多花蔷薇胚性细胞悬浮系原生质体分离及再生植株

植物原生质体的分离及融合

植物原生质体的分离及融合 生93沈睿2009012372同组：古梦婷 实验日期：2011年11月2日 一．实验原理 1.原生质体分离 原生质体指包被在植物细胞壁内的生活物质。细胞壁的主要成分是纤维素和果胶质，它们分别经纤维素酶和果胶酶处理即可分解，从而脱去细胞壁，得到原生质体。 2.原生质体融和 诱导原生质体融合的方法有多种，譬如物理法（电场刺激，激光，显微操作等）、化学法（聚乙二醇结合高钙高pH法）和生物法（仙台病毒法等）。本实验用PEG诱导原生质体融和。 PEG是聚乙二醇的英文缩写，相对分子质量在200-6000之间的均可用作细胞融合剂，20-50%的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连。PEG诱导融合的机理可能是由于其含有醚键而具负极性，与水、蛋白质、碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为相邻原生质体表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。高钙、高pH洗液清洗则增加了质膜的流动性，因而大大提高了融合频率，洗涤时的渗透冲击对融合也可能起作用。普遍认为PEG分子能改变各类细胞细胞膜的结构，由于两细胞相接处质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，两细胞接触点处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组。 PEG法诱导的优点是取材方便、操作简易、效率高且效果稳定，缺点是对细胞有毒性。二．实验步骤 1.原生质体的制备 （1）将新鲜的剑兰（唐菖蒲）花瓣洗干净，用吸水纸吸干表面水分；将小平皿洗净，用蒸馏水冲洗后晾干或擦干。 （2）向小平皿中加入适量酶液，用尖头镊剥取剑兰花瓣的上、下表皮，27o C恒温振荡1h 左右。 （3）镜检细胞的酶解情况，若酶解效果不佳，可延长酶解时间，并用吸管吹吸。 （4）将酶解好的原生质体混合液经300目尼龙网过滤到10ml离心管，去除未被酶解的大块组织，用洗涤液冲洗平皿若干次，收集冲洗的液体。 （5）配平后，在700rpm下离心5min，弃去上清液；加洗涤液约3ml，吹打均匀，700rpm、5min重复离心一次，彻底去除酶液。 （6）加200μl洗涤液，悬浮原生质体。 （7）镜检原生质形态和浓度，看看是否有碎片；如碎片较多，利用蔗糖溶液漂浮1-2次。（8）蔗糖漂浮方法： 取部分原生质体悬浮液，加入洗涤液定容至1ml。用注射器吸取20%蔗糖溶液，装上长针头后小心插入盛有原生质体悬浊液的离心管底部，缓缓、轻柔地将蔗糖溶液挤出。由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。配平后在700rpm下离心5min。用装有长针头的注射器小心吹吸底部沉淀，连同底部碎片一起将底层蔗糖溶液吸出，再小心除去上清液，得到纯净完整的原生质体。 2.PEG融和

微生物原生质体制备及再生的影响因素

文章篇号:1007-2764(2006)03-0263-093 微生物原生质体制备及再生的影响因素 谭文辉，李燕萍，许杨 （南昌大学中德联合研究院 食品科学教育部重点实验室，江西南昌 330047） 摘要：原生质体的制备及再生，是原生质体技术的前提和基础。本文较全面地介绍了影响微生物原生质体制备及再生的因素，以期在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体，为进一步实验打下良好的基础。 关键词：原生质体；制备；再生 Factors Affect the Formation and Regeneration of Protoplasts of Microorganism Tan Wen-hui, Li Y an-ping, Xu Y ang (The Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education (Nanchang University); Sino-Germany Joint Research Institute, Nanchang 330047, China) Abstract: Formation and regeneration of protoplasts is the precondition and foundation of protoplasts technology. The factors that affect the formation and regeneration of protoplasts from microorganism were investigated to find the optimum condition of formation and regeneration of protoplasts. It is important to make the good foundation for further research. Keywords: Protoplasts; Formation; Regeneration 原生质是有组织的生活物质，是细胞生命活动的物质基础，所有的原生质有相似的基本组成成分和特性。原生质体是由原生质特化而来，细胞内由原生质组成的各种结构，统称为原生质体，它们彼此联系、相互影响而构成一个有机整体，担负着细胞的所有生命活动[1]。 原生质体技术的关键是对细胞壁进行消化，以形成大量的原生质体，并使原生质体能高频率的再生细胞壁，回复到正常细胞状态。当细胞壁去除后，原生质体具有以下特征：一是无细胞壁障碍，可对膜和细胞器进行基础研究，同时可进行遗传操作；二是具有全能性，能在人工条件控制下，进行大量快速繁殖；三是可诱导融合，形成杂种细胞，为体细胞杂交提供实验材料[2]。因此，原生质体技术无论在理论上或实践上都日益受到重视。 1 原生质体的制备 收稿日期：2006-03-29 作者简介：在读硕士，研究方向为食品生物技术 国家自然科学基金资助（30460006）项目，江西省自然科学基金资助（0530081）项目 通讯作者：许杨，教授、博导 人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质体，效果都不理想。目前，制备原生质体大都是利用酶解法脱去细胞壁。但由于各种微生物细胞壁组成的差异，制备原生质体的条件也各不相同。 1.1 菌龄对原生质体形成的影响 菌体的不同生理状态，直接影响到细胞壁的结构、菌体的代谢水平及菌体的活力等。酵母菌原生质体制备一般取对数生长期的单倍体细胞，此时细胞代谢活跃，生长率高，群体细胞的化学组成、形态及生理特征比较一致[3]。孙传宝等报道，对数生长期以前的菌丝体细胞壁结构对降解酶不敏感，酶解过程中更多的是将细胞壁最外层葡聚糖部分降解，造成菌丝体断裂，内含物溢出。到了对数生长后期，菌丝体原生质体释放量较高，但菌丝体体内有大量液泡产生，且原生质膜内皱较多，故释放的原生质体体积较大[4]。 1.2 培养基成分对原生质体分离的影响 培养基成分不同可导致新合成细胞壁结构的差异，这种差异又导致了细胞壁对酶敏感度反应不一，从而使菌丝细胞释放的原生质体量有差异[5]。据报道，在链霉菌（Streptomyces rimosus）的培养基中加入氨基乙酸，可有效促进菌丝体细胞壁形成对裂解酶敏感 263

第一章 植物细胞的结构与功能 知识要点

第一章植物细胞的结构和功能知识要点 一、教学大纲基本要求 了解高等植物细胞的特点与主要结构；了解植物细胞原生质的主要特性；熟悉植物细胞壁的组成、结构和功能以及胞间丝的结构和功能；了解生物膜的化学组成、结构和主要功能；了解植物细胞主要的细胞器如细胞核、叶绿体和线粒体、细胞骨架、内质网、高尔基体、液泡以及微体、圆球体、核糖体等的结构和功能；熟悉植物细胞周期与细胞的阶段性和全能性，了解植物细胞的基因组和基因表达的特点。 二、本章知识要点 （一）名词解释 1．原核细胞(prokaryotic-cell) 无典型细胞核的细胞，其核质外面无核膜，细胞质中缺少复杂的内膜系统和细胞器。由原核细胞构成的生物称原核生物（prokaryote）。细菌、蓝藻等低等生物属原核生物。 2．真核细胞(eukaryotic-cell) 具有真正细胞核的细胞，其核质被两层核膜包裹，细胞内有结构与功能不同的细胞器，多种细胞器之间有内膜系统联络。由真核细胞构成的生物称为真核生物（eukayote）。高等动物与植物属真核生物。 3．原生质体(protoplast) 除细胞壁以外的细胞部分。包括细胞核、细胞器、细胞质基质以及其外围的细胞质膜。原生质体失去了细胞的固有形态，通常呈球状。 4．细胞壁(cell-wall) 细胞外围的一层壁，是植物细胞所特有的，具有一定弹性和硬度，界定细胞的形状和大小。典型的细胞壁由胞间层、初生壁以及次生壁组成。 5．生物膜(biomembrane) 即构成细胞的所有膜的总称，它由脂类和蛋白质等组成，具有特定的结构和生理功能。按其所处的位置可分为质膜和内膜。 6．共质体(symplast) 由胞间连丝把原生质（不含液泡）连成一体的体系，包含质膜。 7．质外体(apoplast) 由细胞壁及细胞间隙等空间（包含导管与管胞）组成的体系。 8．内膜系统(endomembrane-system) 是那些处在细胞质中，在结构上连续、功能上关联的，由膜组成的细胞器总称。主要指核膜、内质网、高尔基体以及高尔基体小泡和液泡等。 9．细胞骨架(cytoskeleton) 指真核细胞中的蛋白质纤维网架体系，包括微管、微丝和中间纤维等，它们都由蛋白质组成，没有膜的结构，互相联结成立体的网络，也称为细胞内的微梁系统(microtrabecular system)。 10．细胞器(cell-organelle) 细胞质中具有一定形态结构和特定生理功能的细微结构。依被膜的多少可把细胞器分为：双层膜细胞器如细胞核、线粒体、质体等；单层膜细胞器如内质网、液泡、高尔基体、蛋白体等；无膜细胞器如核糖体、微管、微丝等。 11．质体(plastid) 植物细胞所特有的细胞器，具有双层被膜，由前质体分化发育而成，包括淀粉体、叶绿体和杂色体等。 12．线粒体(mitochondria) 真核细胞的一种半自主的细胞器。呈球状、棒状或细丝状等，由双层膜组成的囊状结构；其内膜向腔内突起形成许多嵴，主要功能进行三羧循环和氧化磷酸化作用，将有机物中贮存的能量逐步释放出来，供应细胞各项生命活动的需要，故有“细胞动力站”之称。线粒体能自行分裂，并含有DNA、RNA和核糖体，能进行遗传信息的复制、转录与翻译，但由于遗传信息量不足，大部分蛋白质仍需由细胞核遗传系统提供，故其只具半自主性。 13．微管(microtubule) 存在于动植物细胞质内的由微管蛋白组成的中空的管状结构。其主要功能除起细胞的支架作用和参与细胞器与细胞运动外，还与细胞壁、纺缍丝、中心粒的形成有关。 14．微丝(microfilament) 由丝状收缩蛋白所组成的纤维状结构，类似于肌肉中的肌动蛋

植物原生质体的分离与融合

实验六植物原生质体的分离与融合 一、实验目的： 1、掌握原生质体分离的方法； 2、了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。 二、实验原理： PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。 该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。 三、实验材料： （1）韭菜或大蒜叶； （2）红辣椒 四、实验步骤： Ι 植物原生质体的分离与纯化 1、酶解：将撕去表皮的植物叶片和果肉置于酶液（PH 5.4_5.8, 去表皮面接触酶液），在适宜温度条件下，避光酶解数小时。 2、过滤：用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。 3、原生质体收集：在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清 液。红辣椒800转/分离心5分钟。 4、洗涤：弃上清液，留沉淀约1ml，加入4ml13%CPW洗

液，相同条件下再离心，弃上清液。 弃上清液，留沉淀约1ml，混匀呈悬浮备用。 5、纯化： **蔗糖漂浮法去除碎片法： （1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约3ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面。或者（1*）换一洁净离心管加入20%蔗糖溶液约3ml，然后小心将原生质体悬液平铺于离心管表面。（以上任一方法皆能看到明显界面） (2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处 (3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中。注意下步镜检决定是否需要:加入3～4ml13%CPW洗液离心，离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。 Ⅱ细胞融合 1．不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min； 2．融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太

植物细胞的功能和结构

（一）填空 1．指出图中植物细胞各部分的名称：⑴，⑵，⑶，⑷，⑸，⑹， ⑺ ，⑻。（质体或叶绿体，线粒体，核模，质膜，细胞壁，内质网，高尔基体，液泡膜） 2．植物细胞区别于动物细胞的三大结构特征是、和。（大液泡，叶绿体，细胞壁） 3．植物细胞的胞间连丝的主要生理功能有和两方面。（物质交换，信号传递） 4．原生质体包括、和。（细胞膜，细胞质，细胞核） 5．当原生质处于状态时，细胞代谢活跃，但抗逆性弱；当原生质呈状态时，细胞生理活性低，但抗性强。（溶胶，凝胶） 6．典型的植物细胞壁由、和组成。（胞间层，初生壁，次生壁） 7．纤维素是植物细胞壁的主要成分，它是由D-葡萄糖残基以键相连的无分支的长链。（β-1,4-糖苷） 8．生物膜的化学组成基本相同，都是以和为主要成分的。（蛋白质，脂类） 9．根据蛋白质在膜中的排列部位及其与膜脂的作用方式，膜蛋白可分为和。（外在蛋白，内在蛋白）10．生物膜的不对称性主要是由于和的不对称分布造成的。（脂类，蛋白质） 11．除细胞核外，有的细胞器如和中也含有DNA。（叶绿体，线粒体） 12．在细胞有丝分裂过程中，牵引染色体向细胞两极移动的纺缍体是由构成的。（微管） 13．植物细胞的骨架是细胞中的蛋白质纤维网架体系，包括、和等。（微管，微丝，中间纤维）14．一般在粗糙型内质网中主要合成，而光滑型内质网中主要合成。（蛋白质，糖蛋白的寡糖链和脂类）15．植物的内膜系统主要包括、、和液泡等。（核膜，内质网，高尔基体） 16．在细胞中高尔基体除参与细胞壁形成和生物大分子装配外，还参与和。（物质集运，物质分泌）17．植物衰老过程中，衰老细胞的大部分内含物被由释放的水解酶水解后，再运送到其他器官再利用。（溶酶体）18．植物细胞中存在着两种微体，即和，分别与和有关。（过氧化物体，乙醛酸体，光呼吸，脂类代谢） 19．圆球体一般在上形成，是贮藏的细胞器。（粗糙型内质网，油脂） 20．核糖体主要是由和组成的，它是细胞中合成的场所。（rRNA，蛋白质，蛋白质）

植物原生质体相关材料

植物原生质体相关材料 2013-9-2 From HZB 一、植物材料 研究表明，几乎从植物的所有部位都能得到原生质体，其中以叶片为多。根尖组织也是植物原生质体的重要来源，它可由各种植物的种子萌发后取得。花粉经特异酶处理也能得到原生质体，在单倍体遗传育种中有特殊的用途。 但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料。材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一。 1. 细胞悬浮培养物 在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织： 取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2,4－D 2-4mg/L的MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2-4d转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的100ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80-120r/min，在25±1℃下暗培养。通常经悬浮培养3～4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。 2. 叶肉细胞 叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料，用叶片的薄壁组织作为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂。要获得良好的培养材料，下列外界因素是需要着重考虑的： （1）光强为3000-6000lx。 （2）温度为20-25℃培养。 （3）相对湿度在60％-80％左右。 植物的其他器官也可用于分离原生质体，如用花粉四分体和花粉壁细胞。 3. 植物材料的预处理 对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率；也可以逐步提高植物材料的渗透压，以适应培养基中的高渗环境。这些处理包括：暗处理、预培养、低温处理等。 例如，把豌豆的枝条取下后，在分离原生质体前，先让材料在黑暗中的一定湿度条件下放1～2d，这样得到的原生质体存活率高，并能继续分裂。在羽衣甘蓝叶肉组织原生质体分离和培养中，先去掉叶片的下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基中预培养7d，然后再去壁；经预培养的叶片分离的原生质体高度液泡化，叶绿体也解体。龙胆试管苗的叶片只有用4CC低温处理后分离得到的原生质体才能分裂。但在很多情况下材料不必经过专门的预处理。 二、酶 1. 酶的种类 构成植物细胞壁的三个主要成分是：①纤维素，占细胞壁干重的25％至50％不等；②半纤维素，平均约占细胞壁干重的53％左右；③果胶质，一般占细胞壁的5％。分离原生质体最常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶。 ZA3-867纤维酶是上海植物生理研究所从野生型绿色木霉同各菌种中提取制成的，粗制品是多种酶的复合物，含有纤维素酶（包括C1、CX、B一葡萄糖苷酶等）、果胶质、半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。这种复合酶使用时不需加半纤维素酶和果胶酶等，就可以分离出植物原生质体。 日本产的Onozuka纤维素酶常和果胶酶结合使用，可先用果胶酶降解果胶，使分开细胞，再用纤维素酶处理降解细胞壁。即二步法降解。 2. 渗透稳定剂

(完整版)植物细胞和组织(最新整理)

第一章植物细胞和组织 第一节植物细胞 一、概述 1.概念 世界上的植物种类繁多,千差万别，但就其结构来说，所有的植物体都是由细胞构成的。细胞不仅是植物结构单位,也是功能单位。 细胞并不是生命有机体（包括植物）唯一的结构单位，如病毒。 2.发现 一般细胞都很小,要用显微镜才能看到。1665年,英国人Hooke用他改进的显微镜观察软 木的结构,发现并命名了细胞。 二、原生质的化学组成 构成细胞的生活物质为原生质，它是细胞活动的物质基础。原生质有着相似的基本成分。 1.水和无机物 原生质含有大量的水，一般占全重的60-90%。 幼嫩植株含水60-90%。 种子（成熟的）含水10-14%。 水的作用：游离水作为溶剂而参加代谢过程；作为原生质结构的一部分；影响代谢活动；调 节原生质温度变化，维持原生质正常的生命活动。 除水之外，原生质中还含有无机盐及许多呈离子状态的元素，如铁、锌、锰、镁、钾、钠、氯等。 2.有机化合物 组成原生质的物质有： 蛋白质 核酸 脂类 糖类 ① 蛋白质 蛋白质分子由20多种氨基酸组成。由于氨基酸的数量、种类、排列顺序不同，形成各种 蛋白质。 蛋白质可以作为原生质的结构蛋白，而且还以酶的形式起重要作用。例如，使物质分解 的淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等。 ② 核酸 生活的原生质都含有核酸，核酸都和蛋白质结合形成核蛋白。核酸由核苷酸构成。 单个的核苷酸由一个含氮碱基、一个五碳糖和一个磷酸分子组成。 核酸根据含糖不同，可分为含有核糖的核糖核酸（RNA）和含有脱氧核糖的脱氧核糖核 酸（DNA）。 DNA的双螺旋结构。 ③ 脂类 凡是经水解后产生脂肪酸的物质属于脂类。 在植物体内，有的作为结构物质，例如磷脂和蛋白质结合，构成细胞的各种膜。有些脂类 形成角质，木栓质和蜡，参与细胞构成。 细胞表面的蜡、木栓层。

植物细胞的结构和功能

《植物细胞的结构和功能》教案 一、教学目标 知识目标 1、进一步尝试制作临时裝片，并使用显微镜观察自己制作的临时裝片。 2、掌握植物细胞的基本结构，并明确植物细胞的各部分结构的功能。 能力目标 1、学会制作临时装片和学会使用显微镜的方法，培养学生实验技能。 2、本节课把实验观察安排在前，使学生通过自己的观察眼见为实地掌握细胞的结构知识，满足了学生揭秘的欲望，培养了学生学习生物学的兴趣，并初步形成科学实验的能力。 情感态度与价值观目标 学生体会心细大胆是顺利进行实验的必备素质，养成实事求是的科学态度。 二、教学重难点 重点： 1、尝试说出细胞的基本结构及主要作用。尝试制作洋葱鳞片叶临时玻片标本。 2、使用显微镜观察洋葱鳞片叶临时玻片表皮细胞的结构。 3、绘制植物细胞简图。 难点：

1、植物细胞的基本结构功能。 2、制作精美的临时玻片标本。 3、培养学生实验必备的科学素质，及科学态度。 三、教学过程 （一）导入新课 以科学家对“细胞”发现的过程引入课题，并提出让学生象科学家一样自己动手制作临时裝片，观察植物细胞的结构，激发学生的学习兴趣。 活动一、观察洋葱表皮细胞的结构 1、回忆临时裝片制作的过程和显微镜的规范使用方法。 2、小组合作制作洋葱临时裝片，并观察其结构。 3、绘图介绍绘图的方法并标注出各结构（细胞壁、细胞 膜、细胞质、细胞核） 小结： 形象类比说出鸡蛋的各结构相当于植物细胞的哪部分。 品尝水果引出水果的汁液来自于植物细胞的液泡 活动二、建构细胞模型用所给的材料制作植物的细胞模型活动三、自主学习37页 1、说出植物细胞的各结构功能 2、生活联系实际：根据一些图片介绍，讨论这些现象分别与植物细胞的哪个结构有关？其各自作用是什么？各种生命活动的场所在哪里？

第一章植物细胞的结构和功能

三植物生理学 第一章植物细胞的结构和功能 1．真核细胞的主要特征是。 A．细胞变大 B．细胞质浓C．基因组大D．细胞区域化 2．一个典型的植物成熟细胞包括。 A．细胞膜、细胞质和细胞核B．细胞质、细胞壁和细胞核 C．细胞壁、原生质体和液泡 D．细胞壁、原生质体和细胞膜 3．中胶层是由果胶多聚物组成的，其中包括。 A．果胶酸、果胶和原果胶 B．果胶酸的钙盐和镁盐 C．多聚半乳糖醛酸 D．阿拉伯聚糖 4．原生质胶体的分散相是生物大分子，主要成分是。 A．脂类 B．蛋白质 C．淀粉 D．纤维素 5．去掉细胞壁的植物原生质体一般呈球形，这是原生质的造成的。 A．弹性 B．粘性 C．力 D．流动性 6．原生质的粘性与植物的抗逆性有关，当原生质的粘性增加时，细胞代活动，抗逆性就。 A．强，强 B．弱，弱 C．弱，强 D．弱，弱 7．伸展蛋白是细胞壁中的一种富含的糖蛋白。 A．亮氨酸 B．组氨酸 C．羟脯氨酸 D．精氨酸 8．一般说来，生物膜功能越复杂，膜中的种类也相应增多。 A．蛋白质 B．脂类 C．糖类 D．核酸 9．下列哪一种代活动与生物膜无关：。 A．离子吸收 B．电子传递 C．DNA复制 D．信息传递 10．植物细胞的产能细胞器除线粒体外，还有。 A．叶绿体 B．核糖体C．乙醛酸体 D．过氧化物体 11．下列哪一种不属于质体：。 A．淀粉体 B．叶绿体 C.杂色体 D．圆球体 12．花瓣、果实等呈现各种不同的颜色，因为其细胞中含有。 A．叶绿体 B．杂色体 C．线粒体 D．圆球体 13．在线粒体膜表面有许多小而带柄的颗粒，它们是。 A．核糖体 B．H+-ATP酶 C．微体 D．小囊泡 14．不同的植物细胞有不同的形状，这主要是由于细胞质中的定向排列，而影响细胞壁微纤丝的排列。A．微丝 B．质网 C．微管 D．高尔基体 15．微体有两种，即：。 A．叶绿体和质体 B．过氧化物体和乙醛酸体 C．线粒体和叶绿体 D．圆球体和溶酶体 16．植物细胞原生质的流动一般是由驱动的。 A．微丝 B．微管 C．肌动蛋白 D．韧皮蛋白 17．微管主要是由和两种亚基组成的异二聚体。 A．α-微管蛋白，β-微管蛋白 B．微管蛋白，原纤丝 C．收缩蛋白，肌动蛋白 D．微管，微丝 18．植物细胞的区隔化主要靠来完成。 A．高尔基体 B．液泡 C．细胞膜 D．质网 19．被称为细胞的自杀性武器的是。 A．微体 B．溶酶体 C．质网 D．高尔基体 20．下列哪个过程不属于细胞程序性死亡：。 A．导管形成 B．花粉败育 C．冻死 D．形成病斑 答案：DCABC、CCACA、DBBCB、AADBC 第二章植物的水分生理 1．一个成熟的植物细胞，它的原生质层主要包括：。 A．细胞膜、核膜和这两层膜之间的细胞质 B．细胞膜、液泡膜和这两层膜之间的细胞质 C．细胞膜和液泡膜之间的细胞质 D．细胞壁和液泡膜和它们之间的细胞质 2．在同一枝条上，上部叶片的水势要比下部叶片的水势。 A．高B．低C．差不多D．无一定变化规律 3．植物水分亏缺时。 A．叶片含水量降低，水势降低，气孔阻力增高 B．叶片含水量降低，水势升高 C．叶片含水量降低，水势升高，气孔阻力增高D．气孔阻力不变 4．当植物细胞溶质势与压力势绝对值相等时，这时细胞在纯水中：。 A．吸水加快 B．吸水减慢C．不再吸水 D．开始失水 5．将一个细胞放入与其胞液浓度相等的糖溶液中，则：。 A．细胞失水B．既不吸水，也不失水

植物细胞结构和原生质

一、植物细胞结构和原生质组成，植物组织和器官的结构特征及生理功能 植物细胞是植物生命活动的结构与功能的基本单位，由原生质体和细胞壁两部分组成。原生质体是细胞壁内一切物质的总称，主要由细胞质和细胞核组成，在细胞质或细胞核中还有若干不同的细胞器，此外还有细胞液和后含物等。植物细胞一般很小，高等植物中，其直径通常为10-100μm。植物细胞的形态多种多样，常见的有圆形、椭圆形、多面体、圆柱状和纺锤状。它们的基本结构是由原生质体和细胞壁组成。 (一) 分生组织位于植物的生长部位，具有持续或周期性分裂能力的细胞群，称为分生组织。分生组织的细胞排列紧密，细胞壁薄，细胞核相对较大，细胞质浓，细胞器丰富。根据分生组织在植物体内的位置不同，可将分生组织分为顶端分生组织、侧分生组织和居间分生组织三类；此外，也可根据来源将分生组织分为原分生组织、初生分生组织和次生分生组织三类。原分生组织位于根尖和茎尖的顶端，由一群胚性的原始细胞组成，能长期地保持分裂能力。初生分生组织由原分生组织的细胞分裂而来，一方面初生分生组织的细胞可继续分裂，另一方面开始初步分化，逐渐向成熟组织过渡。初生分生组织有原表皮、基本分生组织和原形成层三种。次生分生组织也就是侧分生组织，由已分化成熟的薄壁组织细胞恢复分裂能力转变而来，有维管形成层和木栓形成层两类。细胞的特点：外形细小，近于等径，细胞排列紧密、无胞间隙、细胞核大、薄壁、液泡细小、多、细胞质浓厚、生活力强。1顶端分生组织顶端分生组织存在于根尖和茎尖的分生区部位，由短轴或近于等径的胚性细胞构成，细胞排列紧密，能较长时期地保持旺盛的分裂能力。2侧分生组织侧分生组织包括维管形成层和木栓形成层，它分布于植物体的周围，平行排列于所在器官的边缘。侧分生组织细胞的形状为长轴形和等径状，其功能是使植物体变粗。3居间分生组织居间分生组织分布于成熟组织之间，进行一段时间的分裂活动后失去分裂能力，完全分化为成熟组织。例如，水稻、小麦的节间基部都有居间分生组织存在。(二) 成熟组织分生组织分裂产生的细胞，经生长、分化后，逐渐丧失分裂能力，形成各种具有特定形态结构和生理功能的组织，这些组织称为成熟组织。根据生理功能的不同，成熟组织可再分为数种。1保护组织：保护组织覆盖于植物体的外表，由一至几层细胞组成，主要有防止水分过分蒸发，抵抗病虫害的侵袭等作用。植物体内的保护组织有初生保护组织—表皮和次生保护组织—周皮两种。（1）表皮：表皮由原表皮分化而来，通常是一层细胞组成的，但也有少数植物有几层细胞构成的复表皮。表皮除表皮细胞外，在幼茎和叶上还有气孔器、表皮毛或腺毛等结构。表皮细胞行状扁平，排列紧密，无细胞间隙，细胞的外壁增厚，形成角质膜。气孔器由2个保卫细胞围成，禾本科植物的保卫细胞旁侧还有一对副卫细胞。表皮毛有多种类型，它们能增强表皮的保护作用；腺毛则有分泌作用。（2）周皮：周皮是次生分生组织形成的，它由木栓层、木栓形成层和栓内层组成。木栓层细胞之间无细胞间隙，细胞壁较厚且高度栓化，形成不透水、绝

植物原生质体的分离与融合(3)

细胞工程 实验六植物原生质体的分离与融合 实验概要 本实验介绍了原生质体分离的方法及利用PEG原生质体融合的原理和方法。 实验原理 植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁，即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。许多化学、物理学和生物学方法可诱导原生质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高钙高pH法和电融合法；聚乙二醇（PEG）作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高钙高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。聚乙二醇（PEG）诱导如何的机理：聚乙二醇（PEG）由于含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化基团能形成氢键，当聚乙二醇（PEG）分子足够长时，可作为临近原生质表面之间的分子桥而使之粘连、聚乙二醇（PEG）也能连接钙等阳离子，钙可在一些负极化基团和聚乙二醇（PEG）之间形成桥，因而促进粘连。从而引起原生质体融合：高钙高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率，洗涤时渗透压冲击也可能起作用。原生质体分离纯化后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法时原生质体培养中最基础也是最关键的环节。PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。该方法的优点是：用法简单，容易获得融合体，融合效果好。 主要试剂 1. 20%蔗糖； 2. 13%CPW洗液： 27.2mg/L 磷酸二氢钾（KH2PO4）

1.1植物细胞的结构和功能

第一节植物细胞的结构和功能 一、植物细胞的概念 自然界的生物有机体，除了病毒和类病毒外，都是由细胞构成的。细胞是植物体结构和执行功能的基本单位。 1665年英国科学家胡克发现细胞（Cell）。德国人施莱登和施旺共同创立了细胞学说。 细胞可分为两大类型：原核细胞和真核细胞。原核细胞有细胞结构，但没有典型的细胞核；真核细胞具有被膜包围的细胞核和多种细胞器。 二、植物细胞的形状和大小 （一）植物细胞的形状 植物细胞的形状是多种多样的，有球形或近球形、长筒状、长纺锤形、长柱形、星形等不规则形状。细胞形状的多样性，反映了细胞形态与其功能相适应的规律。 （二）植物细胞的大小 植物细胞的大小差异悬殊。最小的支原体细胞直径为0.1μm；绝大多数的细胞体积都很小。 三、细胞生命活动的物质基础 构成细胞的生活物质称为原生质，它是细胞结构和生命活动的物质基础。 组成原生质的化学元素主要是碳、氢、氧、氮等4种，约占全重的90%；其次有少量硫、磷、钠、钙、钾、氯、镁、铁等，约占全重的9%；此外还有极微量的元素，如钡、硅、矾、锰、钴、铜、锌、钼等。 组成原生质的化合物可分为无机物和有机物两类。无机物主要是水，此外还有CO2和O2等气体、无机盐以及许多离子态的元素等。有机物主要有蛋白质、核酸、脂类、糖类和极微量的生理活性物质等。 四、植物细胞的基本构造 植物细胞包括细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核等部分，其中细胞膜、细胞质和细胞核总称为原生质体。 （一）细胞壁 1．细胞壁的结构细胞壁是植物细胞所特有的结构。细胞壁结构大体分为三层：胞间层、初生壁和次生壁。 2．细胞壁的变化次生壁常因有其他物质填入，使细胞壁的性质发生角质化、木栓化、木质化、矿质化，以适应一定的生理机能。 3．细胞壁特殊结构纹孔和胞间连丝。由于纹孔和胞间连丝的存在，细胞之

植物原生质体培养方法

植物原生质体培养方法 1 植物原生质体培养的简史 植物细胞原生质体, 在植物学上指植物细胞通过质壁分离后, 可以和细胞壁分开的那部分细胞物质。原生质体分离纯化后, 须在适当的培养基上应用适当的培养方法, 才能再生细胞壁, 并启动细胞持续分裂, 直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗, 最终再生完整植株。其中, 选择合适的培养方法始终是原生质体培养中最基础也是最关键的一环。 植物原生质体培养方法起源于植物单细胞培养方法。早在1902 年,Haberlant 通过实验就预言: 体外培养单个细胞可通过其分裂得到培养组织。直到1954 年, 植物单细胞培养才获得成功。M uir 将培养的万寿菊及烟草悬浮细胞植入到长有愈伤组织的培养基上而得到了它们的单细胞克隆, 并建立了看护培养的方法。悬滴培养由De Ropp1954 年开创, 1960 年Jones 等完善了这一技术, 并建立了微室培养的方法。同年, Cock ing 应用酶法分离原生质获得了成功, 从而在实验条件下很容易获得大量的原生质体。随着多种适用于原生质体分离的商品酶的出现, 原生质体的培养方法也得到了不断的改进, 现在常用的液体浅层培养、双层培养法、琼脂糖包埋法、琼脂岛培养法以及使用条件培养基或饲喂培养等技术, 使原生质体培养获得了极大的成功。 2 原生质体培养方法 2. 1 液体培养法 2. 1. 1 液体浅层培养(L iquid th in culture) 这是目前较常用的原生质体培养方法, 一般适用于容易分裂的原生质体, 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层, 封口进行培养。这种方法操作简单, 对原生质体损伤较小, 且易于添加新鲜培养物。用这种方法, J.T rmeouillaax 等成功地培养长春花冠瘿组织的激素自养型的原生质体单细胞克隆; H isato Kunitake 等也在改良的M S 培养基上培育了Eustom a g rend if lorum (龙胆科, 原产美国) 原生质体再生植株。但这种方法也常使原生质体分布不均匀, 发育的原生质体之间产生粘连而影响其进一步的生长和发育, 尤其是难以定点观察单个原生质体的命运。王吉吉之等认为液体浅层培养在培养过程中, 应经常轻轻晃动培养基, 以增强通气, 促进愈伤组织形成。 2. 1. 2 微滴培养(D rop let culture) 微滴培养是由液体浅层培养发展起来的一种方法, 它克服了后者局部密度过高和原生质体粘聚的缺点。此方法是将0. 1m l 或更少的原生质体悬浮液用滴管滴于培养皿底部, 封口后进行培养。为避免微滴蒸发, 可将培养器皿置于湿润的环境中, 或在微滴上覆盖矿物油。此法适用于融合体及单个原生质体培养, 尤其适用于较多组合的实验。为了比较黄瓜两个品系在不同的植板密度以及在不同的激素水平下原生质体生长情况, Z. K. Punja 等选用了此方法获得很好的效果; 同样, S. V essabutr 等培养百脉根时也比较了不同预处理、不同酶液组合对原生质体培养的影响。 2. 2 固体培养—— 琼脂糖平板法(A grose beadmethed) 固体培养作为凝固剂的物质可以是琼脂、琼脂糖或Gellan gum , 近来很多实验证明, 琼脂糖尤其是低熔点的琼脂糖是一种良好的培养基凝固剂, 并且具有促进原生质体细胞分裂的作用。琼脂糖平板法是将原生质体纯化后悬浮在液体培养基中, 然后与热融并冷却到45℃的琼脂糖按一定比例混合, 轻轻摇动使原生质体均匀分布, 凝固后封口培养。由于原生质体彼此分开并固定了位置, 就避免了细胞间有害代谢产物的影响, 既便于定点观察, 又有利于追踪原生质体再生细胞的发育过程。Z. K. Punja 等证明琼脂平板法比微滴培养及液体浅层培养具有更高的植板率; 甘霖等也得出同样结论。但此种方法对操作技术要求比较严格, 尤其是温度一定要适宜; 添加低渗透压的培养基和转移再生愈伤组织也比较繁琐, 而且培养的原生质体极易褐变死亡。 2. 3 液体2固体结合培养 2. 3. 1 双层培养法(A grose2liquid doublelayer) 这种方法即在培养皿的底部先铺一薄层含或不含原生质体或细胞的固体培养基,

原生质体细胞融合技术

食品生物技术课程论文原生质体细胞融合技术

原生质体细胞融合技术 摘要：细胞融合技术作为细胞工程的一项核心基础技术己在农业、医药、环保等领域得到了迅速发展和应用。综述了细胞融合技术中的常用方法:细胞融合仙台病毒诱导法、细胞融合PEG（聚乙二醇)诱导法、细胞融合电场诱导法、细胞融合激光诱导法;以及最新研究进展:基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片、空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术等，并对它们的优缺进行简要的评述。 关键词：原生质体细胞融合技术影响因素融合方法发展 正文： 原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交，是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程。利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞，这个新细胞得到了来自两个细胞的遗传物质，具有新的遗传或生物特性。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy 等采用离心力诱导的方法，报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合，从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术，并从微生物种内融合扩展到界间的融合。目前，通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。细胞融合核技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方而都有广泛的应用价值。特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。 1 原生质体融合技术 微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备，原生质体融合，原生质体再生。 1. 1 原生质体制备与再生过程中的影响因素 制备原生质体的最大障碍就是细胞壁，现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法，使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶，具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多，不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上，多采用对数生长中后期的细菌，这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肤聚糖含量最低，细胞壁对酶的作用最敏感。对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中，用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度比为5:3: 1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用

原生质体培养和再生渗透压稳定剂变化

原生质体培养和再生渗透压稳定剂变化 问题：原生质体的培养过程是怎么样的？为什么用甘露醇作渗透压 调节试剂？再生细胞壁后为什么要降低渗透压？ 原生质体的分离和纯化 原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力。 1.分离方法 （1）机械法分离：缺点：产量极低；应用的材料受限制；操作极费力；（2）酶法分离：C o c k i n g最早开展这方面研究，克服了机械法分

离的缺陷，可分为直接法和顺序法两种。酶法可在短时间内获得大量原生质体，缺点是：不纯的酶制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作用。 2.影响原生质体分离的因素（酶法） 从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质体。但是对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体则受许多因素的影响。 原生质体分离时主要应考虑取材、酶的种类、纯度、酶液的渗透压、酶解时间、温度等。 （1）外植体来源 生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物、原球茎、花瓣和叶表皮等。叶肉细胞是常用的材料，叶片很易获得而且能充分供应。取材时，一般用刚展开的幼嫩叶片。 另一个分离原生质体的常用材料是愈伤组织或悬浮细胞，采用其作材料可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒。选用悬浮细胞作材料时，需每隔3-5天继代一次，培养一段时间使细胞处于旺盛生长状态。一般在继代后的第三天游离原生质体。 （2）酶液组成和浓度

原生质体制备和再生的影响因素

原生质体制备和再生的影响因素 【摘要】以酿酒酵母YS5为出发菌株，经蜗牛酶酶解获得原生质体后，用紫外线进行诱变处理，通过一级筛选得到了61株诱变菌株，将这些诱变株直接进行发酵，利用气相色谱对发酵液酒精产量进行分析。结果表明，经过紫外线照射30s后，通过筛选获得了一株酒精发酵较高产菌株，酒精产率达到了10.36%（v/v），比出发菌株提高了3.6%。 【关键词】酿酒酵母；原生质体；紫外诱变；甘蔗汁发酵 酵母细胞的融合及酵母原生质体的诱变的一个重要前提就是如何制备大量的原生质体，原生质体制备率受到各种条件的影响，如菌龄、酶浓度、温度、预处理等的影响，因此确定不同因素对酵母原生质体的影响及优化不同因素，可以大大提高产率。 1.菌体菌龄对原生质体制备的影响 微生物的生理状态是决定原生质体产量的主要因素之一，特别是菌龄，明显影响原生质体释放的频率。不同时期的菌体，对各种溶壁酶的敏感性不同，原生质体的形成率与再生率也有很大差异。 较年轻的菌体细胞制备原生质体较为容易，而且此阶段的原生质体再生率也较高。处于对数生长期的菌体代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，生长适应能力强，故通常取处于对数生长期的菌体制备原生质体。有研究表明对数生长早期形成率最高，对数生长中期时再生率最高，对数生长晚期的再生率也比对数生长中期的低。这是由于细胞壁越稚嫩，越易被酶破坏，对数生长早期菌体幼小，代谢活性高而稳定、细胞壁对酶的作用较为敏感，且大小比较一致，故生活适应能力强；对数生长中期幼小菌体对不利因素抵抗能力差，一旦失去细胞壁，较难恢复；对数生长晚期的原生质体存在着很大比例的非活性个体。菌体如果进入稳定期，细胞壁结构趋于稳定和老化，不易去壁形成原生质体，原生质体形成率显著降低，而且再生率也有所下降。 微生物的菌龄是随着菌种和培养条件而异，酵母菌菌液中加入β-巯基乙醇可以破坏细胞壁组分中的二巯基，处于对数生长期的酵母菌菌体代谢极为旺盛，细胞壁易被瓦解，其细胞壁对蜗牛酶较为敏感，易于酶解脱壁，且酵母菌制备原生质体时，要使菌体同步化才能大幅度的提高制备率。 2.稳定剂对原生质体制备的影响 原生质体由于剥除了细胞壁，失去其特有的保护作用，细胞对外界环境变的十分敏感，尤其对渗透压。如果把它悬浮在蒸馏水或等渗溶液中，会吸水膨胀并破裂，所以必须在一定浓度的高渗溶液中进行酶解、破壁、才能形成和保持稳定的原生质体。