用photoshop和ImageJ对Western Blot图片灰度分析

用photoshop和ImageJ对Western Blot图片灰度分析
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用photoshop和ImageJ对Western Blot图片灰度分析

2010-09-2305:30

Comparing the intensity of bands on a Western blot can be done in a number of ways using software that is commonly found on lab computers or freely available for download.The following document outlines some of those methods.

For a long time,the de-facto standard for analysis in labs that didn't want to spring for multi-thousand$$commercial densitometry software was Adobe Photoshop or one of the competing photo editing programs.All you really need in a program is a freehand selection tool and a way to measure the mean gray value inside the selection.We'll start with Adobe Photoshop as an example(you can find many references in the literature that include phrases such as"densitometry was carried out in Photoshop"in the methods section).

To start with,you'll need to scan in your xray film on a flat-bed scanner.This can be a cheap consumer unit,or a more expensive transparency scanner if you have access to such a beast.You can scan the film as a grayscale image,and set the resolution to a medium value(300-400dpi). 1.Open the scanned image in Photoshop.

2.Under Image>Mode,check the grayscale option if it's not already selected.We don't care about color information,only grayscale information,so we can discard the color information.

3.Under Image>Adjustments,select Invert(or press Ctrl+I).Now the dark parts of the film are light,and the light parts are dark.This is useful later,as the high-expression bands,which are dark on the film,will have high numerical values when we measure them.When photo programs report darkness/lightness values,the dark points have values near zero,and the light points have values that max out at255.

原文地址:https://www.360docs.net/doc/4f10966898.html,/biotech/soft/2009/i819391924_1.html

ImageJ对WesternBlot进行灰度分析

Image J 对Western blot 条带进行灰度分析 Image J软件:Windows 版本 第一步:软件安装 1.下载地址:https://www.360docs.net/doc/4f10966898.html,/ij/download.html 2.下载windows 32位带Java版本,双击软件安装。 第二步:界面介绍 1.软件界面 第三步:图片分析 1.下图为样板图片 2.导入图片:File> Open> Sample1.jpg 图片导入后,Sample1.jpg在新的窗口中打开

3.图片类型设置:Image> Type> 8 bit 4.去除图片背景:Process> Subtract Background> …

4.1Subtract Background 窗口:Rolling ball radius 设为50 pixels, 勾选light background,可选preview,点击“OK”确定 5.工具栏:选择“矩形选框”

6.最大化“Sample1.jpg”窗口,便于矩形选择,矩形选择第一个泳道 7.标记“矩形选框”为1:矩形选择后,调整矩形至合适大小,按下数字键 “1”,或者Analyze> Gels> Select Fist Lane。 8.选择“泳道2”:拖动“1”的矩形框,会出现两个矩形选框,拖动矩形框 至泳道2,调整位置,并按下数字键“2”,Image J 会自动调整大小使“矩形框2”与“矩形框1”保持同一水平。 9.继续拖动,会出项新的“矩形选框”,调增至泳道3,并按下数字键“2” (注意:是按下数字键“2”),重复9至6个泳道全部选择。 10.所有泳道选择后,按下数字键“3”,出现分析图谱。

westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤 1.western blot 即蛋白免疫印迹( Western Blot) 是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 2.原理 简单来说就是原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息 3.步骤 (一)蛋白样品制备 培养的细胞(定性) 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍(冷的PBS有可能使细胞脱落)。 2.对于6孔板来说每孔加200~300uL,60~80℃的1×loading buffer。 3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min,期间vortex 2~3次。 4.用干净的针尖挑丝,将团块弃掉,如果没有团块但有拉丝现象,可将EP管置于0℃后在 5.14000~16000g离心2min,再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠,可使用1ml注射器反 6.复抽吸来降低溶液粘滞度,便于上样。 7.待样品恢复到室温后上样。 培养的细胞(定量) 1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍(冷的PBS有可能使细胞脱落)。

2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。 3.刮下的细胞收集在EP管后超声(100~200w)3s,2次。 4.12000g离心,4℃,2min。 5.取少量上清进行定量。 6.将所有蛋白样品调至等浓度,充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好,剩余溶液(溶于1×loading buffer)可以低温储存,-70℃一个月,-20℃一周,4℃1~2天,每次上样前98℃,3min。 (二)SDS-PAGE电泳 (1)清洗玻璃板 (2)灌胶与上样 (3)电泳 (三)转膜 (四)免疫反应 (五)化学发光,显影,定影 (六)凝胶图象分析将胶片进行扫描或拍照,用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

westernblot详细图解

Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以

检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml;10%SDS 6.0 ml;β-巯基乙醇0.2 ml;ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液:甘氨酸2.9 g;Tris 5.8 g;SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH2O定容至1000 ml。

Western Blot常见问题及处理总结

免疫细胞研究western blot Western Blot常见问题及处理总结 阿木 1、western blot 的优点 答:灵敏,可达ng级,用Ecl显色法理论上可达pg 级。方便,特异性高。 2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋 白? 答:原因有很多: a) 你的细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞;b) 你的细胞中的蛋白质被降解掉了,你必需加入PMSF,抑制蛋白酶活性;c) 你的抗体不能识别目标蛋白,多看看说明,看是否有问题。 3、我的细胞提取液有的有沉淀,有的很 清亮,为什么呢?

答:a) 有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS 浓度,同时将样品煮沸时间延长,b) 也不排除你的抗原浓度过高,这时再加入适量上样缓冲 液即可。 4、我做的蛋白质分子量很小(10KD), 请问怎么做WB? 答:可以选择0.2μml的膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。 其他按步骤即可。 5、我的目的带很弱,怎么加强? 答:可以加大抗原上样量。这是最主要的。 同时也可以将一抗稀释比例降低。 6、胶片背景很脏,有什么解决方法?答:减少抗原上样量,降低一抗浓度,改

变一抗孵育时间,提高牛奶浓度。 7、目标带是空白,周围有背景,是为什 么? 答:你的一抗浓度较高,二抗上HRP 催化活力太强,同时你的显色底物处于一个临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低,或更换新底物。 8、我的胶片是一片空白,是怎么回事? 答:如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 a) 二抗的HRP 活性太强,将底物消耗光;b) ECM底物中H2O2,不稳定,失活;c) ECL底物没覆盖到相应位置;d) 二 抗失活。

蛋白Western blot电泳——试验中常见问题及解答

蛋白质电泳与western blot1 Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。该文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术。 (1)原理 (2)分类 ①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色 (3)主要试剂 (4)主要程序 (5)实验常见的问题指南 1. 参考书推荐 2. 针对样品的常见问题 3. 抗体 4. 滤纸、胶和膜的问题 5. Marker 的相关疑问 6. 染色的选择7. 参照的疑问8. 缓冲液配方的常见问题 9. 条件的摸索10. 方法的介绍 11. 结果分析(1)原理:与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 (2)分类 ①放射自显影②底物化学发光ECL ③底物荧光ECF ④底物DAB呈色 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。 (3)主要试剂 1、(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和 1%(w/v)N,N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g,N,N-亚甲叉双丙稀酰胺1g,加H2O至100ml。)储于棕色瓶,4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0,因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月,隔几个月须重新配制。如有沉淀,可以过滤。 2、,1mlH2O去离子水配制,室温保存。 3、分离胶缓冲液:1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合,加水稀释到100ml终体积。过滤后40C 保存。 4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05g Tris溶于40mlH2O中,用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备,再用HCL调节PH值,而不用Tris.CL。 5,N,N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时,聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml,临用前配制. 6.1g过硫酸铵,加超纯水溶解并定容至10ml,分装到1.5ml微量离心管中,冻存。 7缓冲液8ml,甘油6.4ml,10%SDS 12.8ml,巯基乙醇3.2ml,0.05%溴酚蓝1.6ml,H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合,在沸水终煮3min混匀后再上样,一般为20-25ul,总蛋白量100μg。

westernblot原理及步骤

westernblot原理及步骤 Western blot基本原理: 在电场的作用下将电泳分离的多肽从SDS-PAGE凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western blot应用: 目的蛋白的表达特性分析; 目的蛋白与其他蛋白的互作; 目的蛋白的组织定位; 目的蛋白的表达量分析; 蛋白样品的制备: 1 水溶液提取法:稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大,是提取蛋白质最常用的的溶剂,操作相对麻烦,重复性一般; 2 有机溶剂提取法; 3 离心管柱提取法:超快速,易用,高产及重复性强; 4 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白。 Western blot注意事项和常见问题:

1 我的细胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,为什么呢? 答:有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS 浓度,同时将样品煮沸时间延长;也不排除你的抗原浓度过高,这时再加入适量上样缓冲液即可。 2 我做的蛋白质分子量很小(10 KD),请问怎么做WB? 答:可以选择0.2 μm的膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。 3 最后显色时用DAB好还是ECM好? 答:DAB 有毒,但是比较灵敏,是HRP 最敏感的底物;ECM结果容易控制,但被催化时灵敏度差一点,但如果达到阀值,就特别灵敏,可以检测pg 级蛋白,具体可以根据你实验的情况。 4 要验证某个细胞上有无该蛋白的存在,需要做免疫组化和western blot试验吗?做这两个试验时的一抗和二抗可以共用吗? 答:①免疫组化可以用来进行定位,但是不能精确定量,而且有时会有假阳性,不易与背景区分;Western blot可以特异性检测某个蛋白质分子,进行定量,但是不能定位。

western blot实验经验总结

western blot实验经验总结 1.抗体的选择 对于国内的大多数实验室来讲,做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单,买进口抗体捉襟见肘,买国产抗体得需要大无畏的勇气,对于我所在的兰州地区的实验者而言,感触尤深。在这五年的western blot实验历程里,我先后用过进口抗体,进口抗体国内分装包装,国产抗体,质量良莠不齐。 进口抗体一般不会出现闪失:abcam品种全,质量过硬,但价高(3400元/100微升),而且说是100微升,但至多能吸出来90微升;Sigma的价最贵;比较有性价比的是CST的抗体,现在好像是2200元/100微升,我前后用过二十几种, 1:1000的稀释比下,还没有失过手,100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot 实验,还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升,唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以,但是选用Santa的单抗还是有风险,估计这也是业界共识了吧。 进口抗体国内分装包装我也用过不少,呵呵,毕竟是穷人(420元/100微升),大概好抗体的比例约为50%,如果能做出来,也存在一个问题,就是抗体大多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对(抗体品种,货号等完全一致),在都能做出来的前提下,原装抗体能重复使用的次数要多出许多。具体原因我已经揣测了好几年,不敢说出来,我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖,也会有所不同。揣测归揣测,假如只为了发论文毕业走人,可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。 国产抗体比较知名的就几家,但质量确实不敢恭维。western blot能做出来的确实不多,而且杂带多,背景不干净。我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化,怎么说呢,应付硕士论文够了。 我也帮别人自制过抗体,再用抗原亲和纯化。效价非常不错,夸张的时候1:10000都能做出条带,唯一的麻烦是兔子太骚(骚臭),不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。如果读书非常悠闲,老板又特别想拥有手工作坊的情况下,可以自己伺候折腾兔子来玩玩,刚开始的时候还是蛮有成就感的。只是单凭抗原表达和制备多抗,是不是可以写成论文毕业,估计因校而异了。 2.Western Blot设备 目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad(伯乐),尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶,但通常用不上,由此造成垂直缓冲液的浪费,而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽,容易漏液,塑料夹应该是有疲劳寿命的,估计日子一长,弹性就会改变,所以如果你们实验室刚买了MINI4,赶紧用,遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。 Biorad的一套系统得两万多,西部能玩得起伯乐的还真不多。好在咱中国人聪明,上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样,而且可以通用,不带电泳仪是5千多一套,挺好用的。唯一的不足是塑料寿命不如伯乐,胶架容易断裂。不过仔细算算,三套天能也就是一套伯乐的价格,值了。北京六一的垂直槽

蛋白质印迹法westernblot

蛋白质印迹法 蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。 蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上,然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术,现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot 蛋白免疫印迹Western Blot 类似方法1 Southern Blot 杂交方法 类似方法2 Northern Blot 杂交方法 使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴

原理 与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似,但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAG(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。⑴ 分类 Western Blot 显色的方法主要有以下几种: i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈色

WB免疫印迹实验常见问题全汇总

【干货收藏贴】WB常见问题精品全集锦 做了很久的WB(western blot),走了很多弯路,但是WB想要做好并不难,总结WB实验中可能会遇到的问题,分析可能的原因及对应的解决方案,这就是实验成功的基石。 以下,我们先解决很多技术菌的疑惑,然后再着手汇总实验中常见问题和可能原 因分析以及给出建议解决方案。 WB常见问题分析 1.为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白? 原因有很多: a) 细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞; b) 细胞中的蛋白质被降解掉了,可加入蛋白酶抑制剂,抑制蛋白酶活性; c) 抗体不能识别目标蛋白,多看看说明,是否有问题; d) 酶降解可能是没有保持低温操作,样品保存不当,样品放置时间过长。 2.我做的蛋白质分子量很小(10KDa),请问怎么做WB? a)可以选择PSQ 膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。其他按 步骤即可; b)也可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜,转膜时间缩短,另外可采用 Tricine-SDS-PAGE体系。 3.我的目的带很弱,如何加强? a)可以加大抗原上样量,这是最主要的; b)也可以将一抗稀释比例降低; c)还可以延长曝光时间。 4.DAB好还是ECL好? DAB 有毒,但是比较灵敏,是HRP 最敏感的底物; ECL结果容易控制,但被催化时灵敏度差一点,但如果达到阀值,就特别灵敏,可以检测pg 级抗原。 5.胶片是一片空白,是怎么回事? 如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 a) 二抗的HRP 活性太强,将底物消耗光; b) ECM底物中H2O2,不稳定,失活; c) ECL底物没覆盖到相应位置; d) 一抗选择不当二抗失活; e) 二抗失活。

(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤 发布日期:2008-8-25 热门指数:4360 Western Blot(免疫印迹法) 主要包括以下4个基本步骤: n 样品制备 n 电泳分离 n 蛋白的膜转移 n 免疫杂交与显色――蛋白检测 溶液和试剂 n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS) n Modified RIPA buffer Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM n 1X SDS 样品缓冲液 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝 n 转移缓冲液 25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3) n 10X Tris缓冲盐(TBS) 准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6 n 脱脂奶粉或BSA n 甲醇 n TBS/T缓冲液 1X TBS, 0.1% Tween-20 n 封闭缓冲液(TBS/T)

1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA n 一抗的稀释 1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗) Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体,脱脂奶粉用于单克隆抗体,这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。 n 预染的蛋白质Marker,可用于监测转膜的效率 样品制备 原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白,以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法,其余的样品制备方法参阅相关文献。 1.培养细胞或药物处理。 2.弃培养基,用1X PBS漂洗细胞2次,去尽残留培养基。 3.加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2plate, 500-1000 μl/瓶),刮落细胞,转移到Ep管。注意:冰上操作。 4.超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。 5.煮沸样品5 minutes。 6.离心12000g, 5 min,取上清。 7.电泳分离:上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。 如要定量检测某蛋白的表达水平,应用RIPA裂解液(1 ml per 107cells/100 mm dish/150 cm2flask)裂解细胞,收集裂解液至离心管中,在振荡器上混匀4~15min,14000g离心15min(4℃),弃沉淀,用B radford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量,进行Western杂交时还需设置内或外参照,通常用beta-actin。 注意:一般上样20~30 μg已足够,如待检蛋白为低丰度蛋白,可加大上样量至100μg,但电泳条带易拖尾,可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。 电泳分离(参照SDS-PAGE电泳方法) 转膜 杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素,选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种:硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物,在低离子转移缓冲液的环境下,大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起,但在非离子型的去污剂作用下,结合的蛋白还可以被

WesternBlot结果条带分析

W e s t e r n B l o t结果条带 分析 Revised final draft November 26, 2020

W e s t e r n B l o t结果条带全面分析 1.空白 原因:比较多,如果单纯一张没有任何显色,最可能是一抗加成其他抗体,或者二抗种属加错了,比如兔的加成鼠的。 解决办法:仔细检查抗体是否加错,确认转膜没有问题。上面的图片展示的是一点信号都没有,如果是这样大部分情况是抗体加错了。如果中间出现了细微的条带,可能原因是蛋白上样量太少,一抗浓度过低,显色液失效。另外如果转膜出现了问题,比如膜放反了,自然是一个白片。 2.高背景 原因:封闭不够好,一抗浓度高,洗膜时间和次数不够。 解决办法:降低一抗浓度,增加洗膜时间和次数。 3.非特异性条带 原因:一抗非特异性与蛋白结合 解决办法:更换一抗 4.条带中出现边缘规则的白圈 原因:电转中膜和胶之间存在气泡。 解决办法:转膜前去掉膜和胶之间的气泡 5.出现黑点和黑斑 原因:膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合 解决办法:封闭结束之后要洗。 6.条带拖尾 原因:蛋白量太大,一抗浓度和时间太长 解决办法:根据情况调整蛋白量,同时一抗浓度和时间也可以缩短。 7.出现非均一性背景 原因:膜可能曾经干过 解决办法:在每一步的操作过程中,都需要注意不要让膜干。 8.某个条带变形 原因:SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒 解决办法:配胶过程中要小心,使用无杂质的液体。另外配胶用的水,SDS,Tris缓冲液要注意不要有杂质。 9.条带呈哑铃状 原因:配置胶有问题,胶凝固后不均一 解决办法:把胶配好,不合格的胶坚决不用 10.最边缘条带弯曲 原因:电泳电流不均一 解决办法:换用新的电泳槽;不使用两边的两孔 其他问题 (1)蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应。 (2)蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带,然后会出现一些其他带,最主要特点是所有的条带比正常的都低,并且条带模糊不清晰。 (3)所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多,其次是样品弥散(比如电泳长时间停止样品弥散)。 (4)整个条带呈“︶”状:凝胶冷却不均一,电泳槽老化。 (5)整个条带呈“︵”:凝胶左右两头没有凝固好 (6)溴酚蓝拖尾:样品溶解不好。 (7)纵向的纹理:上样样品中存在不溶性颗粒 (8)溴酚蓝很粗:浓缩胶浓缩效果不好,可能是浓缩胶太短,或者是浓缩胶配错。

westernblot详细图解详细版.docx

Western免疫印迹(Western Blot) 是将蛋白质转移到膜上,然后利用 抗体进行检测的方法。对已知表达 蛋白,可用相应抗体作为一抗进行 检测,对新基因的表达产物,可通 过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法 类似,但Western Blot采用的是聚 丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋 白质,“探针”是抗体,“显色”用标记 的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品,转 移到固相载体(例如硝酸纤维素薄 膜)上,固相载体以非共价键形式 吸附蛋白质,且能保持电泳分离的 多肽类型及其生物学活性不变。以 固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原,与对应的抗体起免疫反应,再 与酶或同位素标记的第二抗体起反 应,经过底物显色或放射自显影以 检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml;10%SDS 6.0 ml;β-巯基乙醇0.2 ml;ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液:甘氨酸2.9 g;Tris 5.8 g;

SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4):NaCl 8.0 g;KCl 0.2 g;Na2HPO4 1.44 g;KH2PO4 0.24 g;加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液:考马斯亮兰0.2 g;甲醇80 ml;乙酸2 ml;ddH2O118 ml。包被液(5%脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液:DAB 6.0 mg;0.01 M PBS 10.0 ml;硫酸镍胺0.1 ml;H2021.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 (1)倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。 (2)每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS (0.01M pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动1 min 洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。 (3)按1ml裂解液加10 μl PMSF(100 mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。) (4)每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30 min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 (5)裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。(整个操作尽量在冰上进行。) (6)于4℃下12000 rpm离心5 min。(提

WesternBlot原理和操作方法(全)讲解

Western Blot 原理和操作方法(全) Western Blot 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ? SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) <104 20-30

Westernblot实验步骤及注意事项

Westernblot实验步骤及注意事项 Westernblot 实验步骤 1. 组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA),PMSF(每克组织30μl,10 mg/ml PMSF),利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl,10 mg/ml PMSF),冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度),并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA,分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色,胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 western blot的实验步骤及注意事项的资料 1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。 1)转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜,将硝酸纤维素膜铺在凝胶上,用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。 2)在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸(预先用转移缓冲液浸湿),将凝胶夹在中间,保持湿润和没有气泡。薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中,凝胶面向阴极。/凝胶/)将此滤纸3.

4)将上述装置放入缓冲液槽中,并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。 5)按照厂家所示接通电源开始电泳转移。 6)转移结束后,取出薄膜和凝胶,弃去凝胶。 2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色,直至分子量标准显现时取出,记录下标准位置。 3. 用100ml水洗涤纤维素膜,必要时可用脱色缓冲液。 4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。 5. 室温下,用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。 6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中,尽可能不留空气。 7.袋的一角剪一缓冲液的小口,用透析袋夹紧。 8.混合:NGS(100微升),印迹缓冲液中的抗体(10毫升),加在装薄膜的袋中,于室温下摇动2小时(或4℃过夜) 9.用总体积300ml PBS-Tween缓冲液,分4次在一浅盘中洗涤薄膜,每次75ml。 10.将连接生物素的羊抗兔IgG(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS)加在袋内,于室温下摇动1小时。 11.按步骤9洗涤。 12.加入抗生素蛋白-HRP(40微升溶于10毫升印迹缓冲液/100微升NGS),于室温下摇动。 注意事项: western blot中转移在膜上的蛋白处于变性状态,空间结构改变,因此那些识别空间表位的抗体不能用于western blot检测。这种情况可以将表达目的蛋白的细胞或细胞裂解液中的所有蛋白先生物素化,再用酶标记亲和素进行western blot。实验中取胶和膜需带手套。 Western实验步骤 Western,也称Western blot、Western blotting、Western印迹,是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参 考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) O 可以使用适当的裂解液,例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液,裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚 细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等,可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用试剂盒 进行抽提,例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒。 O 收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同,需要 采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生

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Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色,体同水平和实验条件的是用第一种方法,目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行,操作也比较简单,原理如下(二抗用HRP标记):反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到HRP,即发光,可使胶片曝光,就可洗出条带。

WB实验问题

Western Blot问题指南 时间:2011-05-13 08:55 来源:网络作者:admin点击:3679次 根据问题的类型主要分成以下几类(以下资料权作参考,请勿盲目模仿!); 1.参考书 推荐A.对初学者看什么资料比较好?解答:《抗体技术实验指南》和Antibodies (a laboratory manual , 根据问题的类型主要分成以下几类(以下资料权作参考,请勿盲目模仿!); 1. 参考书推荐 A. 对初学者看什么资料比较好? 解答:《抗体技术实验指南》和Antibodies (a laboratory manual,wrote by Ed Harlow ,david lane )两本书不错。 2. 针对样品的常见问题 B. 做线粒体膜UCP蛋白的Western Blot (以下简写成Western Blot),提取线粒体后冻存(未加蛋白酶抑制剂),用的博士德的一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120 口g,换了个santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因?蛋白酶抑制剂单力口PMSF亍吗? 解答:怀疑是样品问题,可能是:1,样品不能反复冻融;2,样品未加蛋白酶抑制剂。同时,建议检查Western Blot过程,提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加PMSF就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。 C. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗? 解答:当然可以,有的甚至可以同时测几十种样品。 D. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白,操作需要注意什么? 解答:如果是膜蛋白和胞浆蛋白,所用的去垢剂就要温和得多,这时最好加上NaF去抑 制磷酸化酶的活性。 E我的样品的蛋白含量很低,每微升不到1微克,但是在转膜时经常会发现只有一部分 蛋白转到了膜上,就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在,只是颜色变淡了, 有什么办法可以解决? 解答:你可以加大上样量,没有问题,还有转移时你可以用减少电流延长时间,多加5—10%甲醇。 F. 想分离的蛋白是分子量260kd的,SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适?积层胶的 浓度又该用多少?这么大分子量的蛋白容易作Wester n Blot吗? 解答:260kd的蛋白不好做,分离胶用6%, Stacking Gel 3.5 %。 G. 如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。 解答:可以浓缩样品,也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,可以试试1.5m m的comb。

Western Blot常见问题及处理总结

免疫细胞研究westernblot WesternBlot常见问题及处理总结 阿木 1、westernblot的优点 答:灵敏,可达ng级,用Ecl显色法理论上可达pg级。方便,特异性高。 2、为什么我的细胞提取液中没有目标蛋白? 答:原因有很多:a)你的细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞;b)你的细胞中的蛋白质被降解掉了,你必需加入PMSF,抑制蛋白酶活性;c)你的抗体不能识别目标蛋白,多看看说明,看是否有问题。 3、我的细胞提取液有的有沉淀,有的很清亮,为什么呢? 答:a)有沉淀可能因为你的蛋白没有变性完全,可以适当提高SDS浓度,同时将样品煮沸时间延长,b)也不排除你的抗原浓度过高,这时再加入适量上样缓冲液即可。 4、我做的蛋白质分子量很小(10KD),请问怎么做WB? 答:可以选择0.2μml的膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。其他按步骤即可。

5、我的目的带很弱,怎么加强? 答:可以加大抗原上样量。这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。 6、胶片背景很脏,有什么解决方法? 答:减少抗原上样量,降低一抗浓度,改变一抗孵育时间,提高牛奶浓度。 7、目标带是空白,周围有背景,是为什么?答:你的一抗浓度较高,二抗上HRP催化活力太强,同时你的显色底物处于一个临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低,或更换新底物。 8、我的胶片是一片空白,是怎么回事? 答:如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。 a)二抗的HRP活性太强,将底物消耗光;b)ECM 底物中H2O2,不稳定,失活;c)ECL底物没覆盖到相应位置;d)二抗失活。 9、我在显影液中显影1分钟和5分钟后,底片漆黑一片,是什么原因呢? 答:a)可能是红灯造成的,胶片本来就被曝光了,可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.; b)显影时间过长。 10、DAB好还是ECM好?

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