PCR和RT-PCR区别
PCR和RT-PCR
PCR和RT-PCR基础
PCR基础
聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。
表1.反应成分
Component Final Concentration
Template 10^4-10^6 copies of DNA template
Primer 1 0.1-0.5μM
Primer 2 0.1-0.5μM
10X Reaction buffer 1X
Magnesium 1.0-3.0mM
dNTP mix 200 mM each dNTP
Thermostable DNA polymerase 1-4 units/100 ml reaction
RT-PCR基础
RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶
分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。
图1. RT-PCR概图
这本指南阐述了成功RT-PCR和PCR的关键。高灵敏性（从小量样品中得到足量结果）和高特异性（选择性地仅得到所需的产物）是成功PCR的标志。可以通过仔细的实验设计（如选择恰当的酶，设计最理想的引物，使用不同的缓冲液和添加剂，确定循环参数及制备高质量的模板等）以获得最佳的RT-PCR和PCR。
增加RT-PCR灵敏度
分离高质量RNA
成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA
上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol试剂法（见下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。
TRIzol?试剂步骤略图
一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果（图2）。另外，分离poly(A)+ RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+ RNA会增加检测的灵敏度。
图2. 总RNA和poly(A)+ RNA在RT-PCR中的比较
以5或1μg Hela细胞总RNA（分别为泳道1和2）或500ng和50ng Hela细胞poly(A)+ RNA（分别为泳道3和4）。使用oligo(dT)引物和SuperScriptⅡ逆转录酶合成cDNA。扩增对象为DNA聚合酶εmRNA 5'端377bp片段和复制酶A mRNA的643bp片段，两者都为中等丰度。将1/10的cDNA合成反应产物使用Taq DNA聚合酶扩增30个循环。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于
-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g 离心5分钟。在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA 的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。
使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶
逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA 模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。SuperScriptⅡ逆转录酶，RNaseH- 的MMLV逆转录酶及ThermoScript逆转录酶，RNaseH- 的AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA（图3）。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。ThermoScript比AMV的灵敏性强得多（图4）。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比，SuperScripⅡ显著提高了长RT-PCR产物的产量（图5）。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。
图3 逆转录酶对cDNA第一链产量的影响
在建议的合成条件下，使用oligo(dT)引物和10μCi的[α-P]dCTP。第一链的总
产量使用TCA沉淀法计算。全长cDNA使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。
图4 逆转录酶对RT-PCR灵敏度的影响图5 逆转录酶对长模板RT-PCR灵敏度的影响
以oligo(dT)为引物，使用ThermoScriptⅡ或AMV，在50℃下由Hela细胞总RNA合成cDNA。使用Platinum? Taq DNA聚合酶和人DNA聚合酶ε引物进行35个循环。人tuberous scherosis ⅡmRNA（5.3kb）和人DNA聚合酶εmRNA的全长cDNA的合成由SuperScriptⅡ和MMLV催化。利用oligo(dT)
为引物，由5μg Hela细胞总RNA合成cDNA。样品使用RNaseH处理，然后使用ELONGASE? Enzyme Mix将1/10的cDNA合成反应产物扩增35个循环。
RNaseH产生的障碍
RNaseH对第一链cDNA的影响。RNaseH在cDNA合成期间降解RNA:DNA 复合体中的RNA。红色箭头代表潜在的酶切位点。
提高逆转录保温温度
较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA
模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用ThermoScript逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增（图6）。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时（见第三章）。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。
图6 温度对不同模板的影响
使用ThermoScript或AMV，以18S rRNA基因特异性引物，由10ng大豆总RNA在所示温度合成cDNA。将1/10的cDNA反应产物使用高保真Platinum Taq DNA聚合酶进行40个PCR反应循环。
表2. 逆转录保温温度
Reverse Transcriptase Incubation Temperature
AMV 37°C-45°C
M-MLV 37°C
SuperScript?II RT 37°C-50°C
ThermoScript? RT 42°C-65°C
RNA在高于65℃时开始水解，对于≤1kb的RNA第一链合成温度可以为70℃，对于＞1kb的RNA则需要＜65℃。Tth热稳定聚合酶在Mg存在条件下作为
DNA聚合酶，在Mn存在条件下作为RNA聚合酶。它可以在最高65℃条件下保温。然而，PCR过程中Mn的存在会降低忠实性，这使得Tth聚合酶不太适
合用于高精确度的扩增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和PCR，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cDNA的扩增产物同污染的基因组DNA的扩增产物区分开来。
促进逆转录的添加剂
包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。为了在SuperScriptⅡ逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4％，这不足以抑制PCR。
RNaseH处理
在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosisⅡ（图7）。对这种困难模板，RNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95℃保温的PCR 变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。
图7 RNaseH处理对RT-PCR的影响
使用SuperScriptⅡ（S）、M-MLV（M）或AMV（A），由5μg Hela RNA合成人tuberous sclerosisⅡmRNA（5.3kb）的全长cDNA，反应产物的一半使用RnasH处理30分钟，使用ELONGASE Enzyme Mix对相当于起始RNA 0.5％的经处理及未处理逆转录产物进行35个循环的扩增。
小量RNA检测方法的提高
当仅有小量RNA时，RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无RNase糖元的建议浓度为250μg/ml。在使用SuperScriptⅡ的逆转录反应中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度（图8），而且对于小量RNA，减少SuperScriptⅡ的量并加入40单位的RnaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在RNA分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用SuperScriptⅡ进行逆转录反应时加入BSA或RNase抑制剂。
图9 一步法RT-PCR的灵敏度
使用SuperScriptⅡOne-Step RT-PCR System从0，0.1，1，10，102，103pg Hela总RNA（分别为泳道1-6）扩增β-actin片段。反应在50℃保温30分钟；94℃2分钟；然后94℃15秒，55℃30秒，68℃90秒进行40个循环；随后在68℃保温5分钟。反应中包含200 nM正义和反义引物。
一步法同两步法RT-PCR的比较
两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点（表3）。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增（图9）。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA 合成。
表3. 一步法和两步法RT-PCR的比较
两步法步骤一步法步骤
起始第一链cDNA合成使用：起始第一链合成使用
Oligo(dT) GSP引物
随机六聚体
GSP引物
优点优点
?灵活?方便
引物选择扩增酶同逆转录酶预先混合
扩增酶的选择转管步骤少，减少污染可能性
?困难RT-PCR的优化能力?高灵敏度
同Platinum?酶结合提高特异性?适用于大量样品分析
同Platinum Pfx Taq DNA聚合酶结合提高忠实性?适用于定量PCR
?适用于在单个样品中检测几个mRNA
关于扩增酶和产物大小应注意：
?对于小于4kb的产物使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶
?对于小于12kb的产物使用Platinum Pfx Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity
?对于大于12kb的产物使用ELONGAE? Enzyme Mix
?对于一步法RT-PCR，如果产物小于3.5kb，使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶；如果产物小于9kb，使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。
图9 一步法RT-PCR的灵敏度
使用SuperScriptⅡOne-Step RT-PCR System从0，0.1，1，10，102，103pg Hela总RNA（分别为
泳道1-6）扩增β-actin片段。反应在50℃保温30分钟；94℃2分钟；然后94℃15秒，55℃30秒，68℃
90秒进行40个循环；随后在68℃保温5分钟。反应中包含200 nM正义和反义引物。
如何在Word中用Visio画图
Microsoft Office Visio作图方法简介 Microsoft Office Visio是Microsoft Office 2003（企业版）套件之一。安装Visio之后，可以类比Word的操作方法一样来使用，不过，就是比在Word里画图、修改更方便，功能更强大。特别是备有机械、电子、电气、建筑、计算机、管理图表等丰富的绘图模板，使用起来更方便、更理想。还可以用“绘图工具”直接画弧线、曲线。 在Visio中画好的图，可以复制→粘贴到Word中，并在Word中加以编辑和补画。 Visio作图方法步骤： ①打开Visio窗口界面，选好需要的绘图模板，在绘图模板中选取需要的部件，可以直接将其拖到新建的作图板页面上。 ②可以用【连接线工具】画线将各个部件加以连接，用【绘图工具】直接画弧线、曲线等（在作图板上有定位网格显示）。 ③将画好的图加以组合、存档。 ④对画好的图全选→复制。 ⑤将图粘贴到需要的Word文档中。 ⑥可以在Word文档中双击该图，就可以在显示的画面中编辑该图，进行取消组合、移动、微调、用“绘图工具”画弧线、曲线、最后组合等操作。 ⑦编辑修改好图片以后，点击页面空白处，恢复到正常文档页面。 ⑧在正常文档页面中，将图片转换为某种文字环绕格式。然后，用文本框方法对图中需要标注的地方用小五号字加以批注（建议在这一步才标注文字）。 由上可见，为什么在我们的写作中要用Visio画图的理由： ①在Visio中画图，可以借助各种现成的绘图模板部件，这样全书各章节的图形部件都能加以统一和规范；
②由于都是Microsoft Office 2003（企业版）套件，故Visio和Word在使用方法上都能举一反三，在操作上都能互动。熟悉Word的Visio新手可以很快熟练，编辑也可以很方便地修改图片。 如何在Word中用Visio画图 Word中自带的画图工具确实比较低级，只能插入一些固定的形状，如果采用画布画图，画布的位置，大小都难以调整。 写文章的时候，常常遇到插图的问题，如果在Word中直接利用画布画，基本到最后调整格式和篇幅的时候，就等着绝望和悲剧吧。但是反过来说，用截图的方法然后粘贴图片进去，虽然特别方便，但是对于大图片来说，图片缩放后那叫一个不清晰，继续汗一下，所以建议大家都专业点，还是用Visio画图吧。 首先，可以新建一块Visio画布，在里面用专业的模板等进行绘制，尤其是计算机流程图等，都是很好的选择！我常用的是曲线绘图这部分功能，很好用，最强大的是，可以在画好结束的时候，复制整张画图，在Word的“粘贴”->“选择性粘贴”中直接单击确定，就能插入Visio画布，然后双击图形，就能自动进入Visio画图编辑器中，相当的方便啊，在Word中使用Visio，就是方便随时编辑图片，不用一遇到修改就到“画图”中去改截图，同时图片显示好清晰！ 同时，对于Word编辑中，还有一个常见问题，就是无论是Visio选择性粘贴，或是截图的插入，往往图片选用“嵌入式”版式的时候，图片跑到了Word文字上方了，即使拖动，也不能看到图片全貌，这个好纠结啊！
关于PCR技术及其应用实例和前景
PCR技术及其应用实例和前景 检验0905郭媛媛 PCR是我们研究分子生物学的重要方法和工具，随着医学科技 的不断发展，这种技术越来越被人们看重，越来越多的应用到 我们的科技研究之中，作为医学检验工作者，这种技术也是我们必须掌握的从这篇文章中让我们了解一下它在实践之中的前景。 摘要：PCR (ploymerse chain reaction)技术[1]，即聚合酶链反应技术，又称基因体外扩增技术或和核酸体外扩增技术，利用两种与相反链杂交并利用附着于目标DNA两端的寡核苷酸引物在高温(95°C)使目标DNA片断的DNA双链变性，分解为单链，在较低温度(37-63°C)与引物退火，然后变温到72°C左右。在耐高温DNA聚合物酶的作用下引物被沿样板DNA单链延伸合成互补链，然后有变性→退火→延伸反复进行。引物大大过量，dNTP过量，酶在高温中是较稳定的，这样经过几十个循环，目标DNA片断就按2的n次方递增，用此法可以从mRNA中，cDNA库中扩出目标基因。总之，生物体内核酸的复制是半保留复制，PCR技术就是在体外对此进行复制模拟。 关键词：PCR技术；DNA；应用；工程效益扩大 1 引言 人类利用微生物的实践具有悠久的历史，公元前，人类就已经利用天然的微生物（酶）生产奶酪和酒。进入工业革命时代，人们开始对天然微生物进行筛选和诱变，生产某些简单的代谢产物，氨基酸，维生素和抗生素。 20世纪60年代至今，随着人类虽微生物认识的加深，DNA重组技术的出现，发酵技术的提高：更多的微生物可产生各种各样的抗生素，应用于医学微生物学(Medical Microbiology)中；更多微生物被发现可产生促生物质，有利于人和动植物的生长，对农业科学(Agriculture)有着极重要的支持；还有些微生物的代谢产物是重要的化工原料，加速了化工产业(Chemical Industry)的完善；再有些微生物被广泛应用于法医鉴定(Forenic)、医学(Medical Science)、环境监测(Environment Supervise)分子克隆(Member Clone)、序列分析(Alignment Analysis)、考古研究(Archaeology Search)等重要学科，具有广泛的应用前景，
Word绘图技巧2013
Word绘图技巧 Word中的图文混排功能非常强大，我们常用Microsoft Word来编制数学教案、试卷、打印文稿，但是绘图往往令人头疼．其实Word中的制图功能比较强大，有许多技巧．若在使用过程中细心体会反复摸索，可大大提高制作数学图形的效率，绘制出非常精美的数学图形． 1. 打开绘图工具栏 单击“视图”菜单下，找到“工具栏”，选中“绘图”，或在常用工具栏空白处单击右键，选中“绘图”工具，即可打开绘图工具栏。 2. 去除绘图时出现的画布 在Word XP中使用图形工具画图时，总会出现一个“画布”，有的用户可能并不希望看到它，我们可以执行“工具”下拉菜单上的“选项”命令，在“常规”选项卡中，去除“插人〔自选图形〕时自动创建画布”复选框的选择，这样我们在使用图形工具画图时就不会再出现“画布”。 3. 多次使用同一绘图工具 一般情况下，单击某一绘图工具后可绘制相应的图形，但只能使用一次，如果想多次连续使用同一绘图工具，可在相应的绘图工具按钮上双击，此时按钮将一直处于“按下”状态，当你不需要该工具时，可用鼠标在相应的绘图工具按钮上单击或按“ESC”键。如果接着换用别的工具，则直接单击要使用的工具按钮，同时释放原来多次使用的绘图工具。 4. 改变箭头的样式 Word XP绘图工具可直接画箭头，但画出的箭头不一定是我们需要的样式，可以通过“设置自选图形格式”对话框方便地画出合适的箭头．用下面的方法打开“设置自选图形格式”对话框：①将鼠标在箭头上移动，当鼠标变成四个箭头的标志时，双击鼠标左键；②将鼠标在线段上移动，当鼠标变成四个箭头标志时，单击鼠标右键，选择快捷菜单中的“设置自选图形格式”选项；③用 全国注册建筑师、建造师考试备考资料历年真题考试心得模拟试题 绘图工具画出箭头后，单击绘图工具条中的“箭头样式”按钮，可以选择带箭头的直线，也可以选择“其他箭头(M)”激活“设置自选图形格式”对话框．激活“设置自选图形格式”对话框后，可在对话框中设置箭头的样式、宽度、长度。 5. 画特殊角度的直线 如果想画水平、垂直或150、300、450、600、750角的直线，则固定一个端点后在拖动鼠标时按住Shift键，上下拖动鼠标，将会出现上述几种直线选择，合适后松开Shift键即可（同时按住Ctrl键可画出从起点向两侧延伸的直线）。 6. 画坐标轴上的刻度线 单击“矩形工具”，拖出矩形，右单击该矩形，在[设置自选图形格式]对话框中点选“大小”选项卡，选择0[高度]、0.1[宽度]。 7. 画点 单击“椭圆工具”同时按Shift键用鼠标拖出一个小正圆，双击（或右击）该圆，在“设置自选图形格式”对话框中，填充黑色． 8. 画弧 绘图工具栏——自选图形——基本形状——选用“画弧”工具，按住Shift键拖动鼠标可画出450圆弧，按住Ctrl键可画出从起点向两侧延伸的弧线（同时按住Shift键和Ctrl键可画出从起点向两侧延伸的450弧线）。鼠标拖动的距离决定弧线的长短，拖动的方向决定弧线开口的方向． 9. 画正方形和矩形 单击“矩形工具”，按住Shif t键拖动鼠标会画出一个正方形，按住Ctrl键可画一个从起点
PCR技术论文
合肥学院 HEFEI UNIVERSITY 题目: PCR技术论文系别: 生物与环境工程系专业:_ 12生物工程2班学号: 1202012043 姓名: 乐一鹏 指导教师: 阚劲松 时间： 2014年11月27日
PCR技术论文 摘要：PCR技术又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点，是基因扩增技术的一次重大革新。PCR技术可将极微量的靶DNA 特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。 关键词：PCR原理、PCR过程及应用、关于PCR技术要点 1、PCR技术的基本原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 PCR的过程类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火(复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA经加热至93℃左右维持一定时间，使含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，按5'到 3'方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2、PCR技术的反应体系与反应条件 （一）标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u
Word最全画图全攻略大全
Word画图技巧全攻略 1、文本框怎么去掉？ 答：去掉文本框的方法有： 方法一、当在画线条的时候会出现一个虚框，在虚框里画出你想要的图形，然后再把虚框删掉就是了。（前提是把你画的线条搬到虚框外面去） 方法二、将在调试文本框线条的地方，将文本框的线条设成没有就行了。 方法三、画完后把文本框拖离直线的区域然后按下del健 方法四：出现文本框后不要任何操作，按Esc键。如果想使他永久不出现：菜单——工具——选项，在对话框中选择“常规”选项卡，下面有一个【插入“自选图形”自动创建绘图画布】把前面的勾去掉点确定就可以了，另外，出现文本框后除了按Esc键外，还可用delete键。 2、如何使用绘图工具？ 答：在一般情况下，单击某一绘图工具只能使用一次该工具，如果想多次使用，需双击该绘图工具，当你不再需要此工具时，按Esc键或鼠标再次单击该按钮即可。 3、word怎样画直线？
答：画直线的同时按着Shift键，将可以画出15°、30°、45°、60°、75°等具有特殊角度的直线。按住Ctrl键可画出自中间向两侧延伸的直线，同时按住这两个键则可画出自中间向两侧延伸的具有特殊角度的直线。 4、如何在word里画弧线？ 答：按住Shift键的同时可画出45度圆弧（画圆弧方法：打开绘图工具栏，单击“自选图形/基本形状/弧形”），按住Ctrl键可画出自中间向两侧延伸的圆弧，同时按住这两个键则可画出自中间向两侧延伸的45°圆弧，按住Alt键可画出一端固定的圆弧，同时按住Ctrl和Alt键则可画出一端固定的45°圆弧。 鼠标拖动的距离决定弧线的长短，拖动的方向决定弧线开口的方向。 5、怎么用word画个半圆？ 答：半圆是画不出来的,可以用其它方法代替: 方法一：以插入图片的方式将外部的一个半圆图形插入 方法二：先画一个正圆,再画一条线,线的长度等于圆的直径,再画一个矩形,将矩形位于圆形上方,遮住半个,不要矩形的边框色,取和圆一样的填充色。 6、word画图如何在两点之间画弧线？
如何快速的使用和掌握Word画图的操作及技巧(内容详细、齐全、全面)
如何快速的使用Word画图操作 如何快速的掌握word画图技巧大家在制作一些汇报材料、项目机构图示、工序流程、课件制作、描述插图等的word使用中是否对word中画图的各种线条调整、绘制无从下手？下面这篇内容就是教大家如何熟练运用word画图。 相信大家对Word中的绘图功能都有一定的了解，Word中的画图并不是只能绘制一些简单的图形那么简单。其实如果掌握好Word绘图技巧，相信足以应付办公中绝大多数的需求，下面将这些技巧全面介绍一下，希望大家能从中获益。 关键词：绘图技巧操作指令画图方法画图图示绘图功能 绘图 使用Word作文档时，经常需要用到其绘图功能，这里介绍几种在Word中绘图的方法，希望对大家有所帮助。 一、使用Word本身的绘图功能。 首先必须打开“绘图”工具栏：选取“视图”中“工具栏”内的“绘图”，或单击“绘图”按钮，使绘图工具中各种功能的图标出现在编辑屏幕的下方。此后，便可用图标中所示的各种功能进行作图。这一方法虽然能完成大部分的绘图功能，但在给图形配上文字时却有不足之处：每次插入的只能是一个文本行，即每次只能在同一行上插入文字，而对文字高度稍有不同，或在同一行字型号有变化的情况
下就无法办到了，这给一些复杂图形的标注带来了困难。 二、用Word所提供的另一作图工具MicrosoftDrawing。 首先，在文档适当的位置，根据图形的大小，插入一个“图文框”，并把光标放在“图文框”的左上角，再点击“插入(I)”菜单中的“对象(O)”命令，在“对象类型(O)”的对话框中选择“MicrosoftDrawing”选项，或单击插入工具栏上的“插入图形对象”按钮，就可进入“MicrosoftDrawing”的绘图窗口。此窗口提供了“椭圆”、“矩形”、“圆弧”、“直线”等基本图形的绘图工具以及“调角板”、“文字”等辅助绘图工具，用户可根据需要加以选用。作图工作完成后，有两种方法可返回文档： 1、可按“Alt+F4”或选择“文件”菜单中的“返回到文档”，对是否更新当前文档的对话框予以确认后，便可把所作图插入到先前选定的图文框中，用这种方法退出，返回后图文框中的图形周围 会有较大的空白，需进行再编辑； 2、选择“工具框”中的“剪刀”，将所绘的图形选上，再选择“编辑”菜单中的“剪切”，将图形剪切到Windows的公共信息交换区――剪贴板，再关闭MicrosoftDrawing，返回后，打开“编辑”菜 单中的“粘贴”，即可在文档中插入所绘图形。用这种方法，可以满足绝大多数图形的作图需要。 但美中不足的是这种绘图工具没有提供“橡皮”，一旦在绘图过程中不小心发生了错误，或想把一个图形部分抹去，以达到特殊的效果，它就显示得无能为力了。
PCR技术的原理和方法
PCR技术的原理和方法 1.PCR定义 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。 2.PCR技术的基本原理 即在高温（95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～55℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。 PCR基本原理示意图 假设扩增效率为“X”，循环数为“n”，则二者与扩增倍数“y”的关系式可表示为：y=(1+X)n。扩增30个循环即n=30时，若X=100%，则y=230=1073741824(>109)；而若X=80%时，则y=1.830=45517159.6(>107)。由此可见，其扩增的倍数是巨大的，将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灶照射下（254nm）一般都可见到DNA的特异扩增区带。 3.PCR反应基本步骤 3.1 变性(denaturation)：通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂，双链分开而成单链的过程（94℃，30s）。 3.2 退火(annealling)：当温度降低时，引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子（55℃，30s）。如下图所示
Word绘图使用技巧
Word绘图使用技巧 [ 26/8/2006 AM 8:52:00 | By: 凭海临风 ] 在平时的教学中常用word绘图，学会了些好用的技巧，但过了一阵，就忘记了，索性将这些不错的招数收集下来，以备用到。（内容来自网络，经过转载加工，不是原创） 一、Word中的像素级移动 在Word中移动或对齐图像和文本框时，总是让人感到不能得心应手。想让它微移，不论是用鼠标拖动，还是按方向键移动，结果都一样——图像闪开了一大截，太多了！绘出的图形移动不到想要的位置，达不到理想的效果，这还不说，短线段、小圆圈等小尺度的图形要素还画不出来。唉，如果Word也像Photoshop、Flash等软件一样有像素级的移动功能就好了！别叹气，Word真有这样的功能。在菜单“视 图”的“工具栏”中打开“绘图”工具条，选择“绘图”中的“绘图网络”，在打开的绘图网络对话框中把“网络设置”项中的“水平间距”由默认的0.86字符改为0.01字符，“垂直间距”由默认的0.5行改为0.01行，单击“确定”。这时，画条短线段试一试，啊，长度竟然可以随心所欲！选中图像，用方向键移动一下。怎么样，像素级是不是来了？ 二、文本框中文字随图片一起缩放 在Word中处理图像时，有时候要在图像中用文本框加入文字。输入文字后，再把图像和文本框组合在一起。但是，如果图像大小不符合要求，需要进行缩放，拖放图像时文本框中的文字并不会随图像一起变大变小。这时，很多人选择把图像取消组合后再编辑文本框的方法改变文字大小。其实，只要把该图像剪切，再依次单击“编辑→选择性粘贴”，在打开的对话框中选择粘贴形式为“图片（增强型图元文件）”即可。这时，再拖放图像，就会发现“图像变，我也变”了。如果文字还需要修改变动，可以把图片格式由“嵌入式”变为“环绕式”，再取消组合，就可以对文本框进行编辑了。有意思的是，原来的文本框可能会由一个分解为多个。
PCR技术的种类及应用分解
PCR技术的发展及应用 平骏 14112822276摘要：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是1985年由美国PE- Cetus 公司的科学家Kary Banks Mullis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。经历了近30年的技术发展，现如今PCR技术在生命科学研究以及相关的很多领域都得到广泛的应用。本文主要对PCR的基本原理、反应组份作简要的介绍；同时也对在PCR基础上发展起来的相关技术作简要综述。 关键词：PCR技术；PCR原理；PCR新技术 对核酸的研究己有100多年的历史，20世纪70年代初人们就致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想，该设想在1985年被Mullis等人实现，他们发明了具有划时代意义的聚合酶链反应[6]。这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内从试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠，被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发展产生了深远的影响[18]。发明人Kary Banks Mulis也因此荣获了1994年的诺贝尔化学奖。 1、PCR 技术的原理[1,2] PCR技术是模拟细胞内DNA的天然复制过程，DNA 聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA 来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3，- OH 末端，并以此为起始点，沿模板5，→3，方向延伸，合成一条新的DNA互补链。简言之，其基本原理包括3个基本反应过程：变性→退火→延伸。PCR 反应的基本成分包括：模板DNA( 待扩增DNA )、引物、4种脱氧核苷酸( dNTPs)、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。每一循环中所合成的新链，又都可作为下一循环中的模板。PCR 合成的特定的DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，每完成一次循环需2-4min，2-3h就能将目的基因扩增，从而达到迅速大量扩增的目的。 2、PCR技术的反应组份 2.1 模板DNA PCR反应的模板可以是单链DNA也可以是双链DNA，可以是基因组DNA 或cDNA，
如何在word中一分钟画好电路图
如何在Word中1分钟画好电路图？ 湖北省黄冈市浠水县实验中学张艳松 编制物理试卷时，很多人认为用Word画图困难，喜欢用windows 自带的画图程序画图，或者在纸上用尺规画好图后，再用扫描仪扫描。本人根据多年使用Word的经验认为，使用windows 自带的画图程序画图或者用扫描仪扫描作图固然方便，但产生的图形不是矢量图形，在图形缩放的过程中会使图形和字体变得模糊，影响试卷的阅读和美观，而且生成的文件体积较大，而采用预先制造“预制件”的方法用Word画出来的图形是矢量图，不仅具有美观、体积小、无论怎样缩放仍然十分清晰的特点，而且作图的速度非常的快，不仅比用windows 自带的画图程序画图快，而且比在纸上用尺规作图还要快。关于试卷的文字编排有很多的专业书籍介绍，我就不再详述，只是结合自己使用Word的经验来说明如何在1分钟内画好电路图。（作图前，需要左键单击“绘图（D）”再单击“绘图网格”将其中的“水平间距”（Z）和“竖直间距（V）”中的数值设为最小。） 一，制造“预制件”。 所谓“预制件”，就是把电源、电灯、电流表、电压表等元件的符号和实物图预先用Word里的绘图工具画好，储存为一个Word文件，以后画图时通过复制即可达到快速画图的目的。下面我以比较复杂的电流表的电路符号和实物简图为例,说明画“预制件”的过程。 （1）电流表符号的画法。单击“绘图”工具里的“椭圆,”然后按住“shift”键，画出一个大小适中的正圆，选取这个圆，再单击“填充颜色”，弹出对话框，选中“白色”，线条颜色默认为黑色即可（一定要选择白色，以便以后能盖住“导线”，“预制”别的元件也是一样的）；单击绘图工具栏中的“文本框”，当指针变成叉丝时，画出一个大小适中的文本框并在里面输入字母“A”（如果要输入“A1”，先输入“A1”，再选中“1”后单击“格式”栏中的“x2”即可) ，右键单击文本框，弹出右键菜单，然后选择“设置文本框格式”，在弹出的设置文本框格式菜单中选择“文本框”，然后再在弹出的菜单中把“内部边距”中上、下、左、右均改为0厘米，再把文本框缩小到最小；选择文本框，再单击“填充颜色”，弹出对话框，选中“无填充颜色”（如果选择白色，容易遮盖文字或图形），单击“线条颜色”选择“无线条颜色”；接下来同时选中“圆”和文本框“A”，（单击绘图工具栏中的“选择对象”就是那个白色指针，然后按住左键把需要选中的对象纳入指针画出的虚线框即可全部选中；或者按住“ctrl”键，然后分别单击要选中的对象也可），单击“绘图（D）”再选择“对齐与分布”，再连续选择“水平居中”和“垂直居中”；接下来在“圆”和文本框“A”同时选中的情况下，右键单击被选中的文本框和圆，在弹出右键菜单，选择“组合”，这样电流表的符号的“预制”就大功告成了。 （2）电流表的实物（简图）的画法。 单击绘图工具栏中的“矩形”，画出一大一小的两个矩形，使小矩形与大矩形的下部分重合如图1（中间的横线不要画直线，这样不如画两个矩形容易调整，以后画电路图也是一样的），单击“自选图形（U）”，在弹出的菜单中选择“基本形状（B）”，再在各种图形中选择“弧形”，然后画出 一个适当的半圆并放到矩形的上部；再在一个文本框中输入一个适当字号的“A”，文本框的填充色和线条颜色均选择无色，然后放进矩形的上部分（如果“A” 不图 1 图2 图3 图4
PCR技术简述
PCR技术简述 北京大学医学部基础医学院 07级临床一班陈依然 90701114 一、摘要 早在高中时期，生物课教程中就已经出现了“PCR技术”的字样。但是由于当时知识深度与教学要求、目的所限，教师并未对“PCR技术”即行明确的讲解。这个疑问一直延伸到今天。 结合查阅的资料，本文对PCR技术进行了简要而比较全面地介绍，内容主要涉及PCR技术的发展历程、原理、主要步骤、反应特点、反应的关键因素——引物与DNA聚合酶、荧光实时定量技术以及PCR在医学与法医学领域的应用，并且将该项技术与用于DNA扩增的常规基因工程技术进行了比较。 基于以上内容，本文呈现了有关PCR技术的基本知识。 二、关键词 PCR技术基本知识原理应用与常规方法的比较 三、正文 3.1 PCR技术简介 多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是近十年来发展最快、应用最广的分子生物学技术。PCR是在细胞外（体外）快速扩增特定DNA序列的技术，故又称体外基因扩增技术或无细胞分子克隆技术（Cell-free molecular cloning）。 该项技术采用定向酶促扩增法，选择性地富集某一特异性DNA序列，将被认为不可能监测到的极微量靶DNA分子扩增到足以方便地进行监测和分析的数量级。PCR不但有高的监测能力，还简化了操作程序，省去了诸多繁琐的操作，被人们称为分子克隆技术中的一次重大革命，对基础研究、实际应用，推动现代分子生物学技术的发展，具有难以估量的作用。而且由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，该项技术的发明者Mullis也于1993年获得了诺贝尔化学奖。 3.2 PCR技术发展历程 PCR技术的最初设想是由美国Cetus公司的Kary Mullis博士于1983年提出的。 自1993年至今，该项技术一共经历了手动/机械手式水浴基因扩增、自动化控制型定性基因扩增、终点定量/半定量PCR、实时定量PCR四代产品。随着产品的发展，操作大幅简化，成本迅速降低，而这些都有赖于DNA聚合酶的改良和荧光定时定量PCR等技术的发明与应用。 目前的第四代产品，对PCR可以进行精确的定时定量控制，并采用了微电脑控制全部反应过程，大大简化了操作过程，节省了实验时间，降低了成本，极大促进了PCR 技术的实际应用与发展。迄今PCR技术在生物科研和临床应用中得到广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术之一。 3.3 PCR技术原理 DNA的半保留复制是生物遗传物质向后代传递的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两个DNA分子。在实验中发现，DNA分子在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 PCR是根据以上原理，以特定顺序DNA的两条链为模板，在一对引物的介导下，在
word如何画图
word如何画图 篇一：在word中如何画图 如何在Word中画图 单击“视图”里工具栏中的“画图”按钮，则会弹出“画图”工具栏。在工具栏中单击一种画图工具，鼠标指针变成“十”字外形，按住左键并拖动鼠标至另一点，释放左键后，在两点之间就会留下该按钮所指示的几何图形，画完后按钮会自动弹起。每若双击按钮，可以持续画多次，只要单击文本中任一点（或者单击右键）该按钮才会弹起。 画图工具中主要按钮的功能为： 直线按钮：画直线。若同时按住Shift键，可以画出水平、垂直、45度角等直线。 矩形按钮：画矩形框。同时按住Shift键可以画出正方形框。扁圆按钮：画扁圆框。同时按住Shift健可以画出正圆框。自选图形按钮：包括“基本外形”、“箭头总汇”、“线条”、“流程图”、“星与旗帜”、“示明”、“其它自选图形”共七个选项。每一个选项下又有许多经常使用的画图按钮。可以用这些画图按钮迅速绘制各种图形。 填充颜色按钮：除直线外可以为选定的几何图形填充颜色。线条颜色按钮：为选定的直线或者其他各种几何图形的边框线设置颜色。
线型按钮：为将要画或者已经画出的几何图形界说线型。如虚线、细实线、粗实线、单向箭头线、双向箭头线等。要了解画图工具栏其他按钮的功能可将鼠标指向该按钮，稍停片刻即可获得功能说明。 2. 编辑图形 绘制后的几何图形允许对于其举行编辑。如移动、删除、改变巨细、配色、变换线型等。 （1）图形的移动与删除 将鼠标指针指向图形，指针呈现空心箭头状并带一个十字双向箭头，单击鼠标左键，图形框线上会立即出现控制点，称作选定或者选中。如果是直线则在两端各有一个控制点，其他图形一般会出现8个控制点，控制点数取决于图形的巨细，但最多是8个。 鼠标指针指向被选中的图形，当鼠标出现十字双向箭头时，按住左键并拖动鼠标，该图形就能够被移到其他位置。图形被选中后，按Del或者Backspace键，该图形即被删除。 （2）改变图形的巨细 首先选中图形，然后把鼠标指针指向控制点，当鼠标指针变成双向箭头时拖动鼠标可以改变图形的尺寸，如果图形是直线则改变其长度或者角度。 （3）改变图形的线型 改变线型是指改变直线的线型。画直线前可以界说线型，对于已画出的直线也可以修改其线型。方法是单击画图工具栏中的“线型”
PCR技术综述
PCR技术综述 摘要：PCR（polymerasechainreaction）即聚合酶链式反应，是一种通过体外酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。本文主要针对PCR的概念，原理和方法，简要介绍常用的PCR相关技术及其原理，方法及应用。 关键词：PCR；原理；应用及展望 聚合酶链式反应（polymerasechainreaction），简称PCR，又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是体外酶促合成特异DNA 片段的一种方法，由变性、退火及延伸等反应构成一个周期，可循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有高特异性、高度灵敏性、高丰产量等特点，此方法在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域都被广泛应用。 1、PCR技术发展史 上个世纪60年代末，人们开始致力于基因体外分离技术的研究，但由于核酸含量较少，大大限制了DNA的体外操作。Khorana在1971年最早提出了核酸体外扩增的设想，DNA经变性之后与合适的引物杂交，再用DNA聚合酶延伸引物，不断重复该过程就可以克隆出tRNA基因。但是，由于当时的基因序列分析方法不是很成熟，热稳定性较强的DNA聚合酶也还没有发现，相关引物的合成处在手工合成阶段，所以这种想法没有什么实际意义。 1985年，美国科学家KaryMullis在高速路的启发下，经过两年努力，发明了PCR技术，并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供了合适的条件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶和合适的缓冲体系。自此，PCR技术得到了生命科学界的一致认可，KaryMullis也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。然而，最开始的PCR技术还很不成熟，在那个时候是一种操作复杂、成本高昂的实验室技术。直到Saiki等人从一种嗜热杆菌提取到一种耐热DNA聚合酶，才使得PCR的扩增效率得以提高，PCR技术也开始得到广泛应用，成为遗传与分子生物学分析的根本基石。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：从定性发展到定量；从原先只能扩增几个kb到目前已能扩增几十个kb的DNA片段。到目前为止，PCR技术已有十几种之多。 2、PCR技术原理 基本PCR条件：1、DNA模板(Template)，2、引物(Primers)，3、DNA聚合酶(Polymearse)，4、合成的原料及水。 PCR的反应包括三个主要步骤，分别是：Denaturation、Annealing，andExtension。Denaturing即将DNA加热变性转为单链DNA作为复制的模板；而Annealing则是令引物于一定的温度下附着于模板DNA两端，最后在DNA聚合酶的作用下进行引物的延长(Extensionofprimers)及另一条链的合成。
PCR技术(包含引物设计)
聚合酶链式反应（PCR） 原理： DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； ③引物的延伸：DNA模板 - 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的?半保留复制链?，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术分类（常用） （1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，
如何用word画图
编辑技巧相信大家对Word中的绘图功能都有一定的了解，可能以为Word中只能绘制一些简单的图形。其实如果掌握好Word绘图技巧，相信足以应付办公中绝大多数的需求，下面将这些技巧全面介绍一下，希望大家能从中获益。 一、绘制图形的技巧 1．画直线 画直线的同时按着Shift键，将可以画出15°、30°、45°、60°、75°等具有特殊角度的直线。按住Ctrl键可画出自中间向两侧延伸的直线，同时按住这两个键则可画出自中间向两侧延伸的具有特殊角度的直线。 2．画弧 按住Shift键的同时可画出45度圆弧（画圆弧方法：打开绘图工具栏，单击“自选图形/基本形状/弧形”），按住Ctrl键可画出自中间向两侧延伸的圆弧，同时按住这两个键则可画出自中间向两侧延伸的45°圆弧，按住Alt键可画出一端固定的圆弧，同时按住Ctrl和Alt键则可画出一端固定的45°圆弧。 3．画矩形 按住Shift键可绘制出一个特殊的矩形——正方形，按住Ctrl键可绘出自中间向四周延伸的矩形，同时按住这两个键则可画出自中间向四周延伸的正方形。画圆时与此类似。 由此可见结合键盘画图的奇妙效果。 二、选择图形的技巧 如果需要选择部分图形，则可在按住Shift键的同时依次进行选择或单击绘图工具栏上的“选择对象”按钮，然后用鼠标画出一个框将所需要的图形罩住即可。 如果是各图形层叠在一起的情况，则可以首先选中最上面的图形，然后按Tab键或“Shift+Tab”组合键依次选择即可。 小提示：如果你发现某图形选择起来很困难（鼠标变不成十字形状），这种情况常发生在多个图形混杂在一起的情况，同样点击“选择对象”按钮后你会发现选择很容易。
PCR技术概论
PCR技术概论 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR 几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。 PCR技术简史 PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA 聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。
word中怎么画立体几何图形
如何在Word中画立体几何图形 唐顺友 出数学试卷时，看见某个立体几何题很好，但又不知道怎么把图弄在试卷上，有的老师用几何画板或用扫描仪把资料中的图形扫描，处理后再复制到Word中，这种做法存 在画图效果不佳、效率低、图形修改时较麻烦等缺点。而Word的画图工具，便能快速画出精致的立体几何图形，而且打印效果特别好，看后给人一种心情舒畅的感觉。 一、打开作图工具（视图一工具栏一绘图） 具体操作：先必须把有关的图形工具请到工具栏上。点击“视图一工具栏一绘图”，绘图工具栏便在界面下边显示出来。 二、设置作图工具 1.去掉画布，目的是：避免每次画图时，都自动创建画布的麻烦事出现。（工具—选项f常规f插入自选图形时自动创建画布）： 具体操作：在“工具—选项”这一菜单中，有个常规页，切换到这个页面后，在其中有个“插入自选图形时自动创建画布”选项，如果这个选项前面打“V”，贝U：单击之，取消这一选项， 注：如果不设置也可以，每次画图时把画的图形拖出画布，然后把画布删除即可（选中画布，按回车键），要增加图形时选中已经画好的图形，再点击要增加的图形，也可以避免出现画布，操作相对来说要麻烦点。 2.设置间距，目的是：用鼠标移动图形时，较好地控制图形的大小以及搬动到预定地方。（文件f页面设置f文档网格f绘图网格f会弹对话框f网格设置f水平间距”、“垂直间距”设置为0.01 f确认f确认） 具体操作：在“文件f页面设置”菜单中有个“文档网格”页面，切换到这个页面后， 左下角有个“绘图网格”按钮，点击这个按钮时，会弹出一个设置对话框，在其中的“网格设
置”的“水平间距”、“垂直间距”设置为0.01 （取这一设置的最小值）。如果不进行这个操作，移动图形时可能出现线条交接间隔过大，位置要向某个地方移动一点点，却不听使唤。 、基本作图技巧 1.画线段 具体操作：点击左下方工具栏中的线条工具“”，在相应位置作图即可。 2.画虚线 具体操作：先画线段，选中线段后，点击点击左下方工具栏中的虚线工具“…”， 选择需要的虚线类型单击即可。 3.画箭头 具体操作：先画线段，选中线段后，点击点击左下方工具栏中的箭头工具“三”， 选择需要的箭头类型单击即可。 4.画成任意角的两条线 具体操作：先画一条线段，再画一条平行线段（或复制—粘贴，或按住Ctrl拖动线条），双击线条（或者右击一设置自选图形格式），弹出一个对话框，点击“大小”选项，选择选择的角度后点击“确认”即可。如果角度没严格要求，直接拖动线段一端即可。 5.画常规图形（矩形，平行四边形，长方体等） 具体操作：点击点击左下方工具栏中的“自选图形”，选择需要的常规图形作图即可。 6.图形的移动 ①用鼠标拖动图形 ②选中图形后按键盘上的上下左右键 ③若只需移动一点点，先按住Ctrl键再按上下左右键进行微调 7.给顶点标字母 具体操作：点击左下方工具栏中的文本框工具，画一个文本框，并输入定点，然 后双击文本框（或者右击一设置自选图形格式），弹出对话框，点击（颜色与线条）把文本框的填充和线条颜色调成无颜色。