马铃薯mir166及其靶基因的克隆和功能坚定
分类号密级
UDC单位代码10733
甘肃农业大学
硕士学位论文
马铃薯miR166及其靶基因的克隆
和功能研究
Cloning and Functional Research of miR166
and its Target Gene in Potato
武亮亮
指导教师姓名张宁教授（甘肃农业大学生命科学技术学院兰州730070）
学科专业名称生物化学与分子生物学研究方向植物生物化学与分子生物学论文答辩日期 2016年5月28日学位授予日期 2016年6月
答辩委员会主席孙坤教授
评阅人桑毅教授
张腾国教授
2016年5月
目录
摘要 ........................................................................................................................ I II 关键词 ........................................................................................................................ I V Abstract ........................................................................................................................ V Abbreviations ............................................................................................................ VII 1 文献综述 (1)
1.1小RNA(Small RNA)概述 (1)
1.2 miRNA (2)
1.2.1 miRNA的发现 (2)
1.2.2 miRNA的生物合成 (3)
1.2.3 miRNA的作用机制 (4)
1.2.4植物miRNA调控的主要靶标 (5)
1.2.5植物miRNA的功能 (6)
1.2.5.1 miRNA与植物的生长发育 (6)
1.2.5.2 miRNA参与植物的激素应答和信号转导 (6)
1.2.5.3 miRNA与植物代谢以及胁迫应答调控 (7)
1.3转录因子 (7)
1.3.1 HD-Zip转录因子概述 (7)
1.3.2 HD-ZipⅢ转录因子 (8)
1.3.3 amiRNA技术 (9)
1.3.3.1amiRNA技术在植物育种和抗非生物胁迫方面的应用 (9)
1.3.3.2 miR166/HD-ZipⅢ的研究现状 (11)
1.4 全文总体研究路线 (11)
1.5本研究的目的意义 (11)
2 材料与方法 (13)
2.1材料 (13)
2.1.1植物材料 (13)
2.1.2菌株和质粒 (13)
2.1.3 工具酶和试剂 (13)
2.1.4仪器设备 (13)
2.2方法 (14)
2.2.1生物信息学分析 (14)
2.2.2马铃薯的胁迫处理 (14)
2.2.3 RNA 提取和cDNA 合成 (14)
2.2.4 StHB14/15和StREV cDNA的克隆 (14)
2.2.4.1回收片段与克隆载体连接 (15)
2.2.4.2连接产物的转化 (15)
2.2.4.3阳性克隆的检测及测序 (15)
2.2.5 RLM-RACE验证miRNA靶基因切割位点 (15)
2.2.6马铃薯miR166b/ StHB14/15和StREV的表达量分析 (17)
I
2.2.6.1 miR166b组织表达特异性分析 (17)
2.2.6.2 StHB14/15和StREV的qRT-PCR表达分析 (18)
2.2.7 miR166植物表达载体的构建及鉴定 (19)
2.2.7.1 amiRNA的产生 (19)
2.2.7.2 miR166植物表达载体的构建 (20)
2.2.7.3植物表达载体的PCR和酶切鉴定 (21)
2.2.8农杆菌工程菌液的制备 (21)
2.2.8.1农杆菌LBA4404感受态细胞的制备 (21)
2.2.8.2根癌农杆菌感受态细胞的冻融法转化 (21)
2.2.9马铃薯转基因植株的获得 (22)
2.2.9.1马铃薯试管薯的诱导 (22)
2.2.9.2 根癌农杆菌介导的马铃薯试管薯转化 (22)
2.2.10 转基因马铃薯株系PCR检测 (23)
2.2.11转基因植株形态学指标测定 (23)
3结果与分析 (24)
3.1 stu-miR166家族生物信息学分析 (24)
3.2 stu-miR166b靶基因的预测 (25)
3.3 StHB14/StHB15、StREV的克隆 (26)
3.4 StHB14/StHB15、StREV的RLM-RACE验证 (26)
3.5 miR166b靶基因的生物信息学分析 (27)
3.5.1 StHB14/15和StREV跨膜结构域预测 (30)
3.5.2 StHB14/15和StREV翻译后氨基酸加工修饰的预测 (31)
3.5.3 StHB14/15和StREV信号肽的预测 (31)
3.5.4 StHB14/15和StREV疏水性预测 (32)
3.6 stu-miR166b和StHB14/StHB15、StREV组织特异性表达分析 (33)
3.6.1stu-miR166b组织特异性表达分析 (33)
3.6.2 StHB14/15和StREV组织特异性表达分析 (33)
3.7 stu-miR166b和StHB14/StHB15、StREV响应胁迫的表达模式分析 (34)
3.7.1 stu-miR166b在马铃薯地上部分响应胁迫的表达模式 (34)
3.7.2 stu-miR166b在马铃薯地下部分响应胁迫的表达模式 (35)
3.7.3 StHB14/15和StREV在地上部分响应胁迫的表达模式 (36)
3.7.4 StHB14/15和StREV在地下部分响应胁迫的表达模式 (36)
3.8 人工amiR166b表达载体的获得 (37)
3.9 转基因马铃薯植株的PCR检测 (39)
3.10 StHB14/15、StREV的转录分析 (40)
3.11 T0转基因植株的表型观测 (41)
4 讨论 (42)
5结论 (44)
致谢 (51)
作者简介 (52)
导师简介 (53)
II
摘要
MicroRNA(miRNA)是一类转录后对靶mRNA进行沉默的内源性非编码小RNA。大多数植物miRNA通过与靶mRNA接近完全配对的方式识别靶基因，调节转录因子从而作用于下游功能基因影响细胞分化和器官发育。miR166是单子叶与双子叶植物中高度保守且成员众多的一类miRNA，其主要作用于HD-Zip Ⅲ亚家族成员调控顶端分生组织、维管束、近轴区域横向器官的发育。本文从马铃薯栽培品种甘农薯2号克隆了三个stu-miR166b的靶基因，并对其进行生物信息学分析和RLM-RACE剪切位点验证，研究了stu-miR166b和其靶基因的组织表达模式和胁迫响应特性；以pRS300质粒为模板构建了包含miR166b成熟体序列的植物表达载体，经过农杆菌介导的转化法转入试管薯，对获得的转基因植株进行了表型分析。本文主要取得的结果如下：
1. stu-MIR166 在马铃薯基因组中有4条前体序列，转录生成了序列不相同的三条成熟体stu-miR166a3p、stu-miR166a5p和stu-miR166b。stu-miR166a5p的靶基因是一些激素和早期脱水蛋白；stu-miR166b有5条靶基因，分别为PGSC0003DMT400030829 (StHB14)、PGSC0003DMT400054421 (StHB14-like)、PGSC0003DMT400020801(StREV)、PGSC0003DMT400006735(StHB15)和PGSC0003DMT400068037 (StHB15-like)。根据NCBI登记的转录组序列结合RT-PCR技术，克隆得到StHB14、StHB15和StREV三个基因。生物信息学分析表明StHB14、StHB15和StREV均为非分泌性蛋白，且都具有HD-ZipⅢ转录因子结构特点。通过RLM-RACE验证确定了StHB14、StHB15和StREV是受stu-miR166b剪切降解，有着相同的剪切位点，均在结合区域第十到第十一位之间。
2. 马铃薯组织表达特异性分析表明，stu-miR166b在马铃薯各器官中均有表达，在根中表达量最高，茎次之，叶最低；相反地，StHB14、StREV在根中的表达丰度最低，StHB15在茎中的表达丰度最低。
3. qRT-PCR分析表明，不同的处理与器官中stu-miR166b/StHB14、StHB15和StREV的表达丰度不同。除了地上部分NaCl处理24h和地下部分PEG处理24h后stu-miR166b表达量下降外，其余时间stu-miR166b表达量均上升；地上
III
部分受到PEG和NaCl胁迫时，StHB14是唯一在各个阶段表达量下调的基因；在地下部分，PEG抑制StREV表达，NaCl抑制StHB14的表达。
4. 利用WMD3平台设计stu-miR166b的引物，以pRS300质粒为模板经过两步PCR合成了含有miR166b成熟体的前体序列，将miR166b插入由组成型CaMV35S启动子驱动的pCPB121 载体上，经过农杆菌介导法将其转入甘农薯2号，获得4个转基因株系。qRT-PCR检测表明L1、L3靶mRNA表达水平不同程度的下降了0.35-5倍，表型分析表明L1、L3生长受到抑制。
关键词：马铃薯；miR166b；生物信息学；HD-ZipⅢ；RLM-RACE；表达载体；转基因植株
IV
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are endogenous, small non-coding RNAs that are involved in post-transcriptional gene silencing. In plants, most miRNA recognized target mRNA sequence by near-perfect complementary way in the post-transcriptional level, which causing degradation of the target genes or inhibiting its translation, and ultimately to suppress the expression of target gene. miR166 is a class highly conserved miRNA in monocots and dicots plants and its targets are the HD-ZipⅢsubfamily members which regulated apical meristem, vascular bundle, paraxial region lateral organs developmentally.In this paper, three target genes of stu-miR166b was cloned from potato, then bioinformatics analysis and cleavage site for verification, study the tissue expression pattern and stress response of stu-miR166b and its target genes;Using pRS300 plasmid as a template to construct plant expression vector contain miR166b mature sequences,through Agrobacterium-mediated transformation into a test tube potato and obtained transgenic plants and further analysis phenotypic. The main results of this paper are as follows:
1. There have four stu-miR166 precursor in the potato genome, transcribed sequence are not the same three mature body stu-miR166a5p、stu-miR166a3p and stu-miR166b. stu-miR166a5p predicted target genes are some hormones and early dehydration protein. stu-miR166b have five target genes PGSC0003DMT400030829 (StHB14)、PGSC0003DMT400054421(StHB14-like)、PGSC0003DMT400020801 (StREV)、PGSC0003DMT400006735(StHB15) and PGSC0003DMT400068037 (StHB15-like). According transcriptome sequence NCBI registration and RT-PCR technique, which three gene StHB14, StHB15and StREV was cloned, respectively. Bioinformatics analysis showed StHB14、StHB15 and StREV are non-secreted proteins, them have unique characteristic of HD-ZipⅢtranscription factor. Through RLM-RACE is determined stu-miR166b cutting target gene in the tenth to eleventh of complementary binding region.
2. Expression analyses revealed that stu-miR166b/StHB14、StHB15 and StREV
V
gene was expressed in root, stem, leaf of potato, and stu-miR166b with a relative higher expression level in root of potato. Conversely, StHB14, StREV expression abundance is lowest in root, StHB14 in stem lowest.
3. qRT-PCR analysis showed that stu-miR166b/StHB14, StHB15and StREV have different transcription patterns in two stress treatments of above and underground tissues. In addition to the aboveground parts of NaCl for 24h and underground parts of PEG stress after 24h stu-miR166b expression decreased, others stu-miR166b expression levels rised. When aboveground under PEG and NaCl stress, StHB14 is unique expression level down-regulated genes throughout the stages. In the underground part, when subjected to PEG stress StREV expression level down, NaCl inhibited the expression StHB1
4.
4. Designing primers of miR166b by WMD3 platform, after a two-step PCR synthesized precursor sequence containing miR166b mature sequence by pRS300 plasmid as a template.We constructed transgenic vector containing CaMV35S promoter and then obtained four miR166b-overexpresed potato plants by Agrobacterium-mediated transformation.qRT-PCR analysis showed that the target mRNA expression levels decreased in varying degrees of 0.35-5 times.Phenotypic analysis showed that transgenic plants growth was inhibited.
Keywords: Potato; miR166b; Bioinformatics; HD–ZipⅢ; RLM–RACE; Expression vector; Transgenic Plants
VI
缩略语表
Abbreviations
英文缩写英文全称中文名称
CaMV35S Cauliflower mosaic virus 35S35S启动子
cDNA Complementary deoxyribonucleic acid互补DNA
dd H2O Double distilled water双蒸水
DNA Deoxyribonucleic acid脱氧核糖核酸
HD-ZipⅢHomeobox-leucine zipper protein同源异性域亮氨酸拉链蛋白Kan Kanamycin 卡那霉素
nptⅡNeomycin phosphotransferaseⅡ新霉素磷酸转移酶基因
P5CR Pyrroline-5-carboxylate synthetase吡咯啉-5-羧酸还原酶
P5CS Pyrroline-5-carboxylate synthetase吡咯啉-5-羧酸合成酶
PCR Polymerase chain reaction聚合酶链式反应
PEG Polyethylene glycol聚乙二醇
qRT-PCR Real time quantitative PCR实时定量荧光PCR
RACE Rapid-amplification of cDNA ends cDNA末端快速克隆
Rif Rifampicin 利福平
RNA Ribonucleic acid核糖核酸
VII
1 文献综述
1.1小RNA(Small RNA)概述
真核生物中含有大量长度小于50nt的非编码小RNAs(sRNAs)，主要包括小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)二种类型[1]，它们分别在转录后水平和转录水平调节基因的表达，包括细胞增殖、分化和凋亡等一系列生理进程，由此组成了非编码RNA调控网络[2]。2006年7月，Aravin和Girard等[3-4]报道了与前两种sRNAs结构不同的一类非编码小RNA (Piwi-interacting RNA，piRNA)，目前其详细的作用机制及其生物学功能还在研究中[3-4]。植物中，研究比较成熟的是siRNA和miRNA。siRNA是广泛存在于各种真核生物中的一类长度为21-25个核苷酸的双链小分子，由细胞中的双链RNA 酶Dicer剪切双链RNA (dsRNA) 或具有较长发夹结构的RNA生成[2,5]。siRNA 主要结合到以AGO 蛋白为核心的RNA 沉默复合体(RNA inducing silence complex，RISC)上，通过与靶mRNA碱基互补结合在RNA 水平上对核苷酸修饰，或者对mRNA进行剪切、阻碍蛋白翻译[5]。miRNA是一类内源性的具有调控功能的长为18-25个核苷酸的单链小分子，来自于基因内含子或基因间序列，在进化上相对保守[6]。与siRNA不同，植物体内具有茎环结构的前体RNA在DCL1等一系列酶的作用下形成单链miRNA与沉默复合体RISC 结合，通过结合靶mRNA实现剪切或阻碍翻译[6]。蠕虫和哺乳动物基因组中大约1.5-2%的基因被认为是编码蛋白质的基因，miRNAs占有1-2%，可以预测miRNA功能是相当显著的[3]。事实上，RNAi介导的调控包括miRNA(图1.1)。siRNA通常通过与其靶mRNA序列互补结合来干扰其表达，piRNA的功能是激活部分基因表达以维持生殖系统的完整性和生育能力。
1
2
图 1.1 真核生物和原核生物中类似的RNAi 机制
Fig. 1.1 RNAi in eukaryotes and a similar mechanism in prokaryotes
真核生物中RNAi 技术包括siRNA(小分子干扰RNA)，微小RNA(microRNA)，和piRNA(PIWI 相互作用RNA)；CRISPR 是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，
可用来对抗入侵的病毒及外源DNA
RNAi consists of siRNAs (small interfering RNAs), microRNAs (microRNAs), and piRNAs (piwi –interacting RNAs) in eukaryotes. CRISPR loci in prokaryotes and archaeal genomes harbor
short invader –derived sequences that are transcribed to target complementary RNAs
1.2 miRNA
一个miRNA 在每个细胞中存在很多的拷贝，但就整个细胞所有的RNA 而言，其含量很少，然而对细胞正常代谢必不可少[6]。不同植物的大多数miRNA 成熟体序列是高度保守的，通过调节相同类型转录因子进而作用于下游功能基因，参与调控植物生长发育以及对外界环境胁迫应答等生物学过程。
1.2.1 miRNA 的发现
1993年，Lee 等[7]人用克隆技术在研究隐杆线虫(Caenorhabditis elegans ，C. elegans )发育时首次发现其体内存在一种长度为21nt 的sRNA-lin 4。lin 4产物为环状结构，不能翻译为蛋白质，与其靶mRNA 的3′UTR 区域互补结合，从而降解或者抑制其翻译，参与调控线虫胚胎发育后期相关功能基因的表达，控制着C. elegans 幼虫由L1向L2期的转化[7]。缺失lin 4的线虫不能从Ll 期转化为L2期发育为成虫[7]。21世纪初，Reinhart 等[8]在线虫中发现了与蜕皮激素相关的sRNA-let 7，存在于C. elegans 幼虫的大部分阶段，抑制let 7基因的表达，线虫停留在幼虫期；相反，超量表达let 7促进幼虫早熟[8]。进一步研究还发现，let 7
表达调控模式在动物中高度保守。
21世纪以来，逐步发表了有关植物miRNA的报道[9]。随后，在拟南芥、水稻等模式植物和甘蔗、高粱以及苔藓植物中检测到了大量的miRNAs[10-13]。迄今为止，人们通过随机克隆和生物信息学等方法在动植物、真菌和病毒中发现的miRNA数量已经超过28645种( https://www.360docs.net/doc/4e8827505.html,, Release 21: June 2014)。
1.2.2 miRNA的生物合成
一半以上的miRNA来源于两个蛋白翻译区域之间或内含子区，因此它具有独立的转录单位[14]。miRNA形成的第一步是RNA聚合酶II介导生成初级miR NA前体(pri-miRNAs)[15](图1.2)；pri-miRNA结构类似于mRNA，有5'帽子结构和一个poly-A尾巴，含有成熟miRNA序列；紧接着，pri-miRNA结合RNA Ⅲ、Drosha和DEAD盒RNA解链酶等形成一种复合物[16]，通过Drosha酶作用于pr i-miRNA从而裂解产生有几十个核苷酸的前体微RNA(pre-miRNA) (图1.2)；pr e-miRNA借助GTP能量在核蛋白Exportin-5和其他一些因子如Exportin1(XPO1)等的作用下由细胞核转出至细胞质内，在内切核糖核酸酶Dicer的作用下产生约22个核苷酸长度的成熟miRNA双链(miRNA/miRNA*)[17-19]。
与动物miRNA产生有所不同，植物miRNA来源于基因组中独立的MIR，同一个初级转录体的miRNAs 基因通常会排列在一起[19]。MIRNA在HYL1(Hy ponastic Leaves 1)和其他因子的作用下被DCL1(Dicer-like)蛋白催化形成miRN A*miRNA双链体；然后miRNA*miRNA双链体中的2′-羟基或3′-羟基在HEN1 (hua enhancer 1)作用下发生甲基化；接着，miRNA被运送到细胞质中在HST(H asty)和其他因子的参与下和成熟的甲基化miRNA*miRNA与AGO1(Argonaute 1)等一起形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，接着miRNA*被降解，而RISC中的miRNA在AGO1作用下剪切或抑制靶mRN A的翻译[19-21]。
3
图1.2 miRNA 的生物发生模式图
Fig. 1.2 The model for miRNA biogenesis
1.2.3 miRNA的作用机制
最近，在动、植物及病毒等生物中研究证明miRNA主要是通过5'端种子序列(seed sequence)的7nt序列与靶mRNA 3'UTR 的miRNA调控元件(miRNA regulatory element，MRE)相互作用识别靶mRNA[22]。一些靶mRNA的其他特征，
如靶mRNA与miRNA的13~16位碱基配对、MRE附近富含AU碱基等均可增
4
强miRNA的作用效率[23]。miRNA与靶mRNA之间的作用方式取决于碱基配对程度，大部分的植物miRNA与靶mRNA高度配对导致靶mRNA被剪切和降解；但是在动物中，大多数miRNA与其靶mRNA的3′UTR区域识别位点以不完全配对方式结合阻止mRNA的翻译，但不影响靶mRNA的稳定性[23]。
植物体内miRNA上的RISC复合体中的AGO1蛋白能够切开靶mRNA中的磷酸二酯键使靶mRNA成为小片段。例如，ath-miR164与NAC1(NAM/ATAF/CUC1)转录因子结合并指导RISC中的AGO1蛋白剪切NAC1 mRNA调控下游基因的表达影响拟南芥侧根发育[24]；Guo等[25]研究发现miRNA164通过直接剪切ZmNAC1调控下游相关基因的表达影响生长素信号转导途径，最终促进水稻侧根增多；Boualem等[26]通过5′RACE PCR证实了模式植物蒺藜苜蓿中miR166能够直接切割靶基因HD–Zip III类转录因子MtCNA1、MtCNA2和MtHB8，并且其剪切位点均在START结构域的互补区第10位和第11位之间，超量表达miR166转基因蒺藜苜蓿相比野生型减少了根瘤和侧根的数量；Kim等[27]发现miR166能与ATHB15 mRNA结合，在互补区第10位和第11位之间直接切割ATHB15 mRNA降解形成小片段。二是miRNA 介导的翻译抑制，即miRNA通过和靶mRNA碱基不完全配对的方式抑制翻译，但不影响靶mRNA转录。如Chen[28]首先发现miR172能减少APETALA蛋白质的含量但不影响mRNA的表达量；ath-miR393b调控MEMB12的表达是翻译抑制[29]。后来Schwab等[30]研究发现miR172在调节APETALA2表达是RISC介导的剪切作用和miR172介导的翻译抑制共同作用，RISC介导的剪切占主要部分。要确定miRNA以上述何种方式起作用，首先要研究miRNA表达量变化所引起的靶mRNAs和靶蛋白的含量变化。Leave等[31]发现，拟南芥中miR171与SCL转录因子家族3个成员的mRNA在ORF (open reading frame，ORF)区域互补结合，而不是3′UTR，以类似RNAi的作用降解靶mRNA，此研究表明，植物中部分miRNA的作用机制与动物相似。
1.2.4植物miRNA调控的主要靶标
目前研究表明大多数植物miRNA的靶基因为转录因子、泛素结合酶和F–box 蛋白等，暗示miRNAs处于基因表达调控网络的中心。以前研究表明DCL1和
5
AGO1既参与了miRNAs的形成，亦是miRNAs的靶基因，如miR168作用于AGO1蛋白，表明miRNAs 存在反馈调节机制。另外ATP-硫酸腺苷转移酶、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等也是miRNAs所调控的靶标。表1-1简要列出了一些保守的miRNA的靶基因。
表1-1 常见的应激反应miRNA和其靶基因
Tab.1-1 Common stress-responsive miRNA and their targets
miRNA家族miRNA family 靶基因
Target family
已确认的靶标基因
Confirmed targets
miR156 SBP SPL2/3/4/10
miR159/319 MYB、TCP MYB33/65，TCP2/3/4/10/24
miR167/160 ARF ARF6/8/10/16/17
miR161 PPR At1g06580
miR163 SAMT At1g66690/At1g66700/At1g66720
miR164 NAC CUC1/CUC2/NAC1
miR165/miR166 HD-ZipⅢPHB/PHV/REV/ATHB–8/ATHB–15
miR168 AGO AGO1/AGO2
miR169 NF–YA YA1/YA2
1.2.5植物miRNA的功能
miRNA在植物中发挥了重要作用，参与调控植物生长发育各个方面，包括根、叶、花等器官的形态建成、细胞分化、组织形成、新陈代谢、激素分泌、信号传导以及逆境胁迫响应等生物学过程[32-35]。
1.2.5.1 miRNA与植物的生长发育
miRNA调节植物由营养生长转化为生殖生长，幼叶变为成熟叶，器官极性的建立，花分生转为花生长等。前人指出，miR172和miR156调控植物从营养生长转变为生殖生长。在水稻中，超表达miR172的转基因植株推迟了小穗分生组织向小花分生组织的转化[36]。相比野生型拟南芥，miR156超表达导致叶片早熟和分蘖[37]。Jung等[38]发现miR166调控拟南芥侧生组织和顶端分生器官的形成。Palatnik等[39]研究得知miR319能调节TCP转录因子(TB1/CYC/PCFs，TCP)家族成员改变叶片形态结构，超表达miR319的植株产生不规则形状果实、叶片边缘锯状化和偏上生长、开花期延迟等不正常的多效表型(pleiotropic phenotype)。
1.2.5.2 miRNA参与植物的激素应答和信号转导
植物正常生长发育离不开激素的作用，激素参与器官的形成与应答环境胁迫
6
反应。目前发现，许多植物激素的信号分子是miRNAs的靶标。miR160和miR167 的靶基因同属ARF家族不同的基因，暗示它们在调控靶基因的方式既有相似性又有特异性，miR160对ARF10的负调控作用在种子发芽和胚胎形成后期阶段调解正常的生长素和ABA信号平衡[40]。外源乙烯处理拟南芥使miR847表达升高；超表达miR847的拟南芥侧根和叶片数目增多，叶片变大，以及叶边缘齿状化等；进一步研究发现超表达miR847与敲除IAA28的突变体拟南芥表型类似，miR847与IAA28有着相似的表达谱，由此表明miR847调节IAA28 mRNA表达水平从而刺激生长素转导途径[41]。Zhang等[42]利用Illumina SBS高通量测序和小RNA表达谱鉴定了生长素、ABA、茉莉酸等激素信号通路相关的miRNA，其中miR160、miR167、miR390和miR393调控生长素信号通路。以上研究表明，miRNA在激素平衡和信号通路中发挥着重要的作用。
1.2.5.3 miRNA与植物代谢以及胁迫应答调控
miRNA调控次生代谢物研究方面最有力的证据是miR474靶向调控脯氨酸脱氢酶(proline dehydrogenase，PDH)，同时PDH调节脯氨酸(proline，Pro)的降解。最近研究表明缺水诱导玉米中miR474表达，降低PDH的含量会提高植物体内Pro的含量，增强植物的耐旱性[43]。Yang等[44]通过高通量测序分析表明在马铃薯中miR172、miR396a、miR396c、miR4233可能调控P5CS基因；miR2673、miR6461调节P5CR和ProDH基因，而上述基因均参与了Pro的合成或降解。Zhang等[45]通过高通量测序得知PEG胁迫诱导马铃薯100条miRNA上调，99条miRNA下调。Northern杂交显示干旱和ABA处理拟南芥幼苗后，miR393、miR397b和miR402的相对表达量升高，然而miR389a表达量下降[10]。Zhao等[46]研究发现水稻中的miR169g在根部表达量显著高于其他组织，干旱处理后miR169g的表达量在根部合成比茎部更迅速，显示根部miR169g在水稻耐逆境反应中有重要的作用。
1.3 转录因子
1.3.1 HD-Zip转录因子概述
转录因子(transcription factor，TF)是能和真核生物基因的启动子区域中顺式作用元件特异性结合激活或抑制下游基因转录与表达的一类蛋白[47]。HD-Zip是
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植物保守的转录因子之一，由DNA-同源结构域(HD)和附加的Leu zipper(Zip)元件组成，HD与DNA序列结合，Zip介导蛋白二聚体的形成[48]。HD-Zip转录因子已经分别从拟南芥(Arabidopsis thaliana)[49]、苜蓿(Medicago truncatula L.)[50]、小立碗藓(Physomitrella patens H.)[51]、烟草(Nicotiana tabacum L.)[52]、向日葵(Helianthusannuus L.)[53-54]、小麦(Triticeae asetivum L.)[55]中被克隆。根据序列特点和结构、功能的差异，HD-Zip转录因子分为4个亚家族(HD-Zip Ⅰ~Ⅳ)[48]。研究表明HD-Zip转录因子亚家族I和II成员通过与相关激素基因和下游基因互作来影响细胞扩增、分裂和分化，从而提高植物耐逆性；HD-ZipⅢ和HD-ZipⅣ成员参与调控植物生长发育。HD-ZipⅢ亚家族成员主要调控顶端分生组织、维管束、近轴区域横向器官的发育[48]。
1.3.2 HD-ZipⅢ转录因子
HD-ZipⅢ转录因子有4个结构域，从N端到C端顺次是同源异型结构域(Homeodomain，HD)、亮氨酸拉链结构域(leucine-zipper domain，Zip)、START 结构域(steroidogenic acute regulatory protein-related lipidtransfer)和MEKHLA结构域[56]。HD序列包括60或61个保守型氨基酸，其通过结合下游DNA序列，调控基因转录与翻译；Zip结构序列产生同源或异源二聚体发挥功能[56-57]。研究表明START结构域为高度保守的脂质/类固醇结合受体；羧基末端含有以6个高度保守的非连续氨基酸缩写的大写首字母命名的MEKHLA序列，分别为Met、Glu、Lys、His、Leu和Ala[57]。
HD-Zip III陆续从苔藓、蕨类和裸子植物，再到被子植物中被克隆[58-59]。单子叶植物水稻(Oryza sativa)中有5个HD-Zip III基因，分别为OsHB1-5[60]；木本植物毛果杨(Populus trichocarpa) 有8个HD-Zip III基因家族成员，分别为PtHB1-8[61]；双子叶植物拟南芥(Arabidopsis thaliana) 有5个HD-Zip III家族共成员，分别是、PHAVOLUTA/AtHB9(PHV)、PHABULOSA/AtHB14(PHB)、REVOLUTA/IFL1(REV)、AtHB8和AtHB15/CORONA(CNA)，它们之间的同源性在60%-85%之间。在不具备维管束的土生小型藓类球蒴藓(Physcomitrella patens)中，有5个HD-ZipIII基因[51]。裸子类植物火炬松(Pinus taeda) 和白云杉(Picea glauca)中分别克隆得到5个和4个HD-Zip III基因[62]。
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拟南芥中，miR166通过作用于HD-ZipⅢmRNA，调控植物顶端分生组织的形成，花器官的发育，侧分生组织的形成，叶极性的建立及维管束的发展，并参与调节植物逆境应答[63-65]。miR166b/HD-Zip III作为在植物中一种保守的调控模式在植物生长发育和响应非生物胁迫领域有很多研究。目前，研究人员开始高度关注miR166b/HD-Zip III参与胁迫代谢的调控。
1.3.3 amiRNA技术
近年来，随着内源miRNA调节基因表达的研究日益深入，amiRNA沉默基因的技术成为研究miRNA功能的新工具，其原理是采用植物内源miRNA前体序列作为具有茎环结构的基本骨架，通过置换茎环结构中的miRNA/miRNA* 序列为可与目标靶mRNA配对的amiRNA/amiRNA*，经过细胞内的加工最后形成具有新功能的amiRNA，从而调控生物体内一个或多个序列高度相似靶基因表达[66]。目前，较为常用amiRNA技术是Ossowski等[67]在2006年根据拟南芥miR319的前体结构而设计的，对于内源miRNA和相关功能基因等都可以设计amiRNA。该技术利用WMD3网站(https://www.360docs.net/doc/4e8827505.html,/cgi-bin/webapp.cgi)设计扩增内源miRNA需要的引物序列，以包含拟南芥miR319结构序列的pRS300质粒为模板，通过重叠PCR(overlapping PCR)获得pre-amiRNAs，然后将pre-amiRNAs连至表达载体并转化植物，根据观察转基因植株的表型和检测其体内相关基因的表达水平来研究miRNA的功能。
1.3.3.1amiRNA技术在植物育种和抗非生物胁迫方面的应用
人口增长和全球工业化改变了大气结构和土壤成分，促进了全球环境变暖，目前这两个因素继续成倍地增加；另一方面非生物胁迫如干旱和盐度显著影响植物正常生长，从而降低其有效成分质量和产量[68-69]。非生物胁迫对植物的影响反映在不同的子生物体在生物化学，生理学，细胞，分子，甚至最后生物体的水平[70-71]。许多研究已经证明，非生物胁迫抑制种子萌发，幼苗发育，根发育，叶绿素的合成和光合作用，而且引起氧化胁迫，如产生活性氧，影响植物正常发育。非生物胁迫也会改变基因在各个的生长阶段的表达谱，这些基因表达程序的变化最终调控植物生长[72]。一些重要的转录因子已被证明应答非生物胁迫，在模式植物拟南芥和其他农业作物中的转基因试验已表明其能够显著改善植物耐胁迫的能力[73]。在过去十年中，随着微阵列和下一代测序等新技术的出现，从而发
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现了数以百计的与多种逆境相关的蛋白编码基因。随之，科学家又产生了新的凝问，例如这些蛋白编码基因是如何调控的，不同的非生物胁迫响应什么样的基因网络？最近发现的miRNA可能是调控网络的一部分。因此，miRNA正在成为改良植物品种的新靶标，通过构建相关的miRNA过表达载体并转化作物是改良作物品种的有效方式[74]。
迄今为止，许多的miRNA已在多个植物中实现了过表达(见表1-2)。miR156过表达植物对热激胁迫的耐力增强，超表达miR156的柳枝稷相比野生型多出了58%-101%的生物产量[75]。一项研究发现，相比野生型水稻，过表达miR159对于热胁迫更敏感，这就暗示了下调miR159的表达可以增强水稻对于热胁迫的忍耐力[76]。miR169是最大的保守型植物miRNA家族之一，其显著的功能就是促进植物发育和应答各种环境胁迫。组成型启动子驱动的miR169过表达番茄在干旱处理7天后一些抗旱指标优于对照，在干旱处理期间，野生型番茄表现出明显的脱水症状，包括萎蔫和细胞压损失。然而，过表达miR169植株生长良好，此外，与野生型番茄比较，转基因番茄气孔开度指数减少了35-49％，转基因番茄的蒸腾速率降低了38-55％[77]。另一方面，过表达miR169的拟南芥植株对于氮缺乏胁迫表现出了更敏感的症状，如转基因植株叶片相比野生型更容易变黄，因此，miR169成为一个对改善氮元素缺乏和干旱地区分子育种的靶标之一[78]。张等[79]报道过表达OsmiR397通过下调靶基因OsLAC从而引起了水稻幼橞分蘖和颗粒增大，最终增加产量。一直以来，miR397在不同的植物中是高度保守的，这种策略可以扩展到其他谷类作物上用于提高产量。
表1-2 超表达miRNA改变植物耐受环境胁迫的一些研究Tab. 1-2 A list of studies that overexpressed miRNA in order to alter plant tolerance to
environmental stresses
Trait improved miRNA Target Plant
Drought tolerance miR169 NFYA5/ GmNFYA3 Arabidopsis; Soybeanand
Arabidopsis
Cold tolerance miR319 PCF5/PCF8 Rice
Heat stress tolerance miR398 CSD1/CSD2/CCS Arabidopsis
Grain size,shape,and quality miR156 SPL14/SPL16 Rice
Parthenocarpy miR397/167 OsLAC/ ARF8Rice Arabidopsis; tomato Bacterial resistance miR393 TIR1Arabidopsis Cauliflower mosaic virus amiR171 2b of CMV Tobacco
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(CMV)resistance
Tomato leaf curl NewDelhi virus
(ToLCNDV) resistance
amiR–AV1–1 AV1/AV2 Tomato
TurnipYellow MosaicVirus (TYMV)and TurnipMosaic Virus (TuMV) resistance amiR159 P69 of TYMV and HC–Pro
of TuMV
Arabidopsis
注: 表1-2参考文献[74]
1.3.3.2 miR166/HD-ZipⅢ的研究现状
miR166是单子叶与双子叶植物中高度保守且成员众多的一类miRNA[80]。不同植物中的miR166有着同一类靶基因即HD-ZipⅢ转录因子，如棉花[81]、拟南芥[82]、油橄榄[83]。miR166b/HD-Zip III在植物生长发育领域和其参与胁迫代谢调控已有许多研究。例如，干旱诱导野生二粒小麦[84]和蒺藜苜蓿[85]中miR166的表达，盐胁迫下马铃薯[86]、玉米[87]中miR166相对表达量上调，冷胁迫抑制水稻[88]miR166表达，表明miR166响应非生物胁迫。
1.4 全文总体研究路线
1.5本研究的目的意义
克隆马铃薯stu-miR166b靶基因家族成员，对于miR166/HD-ZipⅢ做生物信息学分析，研究miR166/HD-ZipⅢ在不同组织中的表达模式和应答PEG和盐胁迫时的表达模式，对于深入研究miR166及其靶基因的功能奠定基础。
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一个miRNA可以调控多个靶基因，因此构建stu-miR166b超表达载体，转化马铃薯以期为研究miR166/HD-ZipⅢ在生长发育方面的功能奠定基础。
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