0002改良抗酸染色(sop)
改良抗酸染色操作程序
1 目的
改良传统抗酸染色方法，以增加抗酸杆菌检出的阳性率。
2 原理
由于抗酸杆菌含有分枝菌酸，可与石碳酸复红牢固结合。因其不允许被石碳酸复红染上色的类脂质外溢，所以抗酸杆菌虽经盐酸酒精脱色，但仍能保持红色。而非抗酸杆菌则被染为蓝色。
改良抗酸染色法在标本制备及染色方面的改进，极大地提高了细胞内外抗酸杆菌检出的阳性率。
尤其是细胞内抗酸杆菌的检出，有助于临床判定现症或潜伏感染。
3 仪器
3.1 器材
3.1.1 FMU-6型细胞涂片离心仪
3.1.2 FMU-6型细胞涂片沉淀器
3.1.3 显微镜。
3.1.4 载玻片
3.2 试剂
3.2.1 0.3 % TritonX-100萋纳石碳酸复红溶液
碱性复红乙醇饱和溶液10 ml
5 % 石碳酸溶液90 ml
TritonX-100 0.3 ml
3.2.2 脱色剂
浓盐酸20 ml
95 % 乙醇80 ml
3.2.3 复染液（吕弗勒美篮液）
美篮乙醇饱和溶液30 ml
10 % 氢氧化钾0.1ml
蒸馏水100 ml
3.2.4 0.3 % TritonX-100（曲拉通）溶液
TtritonX-100 3 ml
蒸馏水1000 ml
3.2.5 APES（3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷）工作溶液
现用现配，用丙酮1:50稀释。
3.2.6 固定液（pH 6.6）
丙酮45ml
甲醛25ml
磷酸氢二钠20mg
磷酸二氢钾100mg
蒸馏水30ml
3.2.7 0.1M 磷酸盐缓冲液（PH7.4）
Na2HPO4·12H2O 26.46 g
NaH2PO4·2H2O 2.664 g
NaCl 40 g
KCl 1.8 g
蒸馏水900 ml
4 操作步骤
4.1 载玻片处理
将酸碱处理后的载玻片浸泡于APES工作溶液30秒，取出冲洗，晾干，备用。
4.2 标本收集
4.2.1 将载玻片和滤纸插入FMU-6型细胞涂片沉淀器中，滤纸上的孔必须与FMU-6型细胞涂片沉淀器上
的孔对准，并旋紧FMU-6型细胞涂片沉淀器。
4.2.2 在FMU-6型细胞涂片沉淀器的沉淀管中加入0.5 ml 脑脊液（若脑脊液呈浑浊或血性，应先根据情
况稀释后再加入）。
4.2.3 将FMU-6细胞涂片沉淀器放入FMU-6细胞涂片离心仪的挂钩上，盖上离心仪的盖子，离心3 ~ 5 分
钟。待脑脊液中的有形成分完全沉淀到玻片上后，取下涂片固定。
4.3固定
将涂片浸泡于固定液中30秒，水洗，晾干。
4.4 染色步骤
4.2.1 固定后的涂片浸泡于0.3 % TritonX-100溶液30分钟，0.1M磷酸盐缓冲液洗3次，晾干。
4.2.2 初染涂片加0.3 % TritonX-100萋纳石碳酸复红溶液，染5分钟，水洗。
4.2.3 脱色脱色剂脱色约1分钟，轻轻摇动玻片，无红色脱落为止，水洗，晾干。
4.2.4 复染复染液复染0.5 ~ 1分钟, 水洗。自然干燥后镜检。
5 结果判断
抗酸杆菌呈红色，非抗酸杆菌呈蓝色。
6 质控
6.1 质控菌株及质控频率利用铜绿假单胞菌ATCC27853、结核杆菌ATCCH37RV做阴阳性质控对照，每
日及更换染液批号时质控。
6.2 质控方法参照麦氏比浊仪或麦氏比浊管，将标准菌株配制菌液3 MCF浓度单位，高压灭菌后储存
冰箱备用。或将高压后的菌液制成均匀的图片，放置室温备用。
7 注意事项
7.1 凡需进行抗酸染色的标本，每份标本只允许单独涂在一张载玻片上，不得将两份或两份以上的标本涂
在同一张载玻片上，以免染色过程中因冲洗菌体脱落，致阴阳性结果混淆。
7.2 抗酸染色切勿使用染色缸，以免着色的抗酸菌可能自涂膜上脱落而浮游于染色液或脱液缸中，连续使
用造成假阳性的出现。染色后印干用的滤纸，不得重复使用。
7.3 脱色时间需根据涂片薄厚而定，厚涂片可适当延长，以几乎无红色为度。
8 临床意义
针对结核病、麻风病的细菌检查，初步诊断。奴卡菌可呈弱抗酸性，有利于鉴定细菌。
9 安全防护措施
9.1 为了防止交叉感染，标本应先高压灭菌后再涂片染色，气管刷片标本，应在紫外线灯下照射30分钟进
行染色镜检。
9.2 镜检后的玻片均浸泡在含有有效氯1000 mg / L 的消毒液。
10 参考文献
10.1 周庭银编著.临床微生物学诊断与图解. 第二版. 上海. 上海科学技术出版社，2007
10.2 叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程. 第三版. 南京. 东南大学出版社，2006
10.3 张秀珍，朱德妹主编. 临床微生物检验问与答. 北京. 人民卫生出版社，2008年7月.
11 支持文件
微生物室室内质量控制管理程序
12 记录表格
抗酸染液质控记录表
抗酸染色——标准操作
抗酸染色 一、原理 本试剂盒采用WHO推荐的Ziehl-Neelsen法分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色。齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。 二、试剂 石碳酸复红染液、酸性酒精溶液、亚甲蓝溶液 三、方法 1.涂片：参见各标本操作程序涂片，涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰
2.固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色 3.染色 3.1 滴加石碳酸复红染液盖满玻片，染色10分钟或更久，无需加温 3.2 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水 3.3 滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色1-2分钟，如有必要，需流水冲去溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止 3.4 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水 3.5 滴加亚甲蓝溶液，染色30秒钟 3.6 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检 3.7 一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑块 四、结果判定 1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色
实验二十四 抗酸染色 - jpkchnadlcn
课程名称：微生物学检验技术 授课专业：医学检验 学时：2学时 实验十七结核杆菌检验 (M.Tuberculosis Test) 一、实验目的 ⒈掌握结核杆菌的菌落特征，镜下形态、染色特性 ⒉掌握抗酸染色的原理、操作步骤，结果报告 二、实验器材与试剂 ⒈菌种：BCG ⒉试剂：抗酸染液 ⒊其他：三脚架、铁片、木夹子等 三、实验内容 ㈠微生物学诊断 ⒈标本采取 根据病灶器官取材,包括痰, 尿, 脑脊液, 粪便等。 ⒉直接涂片抗酸染色镜检 浓缩集菌: 无其他杂菌污染的脑脊液、胸腹水等标本, 可直接离心沉淀集菌。有杂菌的标本如痰、尿、粪等标本, 先经4%NaOH或3%HCl或6%H2SO4处理30分钟, 杀死杂菌并使粘稠性有机物溶解之后, 再离心沉淀集菌。 ⒊抗酸染色 ⒋培养鉴定 ⒌动物试验(豚鼠): 将集菌后的材料注于豚鼠腹股沟皮下, 3-4 周后若局部淋巴结肿大, 结核菌素试验阳转, 即可进行解剖。观察肺、肝、淋巴结等器官有无结核病变, 并作形态、培养等检查。若6-8周仍不见发病, 亦应进行解剖检查。 ⒍结核菌素试验 ⑴用途:
测定机体对结核杆菌有无变态反应性─免疫性。 ⑵方法: 用旧结核菌素(OT)或纯蛋白衍生物(PPD)注射前臂皮内, 48小时-72小时观察有无红肿硬结。 ⑶结果: 出现红肿硬结直径大于5mm者为阳性, 说明机体对结核杆菌有免疫性;反之, 红肿硬结直径小于5mm者为阴性, 说明机体对结核杆菌无免疫性。大于15mm者为强阳性反应, 表明可能有活动性结核感染, 应进一步追查病灶。 ⑷实际应用: ①选择卡介苗接种对象和测定卡介苗接种后的免疫效果。结核菌素试验阴性者应接种或补种卡介苗。 ②在未接种卡介苗的人群中作结核杆菌感染的流行病学调查, 了解人群自然感染率。 ③作为婴幼儿(尚未接种过卡介苗者)结核病的辅助诊断。 ④测定肿瘤患者的细胞免疫功能。 ㈡培养特性（示教） 1.营养要求高常用的有Lowenstein-Jensen培养基, 内含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐和孔雀绿等。孔雀绿可抑制杂菌生长, 便于;分离和长期培养。蛋黄含脂质生长因子, 能刺激生长。 2.需氧, 加6-8%CO2可促进生长。 3.生长缓慢: 繁殖一代需18小时左右, 形成菜花样菌落需时两周以上。 ㈢形态染色（示教） 1.形态细长, 着色不匀, 排列成分枝或索状。 2.着色抗酸性─抗酸性染色。 ㈣抗酸染色法(acid-fast stain) ： ⒈原理: 结核分枝杆菌含脂质多,不易着色,先用石炭酸复红初染,染色时间要稍长,且需要加温。一旦细菌染上颜色，由于脂质的存在，即使强脱色剂也不能使之脱色,其它细菌均脱色,经碱性美兰复染,所以结核分枝杆菌呈红色,其它呈蓝色.
抗酸染色液(Kinyoun冷染法)
抗酸染色液(Kinyoun 冷染法) 简介： 分枝杆菌的细胞壁内含有大量脂质包围在肽聚糖的外面, 所以分枝杆菌一般不易着色。传统的染色方法要经过加热和延长染色时间来促使其着色。分枝杆菌中的分枝菌酸与染料一旦结合后，就很难被酸性脱色液脱色，故名抗酸染色。其中最具代表性是结核杆菌Ziehl －Neelsen 染色法，该法是WHO 推荐热染的方法。 Leagene 抗酸染色液(Kinyoun 冷染法)属于冷染色液，无需加热，相对较抗酸热染液安全。其染色原理是在室温条件下，分枝菌酸与复红结合成复合物，经亚甲蓝复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。该染色法较改良Kinyoun 冷染法要深，更适用于常规抗酸染色，Leagene 推荐该Kinyoun 冷染法作为实验室或临床上标准抗酸染色法。 组成： 自备材料： 1、 接种环 2、 载玻片 3、 蒸馏水 4、 显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、 接种环挑取待检样本，涂布于载玻片上，自然干燥。 2、 滴加Kinyoun 复红染色液，染色。 3、 不必加热，蒸馏水冲洗。 4、 用Kinyoun 脱色液脱色至无红色为止。 5、 蒸馏水冲洗。 6、 用亚甲蓝染色液染色。 7、 蒸馏水冲洗。 编号 名称 DM0035 3×50ml DM0035 3×100ml Storage 试剂(A): Kinyoun 复红染色液 50ml 100ml RT 避光 试剂(B): Kinyoun 脱色液 50ml 100ml RT 试剂(C): 亚甲蓝染色液 50ml 100ml RT 避光 使用说明书 1份
8、轻轻吸干水分，自然干燥。 9、油镜镜检。 染色结果： 抗酸菌红色 非抗酸菌、细胞、背景蓝色 注意事项： 1、每次使用后盖紧试剂瓶，以防试剂挥发和污染。 2、上述试剂均对人体有刺激性，请注意适当防护。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。有效期：12个月有效。 相关： = 编号名称 CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁) DC0032 Masson三色染色液 DG0005 糖原PAS染色液 DM0007 瑞氏-姬姆萨复合染色液 DM0016 增强革兰氏染色液 PW0053 Western抗体洗脱液(碱性) TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法) TC1213 总胆固醇(TC)检测试剂盒(COD-PAP单试剂比色法)
抗酸染色的原理
第十八章分枝杆菌属与放线菌 一、名词解释 1．抗酸杆菌2．索状因子3．旧结核菌素4．传染性免疫5．卡介苗(BCG) 6．硫磺样颗粒 二、填空题 l、分枝杆菌种类较多，将其分为三类①——、②——、③——。 2、结核分枝杆菌常用——染色，呈——色。 3、对人有致病性的结核分枝杆菌主要有——和——。 4、分离培养结核分枝杆菌常用——培养基，形成菌落需——时间。 5、结核分枝杆菌对干燥——、——和——抵抗力较强。 6、结核分枝杆菌对湿热较敏感，在液体中加热——℃——min即可被杀死。 7、卡介苗是用——制备而成的——疫苗。 8、卡介苗接种对象主要是——和——。 9、结核杆菌可发生——、——、——、——和——等变异。 10、结核杆菌感染分——和——。 11、结核杆菌生长——，一般需——周形成肉眼可见菌落。 12、结核病的治疗原则①——和——；②——、——。 13、麻风杆菌主要侵犯——和——，少数病例可累及——和——。 14、麻风分——和——两个型及——和——两大类，其传染性最强的是——型。 15、结核菌素试验常规取OT——个单位注射于前臂屈侧皮内——小时观察结果，如局部出现红肿结大于——mm者为阳性。 16、调查人群对结核有无免疫力，可用——试验，其原理是——，阴性结果一般说明机体——，无免疫力者应接种——。 17、放线菌属中的主要致病菌是。 18、放线菌为革兰染色——、——抗酸染色——的细长分枝状菌。 19、放线菌与真菌的根本区别是前者属于——型微生物，后者属于——型微生物。 20、衣氏放线菌存在于正常人的——，属正常菌群，引起的感染属——感染。 2l、诊断放线菌病的简便方法是在病变部位取脓汁查找——，其压片在显微镜下呈状。—— 22、放线菌在组织中形成的菌落被称为——。 三、最佳选择题 1、下列细菌中繁殖速度最慢的是( ) A．大肠埃希菌B．A群链球菌C．肺炎链球菌 D．结核分枝杆菌E．脑膜炎奈氏球菌 2、在液体培养基中形成菌膜生长的细菌是( ) A．变形杆菌B．葡萄球菌C．肉毒梭菌D．结核杆菌E．产气荚膜杆菌 3、与结核分枝杆菌抗酸性有关的成分是( ) A．磷脂B．蜡脂D C．分枝菌酸D．索状因子E．硫酸脑苷脂 4、不以内毒素或外毒素为致病物质的细菌是( ) A．绿脓杆菌B．炭疽杆菌C布氏杆菌D．白喉棒状杆菌E．结核分枝杆菌 5、卡介苗是( ) A．经甲醛处理后的人型结核分枝杆菌
抗酸染色液(改良Kinyoun冷染法)说明书
抗酸染色液(改良Kinyoun冷染法)说明书 货号：G1273 有效期：12个月有效。 产品内容： 名称3×50ml3×100ml Storage 试剂(A):改良Kinyoun复红染色液50ml100ml RT避光 试剂(B):Kinyoun脱色液50ml100ml RT 试剂(C):亚甲蓝染色液50ml100ml RT避光 产品说明： 分枝杆菌的细胞壁内含有大量脂质包围在肽聚糖的外面,所以分枝杆菌一般不易着色。传统的染色方法要经过加热和延长染色时间来促使其着色。分枝杆菌中的分枝菌酸与染料一旦结合后，就很难被酸性脱色液脱色，故名抗酸染色。其中最具代表性的是结核杆菌Ziehl－Neelsen染色法，该法是WHO推荐热染的方法。 抗酸染色液(改良Kinyoun冷染法)属于冷染色液，无需加热，相对较抗酸热染液安全。其染色原理是在室温条件下，分枝菌酸与复红结合成复合物，经亚甲蓝复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。该染色液较Kinyoun冷染法要浅，更适用于抗弱酸酸染色。 自备材料： 接种环、载玻片、蒸馏水、显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、接种环挑取待检样本，涂布于载玻片上，自然干燥。 2、滴加改良Kinyoun复红染色液，染色5min。 3、不必加热，蒸馏水冲洗。 4、用Kinyoun脱色液脱色3min。 5、蒸馏水冲洗。 6、用亚甲蓝染色液染色3～5min。
7、蒸馏水冲洗。 8、轻轻吸干水分，自然干燥。 9、油镜镜检。 染色结果： 抗酸或弱抗酸菌红色 非抗酸菌、细胞、背景浅蓝色 注意事项： 1、每次使用后盖紧试剂瓶，以防试剂挥发和污染。 2、上述试剂均对人体有刺激性，请注意适当防护。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
抗酸染色液(金胺O荧光法)
抗酸染色液(金胺O 荧光法) 简介： 分枝杆菌的细胞壁内含有大量脂质包围在肽聚糖的外面, 所以分枝杆菌一般不易着色。传统的染色方法要经过加热和延长染色时间来促使其着色。分枝杆菌中的分枝菌酸与染料一旦结合后，就很难被酸性脱色液脱色，故名抗酸染色。其中最具代表性是结核杆菌Ziehl －Neelsen 染色法，该法是WHO 推荐热染的方法。 Leagene 抗酸染色液(金胺O 荧光法)属于荧光染色液，无需加热，相对较抗酸热染液安全。其染色原理是在室温条件下Auramine O 染色以及复染后，用含有紫外光源的荧光显微镜检查，抗酸杆菌呈亮黄色，而其他细菌及背景中的物质呈暗黄色，这种方法可用低倍镜检，因此能更快速找出抗酸性菌。 组成： 自备材料： 1、 接种环 2、 载玻片 3、 蒸馏水 4、 荧光显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、 接种环挑取待检样本，涂布于载玻片上，加热固定。 2、 滴加金胺O 染色液，避光染色，水洗。 3、 用酸性脱色液脱色，直至涂片无黄色为止，水洗。 4、 用复染液染色，水洗。 5、 轻轻吸干水分，自然干燥。 6、 荧光显微镜下镜检。 染色结果： 编号 名称 DM0037 4×100ml DM0037 4×500ml Storage 试剂(A): 金胺O 染色液 100ml 500ml RT 避光 试剂(B): 酸性脱色液 2×100ml 2×500ml RT 试剂(C): 复染液 100ml 500ml RT 避光 使用说明书 1份
抗酸菌亮黄色或橘黄色 非抗酸菌、细胞、背景暗黄色 注意事项： 1、每次使用后盖紧试剂瓶，以防试剂挥发和污染。 2、金胺O荧光易衰减，尽量避光操作。 3、上述试剂均对人体有刺激性，请注意适当防护。 4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：12个月有效。 相关： 编号名称 CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁) DC0032 Masson三色染色液 DG0005 糖原PAS染色液 DM0007 瑞氏-姬姆萨复合染色液 DM0015 标准革兰氏染色液 PW0053 Western抗体洗脱液(碱性) TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法) TC1213 总胆固醇(TC)检测试剂盒(COD-PAP单试剂比色法)
细菌染色标本检查方法之抗酸染色法—萋-尼抗酸染色法
一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压—压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速—流速为0.1~10.0 ml/min。 高效—可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度—紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快—通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。 分辨率高—可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高—紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。 柱子可反复使用—用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收—样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 三、色谱法分类 按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC 应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。 按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。(此外还有电泳。) 按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。 四、色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。
抗酸染色
抗酸染色的原理： 分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。 齐- 尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。 实验材料： 细菌：结核杆菌 染液：1.石炭酸复红液、2.3%盐酸酒精、3.碱性美兰溶液 其它：接种环、酒精灯、载玻片等 1）石炭酸复红液 碱性复红乙醇染色储存液:碱性复红液:8g碱性复红溶于95%乙醇100ml中。5%石碳酸水溶液:5g石碳酸溶于100ml蒸馏水中。 2）3%盐酸酒精：3ml浓盐酸与97ml乙醇混合 3）碱性美兰溶液配方： A液：美兰0.6g 95%乙醇30ml B液：KOH 蒸馏水100ml 分别配制A液和B液，配好后混合即可。
实验方法： 1、细菌涂片标本的制备 涂片干燥固定 2、染色 1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3-5分钟，待标本冷却后用水冲洗。 2）脱色：3%盐酸酒精脱色30’’~1’；用水冲洗。 3）复染：用碱性美兰溶液复染1’，用水冲洗后用吸水纸吸干。 3、油镜观察 注意事项： 1、无菌操作 2、涂片厚度要适中 3、固定 4、冲洗 5、染色时间 6、初染加热的温度，勿沸腾 试剂萋尔尼染色法 （1）碱性复红乙醇染色储存液:碱性复红液:8g碱性复红溶于95%乙醇100ml中。5%石碳酸水溶液:5g石碳酸溶于100ml蒸馏水中。 （2）碱性复红乙醇染色液:10ml碱性复红储存液与90ml5%石碳酸水溶液混合。（3）5%盐酸乙醇脱色液:5ml浓盐酸与95ml乙醇混合。 （4）0.3%亚甲兰复染储存液:0.3g亚甲兰溶于50ml95%乙醇中，完全溶解后加蒸馏水至体温100ml。 （5）亚甲兰复染液:以蒸馏水10倍稀释0.3%亚甲兰复染储存液即得亚甲兰复染液。
抗酸染色法SOP
（一）试剂的配制 1 ．石炭酸复红染液： （1 ）储存液 ①碱性复红液：碱性复红8g，加95% 乙醇至100ml ，充分振荡使复红溶解。碱性复红乙醇储存液应避光保存，为保证染液的质量，建议储存液保存不超过6 个月。 ②5% 石炭酸水溶液：40～50℃水浴加热石炭酸使之融解，取液态石炭酸5g 溶于90ml热蒸馏水中，待溶液冷却至室温时，补充蒸馏水至100ml 。 （2 ）石炭酸复红工作液：经定性滤纸过滤的碱性复红储存液10ml与5%石炭酸水溶液90ml 充分振荡、混合均匀后，用定性滤纸过滤。碱性复红（或称为碱性品红，basic fuchsin，or pararosaniline chloride，分子式为C 19 H18NCl）用于AFB 染色时，必须使用染料最低含量超过88% 的生物染色剂，合格产品一般在试剂包装上注明相应含量。如果标注的染料含量低于88% ，则在配制时需调整称取量。例如，染料含量标注为75% 的产品，配制100ml 储存液时实际的称取量应是8/0.75=10.7g。 石炭酸（苯酚，phenol ，分子式为C 6 H6 O）:应使用熔点为40.5 ℃的分析纯试剂。 2 ．5%盐酸乙醇脱色液：35% 浓盐酸5ml 与95% 乙醇95ml混合。 3 ．亚甲蓝复染液： （1 ）储存液：亚甲蓝0.3g 溶于95% 乙醇50ml中，完全溶解后加蒸馏水至终体积 100ml 。 （2 ）亚甲蓝复染液：以蒸馏水5 倍稀释0.3%亚甲蓝储存液，经充分振荡、混合均匀后，亚甲蓝的终浓度为0.06% ，使用定性滤纸过滤，即得亚甲蓝染液。亚甲蓝（methylene blue chloride，or methylthionine chloride ，分子式为C 16 H18 ClN3S）：染色时必须使用染料含 量超过82% 的生物染色剂。 4 ．萋－尼氏染色步骤： 1. 涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10mm 以上的距离；火焰固定（在5秒钟内将玻片置于火焰上烤4 次）。 2. 滴加石炭酸复红染液，盖满痰膜(菌膜)，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5 分钟。染色期间始终保持痰膜(菌膜)被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。 *如样本是菌液，可加入少量血清或用紫外灯照射30min，增加菌液在玻片上的粘附力。 3. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。 4. 自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色1 分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。 5. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。 6. 滴加亚甲蓝复染液，染色30 秒钟。 7. 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检。一张染色合格的玻片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色。将染色后的玻片放置在报纸上，如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字，表明该玻片涂抹过厚。
抗酸染色操作
抗酸染色操作程序 【检验原理】 抗酸染色可将细菌分为两大类，即抗酸性细菌和非抗酸性细菌，因日常大多数病原菌为非抗酸性细菌，所以抗酸染色不作为临床上常规的细菌检测项目，只针对结核病等具有抗酸性细菌标本的染色。 【主要组成成分】 1.石碳酸复红溶液 2.脱色剂（3%盐酸酒精溶液） 3.复染液（吕氏美兰溶液） 【样本要求】 1.直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率； 2.直接用细菌染色，要注意防护，以防生物感染。 【检验方法】 1.涂片经火焰固定，加1液徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。染5分钟（若 染色奴卡氏菌需要更长时间），水洗。 2.加第2液不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗； 3.加3液，染0.5-1分钟，水洗。 4.干后油镜镜检。 【结果判断】 分支杆菌在暗背景中呈红色，背景为蓝色。 镜检结果分级报告 抗酸杆菌阴性（-）：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌 抗酸杆菌阳性（报告抗酸杆菌菌数）：1~8条/300视野 抗酸杆菌阳性（1+）：3~9条/100视野，连续观察300个视野 抗酸杆菌阳性（2+）：1~9条/10视野，连续观察100个视野 抗酸杆菌阳性（3+）：1~9条/每视野 抗酸杆菌阳性（4+）：≥10条/每视野 【注意事项】 1、严格掌握脱色时间，要脱色充分，脱色时间过短易使红色的石炭酸复红染料 残留显红色而造成假阳性。 2、在染片过程中，加1液后一定要酒精灯徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾， 这样才能使细菌充分着色。 3、石碳酸对皮肤、粘膜有强烈的刺激性和腐蚀性，使用时要注意安全，如果不 慎沾到皮肤上，立即用水或酒精冲洗。 4、涂片染色阳性只能说明抗酸杆菌的存在，不能区分是结核菌还是非结核分支 杆菌。
抗酸染色液(Ziehl-Neelsen热染法)操作步骤
南京森贝伽生物科技有限公司 网址：https://www.360docs.net/doc/409410532.html,/ 第1页 仅供科研 版本号：171116 抗酸染色液(Ziehl-Neelsen 热染法) 【产品组成】 【保存条件】 室温,避光,12个月 【产品概述】 分枝杆菌的细胞壁内含有大量脂质包围在肽聚糖的外面,所以分枝杆菌一般不易着色。分枝杆菌中的分枝菌酸不染料一旦结合后，就很难被酸性脱色液脱色，故名抗酸染色。传统的染色方法要经过加热和延长染色时间来促使其着色，其中最具代表性的是结核杆菌Ziehl －Neelsen 染色法，该法是WHO 和中国结核病防治规划中推荐的热染方法。 抗酸染色液(Ziehl －Neelsen 热染法)属于热染色液，其染色原理是在加热条件下，分枝菌酸不复红结合成复合物，经亚甲蓝复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。该试剂盒更适用于冷染法效果不佳的情况。 【使用方法】 1、接种环挑取待检样本，涂布于载玱片上，涂片加热固定。 2、滴加Ziehl －Neelsen 复红染色液，用火焰微热至出现蒸汽，一般该染色过程至少5min(必要时应补加染液、以防止染液蒸发)。 3、蒸馏水冲洗。 4、用Ziehl －Neelsen 脱色液脱色至无红色为止，一般1min 即可。 5、蒸馏水冲洗。 6、用亚甲蓝染色液染色1min 。 7、蒸馏水冲洗。 8、轻轻吸干水分，自然干燥。 9、油镜镜检。 【染色结果】 【注意事项】 1、每次使用后盖紧试剂瓶，以防试剂挥发和污染。 2、上述试剂均对人体有刺激性，请注意适当防护。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
抗酸染色液试剂盒使用操作步骤及注意事项
抗酸染色液使用操作步骤及注意事项 货号：G1170 规格：50ml×3/100ml×3 保存：室温干燥保存，有效期3年。 试剂盒组成： 3×50ml3×100ml Storage 试剂(A):Ziehl－Neelsen复红染色液50ml100ml RT避光 试剂(B):Ziehl－Neelsen脱色液50ml100ml RT 试剂(C):亚甲蓝染色液50ml100ml RT避光 产品说明： 抗酸染色用于细菌标本涂片或菌落涂片的染色。常用于对分枝杆菌属进行初步鉴别。普通细菌染色比较容易着色，而分支杆菌细胞壁含脂质较多，染色比较困难，必须加热才能被石炭酸复红着色。分枝杆菌菌体着色后，能抵抗盐酸酒精等酸性脱色剂的脱色，而其他细菌和细胞等均被脱色。当再用碱性美蓝复染后，分支杆菌仍为红色，其他细菌与背景呈蓝色。 操作步骤： 1、做一适当厚度的涂片，干燥后火焰固定。 2、滴加抗酸染色液A于玻片上，覆盖住样本，在酒精灯上加热，切勿沸腾，出现蒸汽 即暂时移开，必要时可续加染色剂以免干涸。加热3-5分钟。 3、移开火，静置5分钟，待标本冷却后以自来水冲洗。 4、用抗酸染色液B脱色（大约1分钟）至无红色染液脱出为止。完全脱色可避免产生 假阳性结果。
5、自来水缓慢冲洗后，滴加抗酸染色液C复染约30秒，水洗。 6、待干后油镜观察。 预期结果： 抗酸菌被染成红色，为抗酸阳性；其它细菌染成蓝色，为抗酸阴性。背景细胞及杂质也被染成蓝色。 注意事项： 1.染色程度可通过改变染色时间或染色温度做适当调整。 2.每次试剂用完后，请迅速盖好，以免挥发。 3.石炭酸对皮肤、粘膜有强列刺激性和腐蚀性，使用时请穿实验服并戴一次性手套操 作。
12、抗酸染色
1 方法:改良碱性复红法。 2 原理：结核菌、麻疯杆菌、耻垢菌等抗酸性菌，因其菌体表面有一层脂或脂质之皮膜不易着色，但一经着色后酸或乙醇的作用亦是不容易把它脱色。利用这特性并以增强的染色液予染色，然后再以酸及乙醇加以处理，使其脱色后再对比染色，此时抗酸性菌仍是固定着最初色素的颜色（红色）。 3 试剂 3.1 妻纳石炭酸复红溶液 碱性复红乙醇饱和溶液 10ml 5% 石炭酸溶液 90ml 3.2 脱色剂 浓盐酸 3ml 95% 乙醇 97ml 3.3 复染液 ( 吕弗勒美蓝液 ) 美蓝乙醇饱和溶液 30ml 10% 氢氧化钾 0.1ml 蒸馏水 100ml 4 试剂贮存：棕色瓶室温存放。 5 质量控制：每批配制后测试，结核分枝杆菌应为阳性。 6 操作步骤 6.1 涂片经火焰固定 , 加石炭酸复红溶液 , 盖满整个痰膜，徐徐加热至有蒸汽出现 , 切不可沸腾。染 5min( 若染色奴卡菌需要加长时间 ),用清洁水从玻片一端轻缓冲洗, 冲去染色液 , 沥去剩余的水。 6.2 加脱色剂 , 不时摇动玻片至无红色脱落为止 , 用清洁水从玻片一端轻缓冲洗, 冲去染色液 , 沥去剩余的水。
6.3 加复染液 , 染 0.5~lmin, 用清洁水从玻片一端轻缓冲洗, 冲去染色液 , 沥去剩余的水。 6.4 干后镜检。分枝杆菌呈红色 , 背景为蓝色。 7 结果判断 找到细菌或略带弯曲的杆菌，单个或平行相聚排列，有的呈分枝状，有的菌体内常有2-5个着色较浓的颗粒，抗酸染色染成红色，即可判断找到抗酸杆菌。 8 报告方法 8.1 抗酸杆菌阴性:连续观察 300 个不同视野 , 未发现抗酸杆菌 ; 8.2 抗酸杆菌可疑:1 一8条抗酸杆菌 /300 个视野 ; 8.3 抗酸杆菌阳性（1+）:3-9 条抗酸杆菌 /100 个视野 ; 8.4 抗酸杆菌阳性(2+):1-9 条抗酸杆菌 /10 个视野 ; 8.5 抗酸杆菌阳性（3+）:1-9 条抗酸杆菌 / 每个视野 ; 8.6 抗酸杆菌阳性 (4+):>=10 条抗酸杆菌 / 每个视野。 9 临床意义 用以鉴别细菌：奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，结核杆菌及其它分枝杆菌呈阳性。 10 注意事项 10.1痰液，应留取晨痰，要深痰来自肺部的痰。 10.2脑脊液、尿液、胸水、腹水等应离心取沉渣涂片。 10.3玻片必须无划痕。 10.4镜检至少300个视野，不得少于5分钟。 10.5脱色时间需根据涂片薄厚而定，厚涂片可适当延长，以几乎无红色为度。 11 参考文献 [1]中华人民共和国卫生部医政司编.全国临床检验操作规程第2版南京：东南大学出版社，1997. [2]李仲兴、郑家齐、李家宏主编.诊断细菌学.香港:黄河文化出版社,1992.