),以切断颅外来源的侧副循环血流。从 ECA 插入尼龙线,经颈内动脉(ICA)到 大脑前动脉(ACA),机械性阻断大脑中动脉(MCA)发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线,恢复血流,实现再灌注。 1994 年 Huang 等[55]首次将线栓技术应用于小鼠局部永久性脑缺血模型。1997 年 Hara 等[56]将线栓技术改进后应用于小鼠局部暂时性脑缺血模型。此后不断有学者借助于显微技术和多功能生理监测手段建立小鼠局部线栓脑缺血模型[57,58]。国内蒋晓帆等[59],王芙蓉等[60] 也对该方法进行了研究。线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点,用于研究神经元 对缺血的敏感性、耐受性,药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想,同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点,适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素,可避免实验结果的不稳定性。但线栓造模也并非完美无缺,存在着下列不足:①线栓造模过程是非直视下的手术,血流是否完全阻断不能即刻得知。②动物品系、体重、批次会影响结果。动物饲养条件好的单位所繁育的动物,可以使影响程度降低。③操作者的科研训练影响结果。严格的训练和足够例数的实践可以复制出稳定的结果。④血管破裂出血。操作不小心极易刺破血管或拔线栓时引起出血。轻柔、精细的操作可以减少血管破裂的发生。

大鼠急性脑缺血及缺血再灌注中ERK5的表达情况

大鼠急性脑缺血及缺血再灌注中ERK5的表达情况 发表时间:2016-05-16T16:45:56.270Z 来源:《医药前沿》2016年4月第10期作者:谭中旭1 宋玉强(通讯作者)2 吕敬雷3 于力群1 [导读] 1青岛大学医学院山东青岛 266021) 2青岛大学医学院附属医院神经内科山东青岛 266003) (3青岛大学医学院附属医院神经功能检查科山东青岛 266003) 治疗急性脑缺血患者的最佳办法是能及时恢复脑组织血液供应, 然而恢复血流灌注给脑组织带来新的损伤, 即缺血再灌注损伤。 谭中旭1 宋玉强(通讯作者)2 吕敬雷3 于力群1 时圣桂1 (1青岛大学医学院山东青岛 266021) (2青岛大学医学院附属医院神经内科山东青岛 266003) (3青岛大学医学院附属医院神经功能检查科山东青岛 266003) 【摘要】目的:观察大鼠脑皮质中细胞外信号调节激酶5(ERK5)在缺血及缺血再灌的不同表达,探讨其在脑缺血再灌注损伤中的意义。方法:采用线栓法建立大脑中动脉闭塞( MCAO) 模型,所有大鼠随机分为假手术组、缺血梗死组和缺血再灌组。对各组大鼠行神经功能评分,TTC染色测定脑梗死体积,免疫组织化学法测定ERK5表达。结果:缺血再灌注组大鼠的神经功能缺损和脑梗死体积均比缺血梗死组大鼠严重。ERK5在缺血梗死组和缺血再灌组都表达,后者明显多于前者。结论:ERK5可能参与脑缺血再灌注损伤过程并起着重要作用。 【关键词】脑缺血;缺血再灌注损伤;细胞外信号调节激酶5(ERK5);表达 【中图分类号】R742 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752(2016)10-0172-02 Expression of ERK5 in rats cortex afer cerebral ischemia and reperfusion TAN Zhongxu1,SONG Yuqiang2,LV Jinglei3,YU Liqun1,SHI Shenggui11Qingdao University Medical College,Qingdao 266021,China.2Department of Neurology,the Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003,China .3 The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China 【Abstract】Objective To observe the different expression of ERK5 in rats cortex in response to cerebral ischemia and ischemia/reperfusion, and investigate the significance in ischemia/reperfusion injury.Methods Blocking middle cerebral artery with intraluminal thread was used to build cerebral middle artery infarction model ( MCAO).All rats were randomly divided into sham operation group,ischemia groupand ischemia/reperfusion (I/R)group.The Longa score was used to evaluate revived rats and TTC staining was used to determine the infarct volumes.we investigated the activation and expression of ERK5 by immunohistochemistry.Results 24 hours after MCAO, neurological function scores were significant increased in I/R group compared with ISCH group. the infarct volume was in I / R group was larger.The activation of ERK5 was rapidly induced by ischemia, and I/R group were significantly higher than Ischemia group.Conclusion We hypothesize that ERK5 might participate in the pathogenesis of isehemic/reperfusion and play an important effect during ischemia/reperfusion injury. 【Key words】 Cerebral ischemia ;Ischemia/reperfusion injury; Extracellular signal regulated protein kinase(ERK5); Expression 1.前言 治疗急性脑缺血患者的最佳办法是能及时恢复脑组织血液供应, 然而恢复血流灌注给脑组织带来新的损伤, 即缺血再灌注损伤。目前研究证明,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)参与脑缺血再灌注损伤的过程[1]。其中,细胞外信号调节激酶5(ERK5)是新发现的成员[2]。本实验通过采用线栓法构建大脑中动脉闭塞(MCAO) 模型,观察大鼠脑皮质ERK5在缺血及缺血再灌24h 的不同表达情况,探究其在缺血再灌损伤中的可能作用。 2.材料与方法 2.1 动物 选择8周龄成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只,体重220~260g, 由青岛市药物检验所实验动物中心提供。实验前将动物置于实验室1周适应环境,均自由饮水、进食,实验室室温(25±2)℃,相对湿度65%,自然光照。 2.2 方法 2.2.1动物模型的建立和分组大鼠制备局灶性脑缺血再灌注模型,采用Zea-Longa等的大脑中动脉线栓法[3]。具体步骤如下:采用2.0鱼线为栓线,以10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉,仰卧固定,分离并暴露右侧颈总动脉(common carotid artery,CCA)、颈内动脉(internal carotid artery,ICA)和颈外动脉(external carotid artery,ECA),结扎并切断ECA及其分支,沿根部结扎ICA颅外分支翼腭动脉。由ECA残端插入一根鱼线,沿ECA、CCA分叉部和ICA轻轻推进,至ICA颅内分叉处时可阻断流入大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)的血流,进线长度为18~20mm。假手术组大鼠只暴露动脉,不进行插线操作。所有麻醉大鼠苏醒时间要求在术后2小时之内,未苏醒者剔除。待神经功能评分后,将符合实验要求的大鼠(即建模成功)随机分为缺血再灌组(I/R组)和缺血梗死组(ISCHE 组)。缺血再灌组:大脑中动脉阻闭2h后,抽出约10mm鱼线,恢复血流灌注24h;缺血梗死方法:大脑中动脉阻闭2h后不拔鱼线,继续阻塞24h。最后心脏灌注取脑,用4%的多聚甲醛灌注固定,制备石蜡切片。 2.2.2神经功能评分和脑梗死体积的测定参照Zea-Longa[3]、谢惠芳等[4]TTC染色法分别进行神经功能评分和测定脑梗死体积。 2.2.3免疫组织化学法(SABC法)检测ERK5蛋白表达石蜡切片脱蜡至水,0.01M PBS溶液洗2min×3次;3%H202室温lOmin灭活内源性酶;微波修复抗原;滴加5%BSA封闭液,室温孵育20min;滴加羊抗大鼠ERK5单克隆抗体(1: 200),4℃过夜;滴加生物素化二抗,37℃反应30min;用SABC免疫组化试剂盒染色,DAB显色。所有切片均在同一放大倍数下进行观察,每张切片先在低倍镜下随机选择梗死灶周围区4个象限视野,然后在高倍镜下(400倍)选择缺血灶周围5不连续的视野观察,计数阳性细胞,取其平均值。 2.3 统计学处理 采用SPSS 18.0软件包进行统计处理,数据均采用均值±标准差(x-±s)表示,各组间差异比较用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。 3.结果 3.1 神经功能评分和梗死体积测定

脑缺血再灌注损伤治疗的研究进展

脑缺血再灌注损伤治疗的研究进展 向军 同济大学医学院,上海(200433) E-mail: Chelsea_JX@https://www.360docs.net/doc/456680731.html, 摘要:缺血性脑血管是现代社会致死致残的最主要疾病之一,其治疗原则及时恢复缺血区的血液再灌注,而随之而来的再灌注损伤又成为一大难题。笔者对近年来脑缺血再灌注损伤的治疗研究综述如下。 关键词:脑缺血再灌注损伤;治疗;进展 缺血性脑血管病是现代社会致死、致残的最主要疾病之一,其治疗原则是及时的恢复缺血区的血液灌注。然而在某些情况下缺血后再灌注不仅没有使组织功能恢复,反而使缺血所致的功能障碍和结构破坏进一步加重,这种现象即缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury),抑制再灌注损伤已成为缺血性中风治疗的重要环节。近年来针对脑缺血再灌注损伤的治疗研究取得一定成果,现将其综述如下。 1.自由基研究 自由基(free radical)是外层轨道上有单个不配对价电子的原子、原子团和分子的总称,其化学性质极为活波,可与各种细胞成分(膜磷脂、蛋白、核酸)发生反应,导致细胞功能障碍和结构破坏。在脑缺血再灌注时,机体的自由基产生和清除系统遭到破坏,导致大量自由基的存在,造成脑组织损伤和功能障碍。由于再灌注治疗窗十分短暂(仅1-3小时),因此清除自由基应在再灌注前或者再灌注早期即开始。 自由基的清除主要靠自由基清除剂,包括酶性自由基清除剂,如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、Prion蛋白(PrPc)等;低分子自由基清除剂,如维生素C、维生素E、谷胱甘肽等;其他如甘露醇、糖皮质激素等。 有研究表明,褪黑素(Melatonin MT)能够清除羟自由基、过氧亚氮阴离子、降低单线态氧毒性和自由基引起的脂质过氧化反应,是有效的自由基清除剂和间接抗氧化剂,具有较好的神经元保护作用[1-2]。Cesario等[3]通过体内外实验观察发现,褪黑素的减轻脑缺血再灌注损伤作用,还与其对胶质细胞的保护作用有关,且胶质细胞对治疗比神经元更敏感。别嘌呤醇是黄嘌呤氧化酶抑制剂,通过阻止次黄嘌领转化为黄嘌呤,进而阻断自由基的产生。Allport等[4]的实验证明别嘌呤醇能够减少大鼠脑缺血再灌注模型的梗死面积和比率,对脑缺血和再灌注引起的脑损伤都具有保护作用。EGB761是银杏叶提取物的标准制剂,其主要活性物质是24%黄酮苷和6%萜烯内酯,具有较好的抗氧化作用。A. Ur′?kov等[5]的实验证明EGB761能够抑制脑缺血再灌注时的脂质过氧化反应,减轻自由基氧化作用对大鼠前脑的损害。 2.钙超载研究 脑缺血再灌注时,ATP供应不足、N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体过渡兴奋介导与其偶联的钙通道开放、细胞膜通透性增大以及Na- Ca2+交换异常等因素导致细胞内游离钙([Ca2+]i)浓度升高。细胞内钙超载一方面使血管收缩,进一步加重脑缺血缺氧;另一方面引起细胞结构和功能的破坏,导致细胞死亡。[Ca2+]i浓度升高既是脑损伤的后果,同时又是

线栓法大鼠脑缺血再灌注模型的制备

线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究 马贤德1孙宏伟1 柴纪严1 赵金茹1 (1 辽宁中医药大学,辽宁沈阳 110032;) 摘要①目的建立一种比较系统,操作简单,成功率高的大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注动物模型,达到只要读者根据本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型的目的。 ②方法成年健康雄性 SD大鼠40只,参照Longa法并适当改进建立MCAO模型20只,假手术组20只。本文将详细叙述手术过程以及再灌注时间点的合理选择。最后利用行为学测试、四氮唑(TTC)染色对模型成功与否进行判定。③结论线栓法是一种操作简单的制备MCAO 再灌注动物模型的方法,并且此方法的再灌注效果较为明显。 关键词动物模型;脑缺血;再灌注;线栓法 Establishment a model of rat ischemia-reperfusion injury with intraluminal suture Ma Xian-de1 Sun Hong-wei1 Chai Ji-yan1 Zhao Jin-ru1 (1.Liaoning University of Chinese Traditional Medicine, Shenyang, 110032) Abstract: Objective To establish a model of rat ischemia-reperfusion injury, in terms of the model, the operation will be simple, and the achievement ratio will be high. Methods: 40 Male Sprague-Dawley ( SD ) rats were separated into two groups randomly: 20 were model of rat ischemia-reperfusion injury based on Longa method, and the other 20 were sham-operated group. The process of the operation and the selection of different time point following ischemic-reperfusion were discussed in the paper. What’s more , the model was appraised by behavioral test and Triphenyl Tetrazolium Choloride(TTC)Staining. Conclusion: The operation of intraluminal suture method is very simple for the establishment of model of rat ischemia-reperfusion, what’s more, the effect of reperfusion is very obvious. Key words: Animal Model, ischemia, reperfusion, intraluminal suture 脑缺血再灌注动物模型是研究缺血性脑血管病的一条重要途径,因为脑缺血再灌注动物模型具有很好的重复性并能最大程度模拟人类缺血性卒中的发生。早在1986年,日本学者Koizumi发明了线栓法制备局灶性脑缺血大鼠模型。1995年,我国也出现了相关的报道。目前人们比较公认的是Longa等建立的大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注动物模型。国内一些学者对此方法又进行了改进,但仍存在一些问题,例如:手术操作过程复杂,实验动物死亡率较高,而模型成功率较低,并且在所发表的文章中普遍存在一个缺点,就是对该模型的制作过程描述得过于简单,读者往往不能按照此类文献完成模型的制备工作。本文旨在前人研究的基础上,建立一种操作简单,成功率高的 MCAO再灌注模型,并将此方法图文并茂的展现给读者,使读者只要根据本文所述的方法操作就能制作出MCAO再灌注模型。 1 材料与方法 1.1 实验材料、动物及分组健康雄性SD大鼠40只,体重280-320g,由辽宁中医药大学实验动物中心提供。随机分为模型组和假手术组,每组20只。四氮唑红(TTC)染料,由沈阳市博尔美试剂公司提供。 1.2 栓塞线的制备栓塞线采用 2.5号钓鱼线,直径0.25-0.28mm。将其剪成4cm长,一端用细砂纸打磨成半球形(需在显微镜下筛选),再用记号笔分别在距打磨端0.6cm处、1.8cm

脑缺血再灌注损伤机制及治疗进展

脑缺血再灌注损伤机制及治疗进展 西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科710004 薛荣亮 脑缺血一定时间恢复血液供应后,其功能不但未能恢复,却出现了更加严重的脑机能障碍,称之为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIR)。 脑缺血再灌注损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关。急性局灶性脑缺血引起的缺血中心区死亡以细胞坏死为主,目前认识的比较清楚,即脑缺血后5-7分钟内,细胞能量耗竭,K+通道受阻,膜电位降低,神经末梢释放谷氨酸,通过兴奋谷氨酸受体(包括NMDA 、AMPA和KA 受体)致使细胞膜上的Ca2+通道开放,引起Ca2+超载,高Ca2+可激活NOS,使NO和氧自由基的形成增加,引发脂质过氧化,引起膜结构和DNA的损伤;Ca2+还可活化各种酶类,加剧细胞损伤和能量障碍,引发缺血级联反应,结果细胞水肿、细胞膜破裂,细胞内酶和炎性介质释放,引起细胞坏死。 近年来认识到半暗带区域于再灌注数天后出现了迟发性神经元死亡(DND),DND常出现在缺血再灌注后2-4日,主要发生在海马、纹状体及皮质区域,DND需要数日时间、有新蛋白质合成的、需要消耗能量的、为无水肿的细胞自杀过程,称之为细胞凋亡(PCD)。脑缺血再灌注损伤既包括急性细胞坏死也包括细胞凋亡,对于DND的确切机制目前仍不清楚,尚需进一步深入研究。 现对脑缺血再灌注损伤机制的研究进展及保护措施简述如下:1.基因活化 脑缺血再灌注损伤后可出现大量基因表达,大约有374种基因出现

变化,绝大多数基因与凋亡有关,其中57种基因的蛋白表达是缺血前的 1.7倍,而34种基因的表达量出现下降,均发生在4小时到72小时, 包括蛋白质合成,基因突变,促凋亡基因,抑凋亡基因和损伤反应基因变化等,这些基因的相互作用最终决定了DND的发生。 2.兴奋性氨基酸毒性 兴奋性氨基酸毒性是指EAA受体活化而引起的神经元死亡,是脑缺血性损伤的重要触发物和介导物。EAA可活化胞内信号转导通路,触发缺血后致炎基因表达。CA1区神经细胞分布着大量的EAA受体,而抑制性氨基酸受体分布很小,这就为缺血后的兴奋性毒性提供了基础。另外,CA1区较CA3区对缺血损伤敏感是由于其兴奋性氨基酸受体的类型不同,CA1区以NMDA受体为主,CA3区以KA受体为主,而KA 受体对缺血敏感性较差,可能是造成DND发生的重要原因。 3.自由基及脂质过氧化 脑缺血再灌注期间产生大量自由基。其有害作用可概括为:①作用于多价不饱和脂肪酸,发生脂质过氧化。②诱导DNA、RNA、多糖和氨基酸等大分子物质交联,交联后的大分子则失去原来的活性或功能降低。③促使多糖分子聚合和降解。自由基可广泛攻击富含不饱和脂肪酸的神经膜与血管,引发脂质过氧化瀑布效应(oxygen burst),蛋白质变性,多核苷酸链断裂,碱基重新修饰,细胞结构的完整性破坏,膜的通透性、离子转运、膜屏障功能均受到严重影响,从而导致细胞死亡。自由基还能导致EAA释放增加,促使脑缺血后DND发生。 4.热休克蛋白表达紊乱 热休克蛋白是在多种应激原的作用下生成的分子量为7-200KD的

Sec22b及Ykt6在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用机制研究

Sec22b及Ykt6在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用机制研究中文摘要 Sec22b及Ykt6在大鼠脑缺血再灌注损伤中的 作用机制研究 中文摘要 第一部分Sec22b及Ykt6与脑缺血再灌注的相关性研究目的:研究大鼠脑缺血再灌注(MCAO/R)后脑组织中Sec22b及Ykt6的蛋白表达水平及其分布的变化。 方法:①随机选取30只SD大鼠分为以下5组:假手术组、MCAO/R后6h、12h、24h、48h,每组6只大鼠。所有大鼠均在脑组织缺血再灌注后相应时间点被处死。取大鼠脑梗侧脑组织,通过Western blot分析及免疫荧光技术来检测Sec22b及Ykt6的蛋白水平及分布情况。②培养大鼠原代神经元细胞,随机分为以下5组:正常对照组、OGD/R后6h、12h、24h、48h。所有神经元细胞均在氧糖剥夺再灌注后相应时间点固定细胞,通过Western blot分析及免疫荧光技术来检测神经元内Sec22b及Ykt6的蛋白水平及分布情况。 结果:1、大鼠脑缺血再灌注后脑组织内的Sec22b水平呈先上升后下降的变化,以MCAO/R后24h组Sec22b蛋白水平上升最为显著(P<0.01);而Ykt6水平呈逐渐下降趋势,在所研究的时间点内以MCAO/R后48h组Ykt6蛋白水平下降至最低(P <0.05)。2、神经元氧糖剥夺再灌注后神经元内的Sec22b水平同样呈先上升后下降的变化,以OGD/R后24h组Sec22b蛋白水平上升最为显著(P<0.01);而Ykt6水平同样呈逐渐下降趋势,在所研究的时间点内以OGD/R后48h组Ykt6蛋白水平下降至最低(P<0.05)。3、体内免疫荧光结果显示Sec22b在脑缺血再灌注后24h细胞内的定位明显升高;体外免疫荧光结果显示氧糖剥夺再灌注后24h神经元细胞内Sec22b 主要聚集在神经元轴突的末梢。 结论:MCAO/R后Sec22b的表达水平明显升高,并且主要积聚在神经元轴突的末梢;而Ykt6的表达水平呈逐渐下降趋势。 关键词:脑缺血再灌注;氧糖剥夺再灌注;Sec22b;Ykt6。 I

Removed_大鼠急性心肌缺血模型制备详细图解

模型的背景,心肌缺血模型分全心缺血和左心室缺血两种,全心缺血主要靠注射药物(如异丙肾上腺素等),左心室缺血主要靠手术对动物的冠状动脉左降支进行紧扎实现。由于左心室缺血对临床的意义更大,所以研究心肌缺血药物时这个模型是必须的。 (1)术前12小时给动物禁食 (2)将动物注射10%水合氯醛(0.4mL/100g)麻醉后固定在手术台上 (3)用笔型静脉置留针进行气管插管,插好后可用手术刀柄靠近气管,如果见气雾,就证明成功,连接动物呼吸机,参数为:呼吸频率85;呼吸比1:1;潮气量为18ml (4)胸部被毛、酒精棉消毒,在胸部左侧3~4肋间剪开皮肤,如图1 (5)分离肌肉露出肋骨,切口位置有两块肌肉,胸浅肌和胸深肌,注意按照肌肉的纹路分离可以避免将肌肉扯烂,如图2

(6)在第三根肋骨下用止血钳将肌肉分离开,然后左手用止血钳挑住肋骨,右手持剪刀剪开第三根肋骨,如图3

(7)用止血钳将剪断的肋骨夹住掰开,放入开睑器,用止血钳剥离心包膜,如图4

(8)用止血钳将胸腺(心脏上面白的像脂肪一样的东西)夹住拉出,如图5 (9)在左心耳与肺动脉圆锥间穿6~0号线,拉紧丝线,形成心肌缺血,观察线扎紧的部位上下大约2mm范围的心肌是发白色的,如图6

(10)闭合胸腔,注意将胸腔内的空气挤出(这点非常关键,这个模型最容易失败导致大鼠死亡的就是这个地方),对肌肉和皮进行缝合,挤空气的手法如图7

(11)结扎术后6小时可进行TTC染色:将大鼠脱颈处死,打开胸腔,将心脏剪下,用生理盐水将心脏清洗干净并排出心脏内的淤血,沿冠状沟将心房切除留下心室,用刀片将心脏切成1mm厚的切片,放入0.1%的TTC磷酸盐缓冲液(pH 7.4)37℃水浴7~10分钟,取出切片用生理盐水冲洗数次,观察结果。非梗死区因脱氢酶还原TTC而呈红色,梗死区因脱氢酶流失而呈白色,将梗死区和非梗死区分离并分别称重,梗死范围以梗死心肌占缺血心肌重量的百分比表示。下图是染色的结果,图8 结扎位置,梗死的地方其实肉眼大致能看出,和其他地方相比发白,图9:

线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备方法-图文并茂

线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备方法 Pipilulu 目录: 第一部分线栓模型制备理论及经验 1插线法局灶性脑缺血模型简介 2大鼠颈部及颅内动脉解剖及常用插线位置 3大鼠大脑中动脉阻断实验的总结和心得(zhuqing0506战友) 4 也谈大鼠MCAO模型的实验体会(bladeflyer战友) 5 我的做MCAO模型的一些体会(intelligentwang战友) 6 线栓法大鼠脑缺血再灌注模型(MCAO)制备技巧(ysf2k战友)第二部分线拴模型制作过程(雨后天晴战友) 第三部分灌注取脑(pipilulu战友) 第四部分 TTC染色(pipilulu战友)

前 言 相信不少神经内科的研究生都作过或将要作大鼠线栓模型,都有一个从查文 献了解方法到跟师兄、师姐学习再到自己体会摸索直至熟练的过程,在模型制作 的过程中可能的经历了从模型不成功的郁闷到熟练后成功的喜悦(我们是有这样 的感觉)。为了缩短各位将要作或刚开始作MCAO 模型的战友的摸索过程,提高模型制作的成功率,我们愿意将自己的经验与大家分享,相信各位战友看过后将对制作大鼠线栓模型有更深的认识,并以其为乐趣,同时欢迎各位熟练的战友与我们交流经验。 第一部分线栓模型制备理论及经验 ⒈插线法局灶性脑缺血模型简介 八十年代Koizumi和Longa创用了不开颅的大鼠MCA可逆性脑梗塞模型,此后,应用插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的方法不断改进和完善,已渐趋成熟,目前该法已逐渐取代开颅法而成为最流行的方法。该模型先阻断颈外动脉(ECA)及其分支,且阻断翼腭动脉(PPA),以切断颅外来源的侧副循环血流。从ECA插入尼龙线,经颈内动脉(ICA)到大脑前动脉(ACA),机械性阻断大脑中动脉(MCA)发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线,恢复血流,实现再灌注。 1994年Huang等[55]首次将线栓技术应用于小鼠局部永久性脑缺血模型。1997年Hara 等[56]将线栓技术改进后应用于小鼠局部暂时性脑缺血模型。此后不断有学者借助于显微技术和多功能生理监测手段建立小鼠局部线栓脑缺血模型[57,58]。国内蒋晓帆等[59],王芙蓉等[60]也对该方法进行了研究。 线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点,用于研究神经元对缺血的敏感性、耐受性,药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想,同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点,适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素,可避免实验结果的不稳定性。但线栓造模也并非完美无缺,存在着下列不足:①线栓造模过程是非直视下的手术,血流是否完全阻断不能即刻得知。②动物品系、体重、批次会影响结果。动物饲养条件好的单位所繁育的动物,可以使影响程度降低。③操作者的科研训练影响结果。严格的训练和足够例数的实践可以复制出稳定的结果。④血管破裂出血。操作不小心极易刺破血管或拔线栓时引起出血。轻柔、精细的操作可以减少血管破裂的发生。

脑缺血模型评估

脑缺血模型分为全脑缺血和局灶性缺血模型两种。全脑缺血对于慢性脑缺血及一些特殊领域研究具有较高的价值,但因其对全身影响较大,梗死不稳定等缺点,并且,临床上的脑缺血患者通常为局灶性缺血,因此临床应用价值相对较低,目前应用相对较少。局灶性缺血与全脑缺血相比,可形成特定部位的脑梗死并进行再灌注,对全身影响较少,与人发病情况更相似,目前应用更为广泛。 全脑缺血模型 1 两血管阻断法:Ekloef 等(Ginsberget al.,1989)首先提出这种模型, 即关闭大鼠双侧颈总动脉(CCA), 同时降低血压。制造低血压有两种方法: 通过尾动脉放血降低血压, 使用降压药三甲噻方或酚妥拉明把血压降到50 mmHg (7.5 mmHg =1kPa)。其优点是操作简单方便;缺点是存在侧支循环, 缺血不完全, 血压的轻微波动会影响实验结果,低血压会严重干扰其他器官和组织的供血(李月玲et al.,1989)。该模型还不能再清醒动物进行, 无法进行神经行为的观察。可用来进行脑缺血后脑血流、神经递质的变化以及低温神经保护等,适合慢性期研究(张拥波et al.,2007)。在该法基础上改进可制作血管性痴呆模型,如高脂饲养加两血管阻断法(Tayebatis et al.,2004),两血管阻断加尾端放血降压法,两血管阻断加硝普钠降压法(Willams et al.,2007)。 2 三血管阻断法:最初由Kameyama 等(Kameyama et al.,1985)建立,方法为电凝切断基底动脉,并通过阻断与开放双侧颈总动脉,实现全脑-缺血再灌流。该法稳定性好,可通过阻断CCA 的时间长短来控制缺血程度,再灌注血流恢复迅速,模型成功率高,适合用于急性全脑缺血性损伤的研究。其缺点是手术难度稍大,且对周围组织牵拉严重,操作不当易造成动物死亡。被认为是迄今为止最理想的全脑缺血-再灌注动物模型。Yanamoto 等(Yanamoto et al.,2003)采用改良的三支动脉阻断法制作正常血压大鼠大脑皮层脑梗死模型,通过比较术后动物的生理参数,梗死灶体积等指标确定缺血性中风程度。 3 四血管阻断法:通过阻断双侧CCA 和双侧椎动脉实现 全脑缺血,最早在1979 年由Pulsinelli 等(Pulsinelli et al.,1979)建立。首先分离双侧CCA,放入套扣并外置备用,电凝或结扎双侧椎动脉,可根据实验需要经外置套扣阻断双侧CCA,并于一定时间后开放而实现再灌注。优点为可在清醒或麻醉状态下完成,制作过程与血管性痴呆的发病机理接近,缺血后生理指标稳

缺血性脑卒中的动物模型完整版

缺血性脑卒中的动物模 型 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

缺血性脑卒中研究中的动物模型 想要进行一项基础研究,动物模型必不可少。缺血性脑卒中研究如火如荼,动物模型也多种多样,有哪些常用的动物模型,以及它们各自的特点就成了研究人员在选择模型时十分关注的问题。 在缺血性卒中过程中,最终的梗死体积和神经功能预后受到多种因素的影响,例如缺血的持续时间、缺血的严重程度、侧枝循环、系统的血压以及梗死产生的原因和位置。此外,年龄、性别和相对复杂的药物遗传背景也会对其产生影响。因为卒中是如此复杂的一个疾病,因而动物模型也往往只能覆盖其中个别方面的特点。 虽然中风是一种复杂的疾病,但其存在一些共同的特点,这使得我们有机会用实验来模拟卒中的发生。缺血性脑卒中的一个重要特点是进展,这也解释了缺血半暗带的存在。当血流量降至基线值的15-20%以下时,只要几分钟就会产生不可逆的脑损伤核心,并且迅速相周围发展。其周围的脑组织血流减少得相对较轻,所以此时神经功能缺失而组织结构却是完整的。但如果脑血流不能恢复,那么这些所谓的半暗带组织就会被纳入梗死核心区。 最常用的一种模型是啮齿动物的线拴法大脑中动脉闭塞模型(MCA),方法是将普通的血管内缝线或特制的线拴放入大脑中动脉开口处,从而达到阻塞血管造成血流量减少的目的。这种方法的优点是:不需要开颅的手术,并且通过拔出线拴的方法还可以达到在特定时间再通血管的目的,虽然瞬间的血管开通与人体一般的病理生理过程相去甚远,但与近来应用越来越广泛的机械取栓治疗的病理过程不谋而合。因此,虽然在模型的制作上存在一些问题,但仍是目前最广受认可的一种脑卒中动物模型。 另一种常用的方法是用各种方式直接地闭塞血管,分为永久地闭塞血管(如凝断)和暂时闭塞血管(如结扎),但大多都需要开颅的手术操作。 使用内皮素-1(一种强血管收缩剂)可以诱导短暂的局灶性脑缺血,其产生的病灶可以分布于脑组织任何位置,常常被用于制作腔隙性梗死的模型制作。 光化学法是在系统给予荧光物质后,用可穿透颅骨的光线,激活特定脑区的荧光剂,从而达到局部梗死的目的。这种方法可以做到高度的可重复性,并且病灶可以相当局限。但缺点是这种方法制作的模型缺乏缺血半暗带,因而不能很好地模拟某些病理生理变化。 另外还有血栓栓子模型和栓塞微球模型,这两种方式与实际临床病理生理过程更为相近,但同时也有梗死位置变异性大,并且有不可预知的血管再通等问题。 尽管有如此众多的动物模型,但由于模式动物本身和人有诸多差异,在许多结构和功能上都不能完全模拟。随着对脑功能研究的进一步深入,这些简单的动物模型将不适用于许多高级神经功能的研究。诸如卒中后认知功能损伤、神经精神症状、抑郁、睡眠呼吸暂停等常见的卒中后并发症的研究均在不同程度上因为缺少有效的动物模型而受到阻碍。而这也将是卒中动物模型进一步发展所要解决的问题。 1. Sommer, . Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol133, 245-261 (2017).

大鼠脑缺血模型及缺血再灌注模型.docx

大鼠全脑缺血模型制备方法评价 二血管阻断法阻断双侧颈总动脉( common该法手术简便易于操作,成功 carotid artery , CCA )率高。 加动脉放血造成低血压而形缺点:仅形成不完全脑缺血, 成前脑缺血。若单纯结扎造成的低血压严重干扰其 双侧 CCA 而不降低血压,则他器官的血供及实验结果;不 难以使脑血流量( cerebral能在动物清醒状态下进 blood flow , CBF )降低至缺行,无法进行神经行为学的观 血和能量代谢紊乱的程度。察。因此,该模型对探讨 缺血性脑损伤的发病机制、评 价抗脑缺血药物的疗效 更有价值。 颅内加压法小脑延池内注入人工脑脊液, 使颅内压升高超过 动脉血压 2.7~9.3 kPa ( 1 kPa ≈0.133 mmHg ),同时给予 神经节阻滞剂三甲噻方,防止 颅内高压反射性引起高 血压。 颈部加压法麻醉动物,颈部套一止血带, 加压至 80~93 kPa,减 少脑血流量,造成脑缺血。 断头法断头造成全脑不可逆缺血,取 下脑组织冰冻贮存, 常用于生化和代谢分析。 低氧法结扎单侧 CCA 合并全脑缺 氧, PaO2 维持在 2.8 kPa。 由于脑部不是真正的缺血,采 用这一模型得到的结论 不适用于脑缺血,但可比较缺 氧与脑血流量减少引起 效应的不同。 胸内血管夹闭法开胸,夹闭左侧 CCA 、头臂 干、左侧锁骨下动脉,造 成全脑缺血。

大鼠局灶性脑缺血模型制备方法 栓塞法颈动脉注射血凝块栓复制栓 塞性脑卒中模型的 方法过去只用在中型体积动 物,现已在大鼠中应用。 Kudo 等[ 12]采用 <100 μ m 的同源血凝块栓悬液,注 入 CCA ,在颈外动脉(external carotid artery , ECA )的颈内 动脉( internal carotid artery , ICA )开口处置一可逆性插 管,栓子则由 ICA 进入 MCA , 导致同侧大脑皮层、海马、 深层灰质结构的梗塞。也有人 用碳素颗粒、花生四烯酸 钠作为栓塞剂制成脑梗塞模 型。评价 适于血栓形成过程的研究和 溶栓治疗 的观察,尤其是用人血凝块 栓塞法更具有应有价值。缺 点:①由于栓子的随机性,无法预测梗塞部位及大小;②侧支循环的影响使组织缺 血程度不一,不利于组织 定量分析。 开颅法Tamura 等[ 13]采用颞下部开颅法闭塞 MCA ,实验条件 开颅,分离近端 MCA ,电较恒定, 凝或用手术丝线结扎 MCA ,缺血效果可靠,是迄今应用最 造成脑梗塞,是目前公认广泛的经典性局灶脑缺 的标准 MCA 闭塞模型,以大血模型。缺点:需要开颅,创 脑皮层、尾状核缺血最明伤性大,闭塞血管后无法 显。进一步改进此方法,可通进行再灌性损伤研究。 过降低动脉血压以减少 伴行血管远近端分支对梗塞 区的血供,增大梗塞面积。其 中,Kader 改进电凝方法,闭 塞 MCA 所有可见分支, 梗塞效果好; Chen[ 14]等 采取鼻缝旁入路,制作了远端 MCA 合并同侧 CCA 永久性 闭塞,对侧 CCA 暂时性闭 塞模型。 光化学法曾报道, Watson 等首次建立此法适于研究抗血小板、抗血 了光化学法诱导脑皮栓形成 层梗塞的动物模型。立体定位药物和血管内皮细胞保护剂 仪固定大鼠头部,暴露颅的疗效;此种模型无须开 骨,尾静脉注射光敏材料荧光颅,动物存活时间长,适于慢 素,用 560 nm 波长的特性脑缺血研究;皮层梗塞 定光源照射局部头颅,光线透部位可任意选择,为皮层功能 过颅骨与血管内的染料定位研究提供了条件。缺 接触,激发光化学反应,引起点:与人类常见的脑栓塞存在

RGMa对大鼠脑缺血再灌注损伤后血管再生的影响及机制探讨

目录 英汉缩略语名词对照 (1) 中文摘要 (2) 英文摘要 (6) 论文正文:RGMa对大鼠脑缺血再灌注损伤后血管再生的影响及机制探讨 (11) 前言 (11) 第一部分RNA干扰RGMa对大鼠脑缺血再灌注损伤后血管再生的影响 (14) 1材料与方法 (14) 2结果 (20) 3讨论 (23) 第二部分RGMa对大鼠脑缺血再灌注损伤后血管再生影响的相关机制 (25) 1材料与方法 (26) 2结果 (30) 3讨论 (34) 全文总结 (36) 参考文献 (37) 附图 (41) 文献综述 (44) 致谢 (52) 硕士期间撰写及发表的论文 (53) 万方数据

重庆医科大学硕士研究生学位论文 1 英汉缩略语名词对照 英文缩写 英文全称 中文全称 Ang BDNF CCA DAPI ECA EDTA FAK HUAEC I/R ICA MCAO NVU PBS PVDF rAd RGMa RNAi SDS-PAGE TBST VEGF angiopoietin brain derived neurotrophic factor common carotid artery 4’,6-diamidino-2-phenylindole external carotid artery ethylene diamine tetraacetic acid focal adhesion kinase human umbilical artery endothelial cells ischemia/reperfusion internal carotid artery middle cerebral artery occlusion neurovascular unit phosphate buffer solution polyvinylidine difluoride recombinant adenovirus repulsive guidance molecule a RNA interference sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis tris buffered saline with tween vascular endothelial growth factor 血管生成素 脑源性神经营养因子 颈总动脉 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 颈外动脉 乙二胺四乙酸 黏着斑激酶 人脐动脉内皮细胞 缺血再灌注 颈内动脉 大脑中动脉阻塞模型 神经血管单元 磷酸盐缓冲液 聚偏二氟乙烯膜 重组腺病毒 排斥导向分子a RNA 干扰 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 洗膜缓冲液 血管内皮细胞生长因子 万方数据

最新1建立全脑缺血再灌注动物模型的实验研究进展汇总

1建立全脑缺血再灌注动物模型的实验研 究进展

医学院检验系,广东广州510182;2.广州医学院第一附属医院,广东广州510120) 【关键词】全脑缺血再灌注动物模型实验研究进展 心脏骤停(CA)是急诊医学常见的急症之一,因其居高不下的致死率及致残率给社会和家庭造成严重威胁,所以心肺脑复苏是现代医学研究的热点课题。心搏骤停是指心跳及呼吸突然停止,血液循环终止。由于脑细胞对缺氧十分敏感,循环停止4~6 min脑组织即可出现不可逆性损害[1]。面对突如其来的心脏骤停,目前最有效的治疗方法是心肺复苏。但是即使复苏后,心脏恢复了搏动,但脑功能的恢复是心肺复苏成功的关键。一般心脏停止搏动,脑缺血、缺氧立即发生,如超过4~6 min就可以出现不可逆的大脑损害。心脏停搏时间长,如>8 min以上,大脑功能很难恢复,成功率极小。有学者研究认为,心脏停搏后,约50%左右患者死于中枢神经系统损害,即脑死亡。即使心、肺复苏成功,生命保留,仍约有20%~50%左右存在着不同程度的脑功能障碍,成为植物状态(植物人)或痴残等[2]。 在成功进行心肺复苏后有20%~40%的患者遗留下永久性神经损害[3]。鉴于脑保护和脑复苏的重要性,近年来对缺血性脑损伤的机制进行了大量的研究,脑是一个血流量大、代谢旺盛的器官,其功能几乎全靠葡萄糖的氧化代谢。心脏骤停后引起的脑损害的病理生理主要是缺血缺氧性脑损伤以及自主循环恢复后的大脑缺血再灌注损伤,其中涉及兴奋性氨基酸的神经毒性、钙离子稳态失调、神经元凋亡等机制[4]。所以心肺复苏的最终目的是脑复苏。 大量研究旨在寻找可减轻或预防脑缺血再灌注损伤的方法或药物,并且已经在动物模型上获得一定成功,但是这些方法和药物很少能成功用于临床。缺血预处理对心脏和神经系统缺血再灌注损伤具有明显的保护作用,但是在临床实践中预处理只适用于缺血再灌注可预期的情况。尽快恢复灌注是减轻缺血导致的损伤和行为障碍的最有效方法,然而再灌注也可能加重损伤。在再灌注早期,大量活性氧自由基的产生和钙超载导致了缺血再灌注损伤。所以近年来围绕心肺脑复苏的保护机制及其方法成为专家学者们研究的热门,而建立有效、稳定的全脑缺血再灌注模型是实验研究的基础。 针对建立全脑缺血再灌注模型的实验方法有多种,包括:二血管阻断加低血压法、四血管阻断法、三血管阻断法、颈动脉负压分流法。国内文献报道用四血管阻断法比较多[5],国外四血管阻断法、二血管阻断加低血压法均有应用及报道,但更偏向于后者[6]。对比不同建模方法在实验过程中所显露出的特性,分析并总结各自的优缺点。选择能较好地建立大鼠全脑缺血再灌注模型的方法,为脑复苏的深入研究提供良好的实验基础。本文将从实验的可操作性、成功率、发展前景等方面对各类建模方法进行综述。 1制作全脑缺血再灌注动物模型及效果的判定 1.1全脑缺血再灌注模型模拟心搏骤停

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