Removed_研究蛋白质与DNA相互作用

一、凝胶阻滞试验

1.试验原理

又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。

2.主要步骤及内容

首先是用放射性同位素标记待检测的DNA片段(亦称探针DNA)，然后同细胞蛋

白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA-蛋白质复合物。将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离。应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞蛋白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有放射性标记都将集中出现在凝胶的底部，反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。

凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性。

其办法是在DNA-蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记的竞争

DNA(competitor DNA)。如果它与同位素标记的探针DNA结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，所以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。相反地，如果反应中加入的竞争DNA并不能够同探针DNA竞争结合同一种蛋白质，于是探针DNA便仍然与特定蛋白质结合形成复合物，结果在电泳凝胶的放射自显影图片上就会呈现阻滞的条带。

在凝胶阻滞试验中使用竞争DNA，可以间接地阐明在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用。例如，使用一种具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，

我们就可以判断通过特定的凝胶阻滞试验所检测到的蛋白质，是否就是属于此

类转录因子，抑或是与之相关的其它因子。同样地，假如我们在竞争DNA上已知的转录因子结合位点处，事先引入一个或少数几个碱基突变，通过凝胶阻滞试验亦可有效地评估出这些突变对竞争DNA的性能及其与转录因子结合作用的影响。

二、DNaseI足迹试验(DNaseI footFIrinting assay) DNaseI足迹试验是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的准确结合位点的技术。

首先是对包含一定顺式作用元件的双链DNA进行单链标记，然后用DNaseI水解单链标记的双链DNA，产生不同长度的片断，DNA结合蛋白与其特异序列结合处由于空间位阻，DNaseI对这部分DNA不能切割，即被DNaseI保护。DNaseI水解产物经尿素变性，PAGE分离及放射性显影后，形成以相差一个核苷酸为梯度的一系列DNA条带，在此显影图中相应于DNA结合蛋白的位置上由于DNA结合蛋白的保护作用而形成了空白区域。如果在电泳时结合DNA化学测序，则可准确判断出结合区的精确序列。

三、甲基化干扰试验

根据DMS能使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理而设计。具体操作是，先用DMS处理DNA，并控制反应条件，使之达到平均每条DNA分子只有一个残基被甲基化；而后将这些局部甲基化的DNA群体同含有DNA结合蛋白的适当细胞提取物一道温育，并做凝胶阻滞试验。经电泳分离后，从凝胶中切除具有结合蛋白的DNA条带和没有结合蛋白的DNA条带，并用六氢吡啶处理之。于是，甲基化的残基被切割，不具甲基化的残基不被切割。显而易见，如果因一个G残基的甲基化作用阻止了蛋白质同DNA的结合，那么六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有同蛋白质结合的DNA分子中观察到。相反地，如果一个特殊的G残基在DNA与蛋白质的结合中不起作用，那么六氢吡啶对这个G残基的切割作用，则在同蛋白质结合的DNA 分子中及不同蛋白质结合的DNA分子中均可观察到。

四、酵母单杂交技术

酵母单杂技术是1993 年由Li et al 从酵母双杂交技术发展而来的其基本原理为: 真核生物基因的转录起始需转录因子参与。转录因子通常由一个DNA 特异性结合功能域和一个或多个其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成即

DNA 结合结构域(DNA-binding domain BD)和转录激活结构域(activationdomain AD). 用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的录因子。GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端含有几个锌指结构，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)，而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TFIID 相互作用提高RNA 聚合酶的活性。在这一过程中DNA 结合结构域和

转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此我们可将GAL4 的DNA结合结构

域置换为文库蛋白编码基因，只要其表达的蛋白能与目的基因相互作用同样可通过转录激活结构域激活RNA聚合酶启动下游报告基因的转录。其基本操作过程为:(1)设计含目的基因(称为诱饵)和下游报告基因的质粒并将其转入酵母中；

(2)将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒转化入同一酵母中；(3)若文库蛋白与目的基因相互作用可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来. 在这里作为诱饵的目的基因就是启动子DNA 片段，文库基因所编码的蛋白就是启动子基因结合蛋白. 酵母单杂交技术广泛用DNA与蛋白相互作用的研究。

五、噬菌体展示技术

噬菌体展示技术是一种基因表达产物和亲选择相结合的技术。基本原理及操作过程为：以改构的噬菌体为载体把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白基因区，如在噬菌pIII 和p VIII 衣壳蛋白基因区的N 端插入外源基因，形

成的融合蛋白，表达在噬菌的表面不影响噬菌体的生活周期及天然构型，且易被相应的抗体或受体分子识别。外源蛋白或多肽表达于噬菌体的表面与固定或固相支持物结合通过适当的淘洗，洗去非特异性结合的噬菌体(即亲和富集法)选出目的噬菌体而编码基因作为病毒基因组的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA 测序得知. 在这一过程中外源基因是编码启动子DNA 结合蛋白的文库基因而固定或固相支持物分子则为启动子DNA片段. 噬菌体展示技术是一种经济高效的研究生物大分子相互作用的技术如构建噬菌体随机多肽文库可用来筛选包括抗体小分子细胞表面受体等多种分子。Cicchini et al 用噬菌体展示技术筛选出肝富有的转录因子HNF1a 启动子结合蛋白.与蛋白相互作用的研究。

　六、核酸适体技术

核酸适体(aptamer)指的是经过一种新的体外筛选技术——指数富集配体系统进化(systematic evo lution of ligands by exponential

enrichment，SELEX)，从随机单链寡聚核苷酸文库中得到的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸，可以是RNA 也可以是DNA，长度一般为25~60 个核苷酸。SELEX的筛选流程首先是利用现有的分子生物学技术人工合

成一个含有1014~1015 个单链寡核苷酸序列的随机文库，序列长度往往在

25~35 个核苷酸之间，单链的随机寡核苷酸序列容易形成可与蛋白质等配体特异性共价结合的二级结构，在这一高亲和力特异性结合的基础之上配体蛋白质同随机文库相互作用，选择性分离出核酸适体后，然后通过PCR或RT-PCR 等

技术进行扩增。次一级文库再与配体蛋白质相互作用，反复多次循环，即可获得与配体蛋白质特异性高亲和力结合的核酸适体。核酸适体与配体间的亲合力(解离常数在皮摩和纳摩之间)常要强于抗原抗体之间的亲合力。核酸适体所结合的靶分子范围非常广泛，除蛋白质之外，还能作用于酶、生长因子、抗体、基因调节因子、细胞黏附分子、植物凝集素、完整的病毒颗粒、病原菌等。适体从20 世纪90 年代初出现以后，就得到了科研工作者的广泛关注，适体的研究工作得到了快速的发展。SELEX筛选技术和核酸适体的高亲和性在蛋白质/

核酸相互作用的研究中发挥了重要的作用。

七、体内足迹实验：

体内足迹试验原理与甲基化试验基本相同，其实质是体外甲基化试验的变种。在体内足迹试验中，是用有限数量的DNS处理完整的游离细胞，并使其渗透到细胞内的浓度恰好导致天然染色体DNA中G残基发生甲基化。而后从这些细胞中提取DNA，并加入六氢吡啶作体外消化。结果情况就如同体外足迹试验一样，能与某中特殊蛋白质因子结合的DNA区段，其上的G残疾就不会被DNS甲基化，因而就不会被六氢吡啶所切割。因此，同对照的体外裸露DNA所形成的序列梯度比较，就会发现由完整的活细胞染色质DNA形成的序列梯度中，缺少了G残基没有被切割的相应条带。

经体内足迹实验从染色体总DNA中获得的任何一种特异DNA的数量都是很少的。因此，有必要通过PCR技术从染色质总DNA中扩增特异的靶DNA，以获得

足够数量的DNA样品，供体内足迹试验使用。

八免疫沉淀技术

八、染色体免疫沉淀技术

它们都有一定的局限性，不足以充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作

用的真实情况。因为高等生物的基因组DNA和DNA上的结合蛋白共同组成染色

质结构，用以上所提到的方法分析得到的某段DNA与蛋白质的相互作用的结果，在体内则很可能由于染色质高级结构的存在，而使DNA与蛋白质难以接近。因此，在生理状态下，这段DNA很可能并不与其相对应的因子相结合，是没有功

能的，反之亦然。另外，染色质结构本身是动态的，DNA与非组蛋白在生理状

态下的相互作用通常是瞬时的，以上方法难以捕捉到发生在染色质上的基因表

达调控的瞬时事件。而染色质免疫沉淀技术则可以找出在生理条件下某个DNA

结合蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况。

1、技术介绍

在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，超声波将染色质打碎后，

用所要研究的目的蛋白特异性的抗体沉淀这种交联复合体。只有与目的蛋白结

合的DNA片段才能够被沉淀下来。

2、主要步骤及内容

2.1 细胞的甲醛固定

甲醛是一种高分辨率的可逆的交联剂，能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质--DNA、蛋白质-RNA交联。在甲醛的作用下DNA碱基上的氨基或亚氨基和蛋白质

上的氨基及赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸的侧链氨基与另外的DNA和蛋白

质上的氨基或亚氨基交联在一起，在几分钟内形成生物复合体，防止细胞内组

分的重新分布。交联所用的甲醛终浓度约为1%，而交联时间需要预实验来确定。可以加入甘氨酸来终止交联反应。

2.2 超声波断裂染色质

甲醛交联后的染色质对限制酶和DnaseI高度抵抗，因此通常使用机械剪切力使得染色质断裂。打断后的染色质片段的平均长度应该在500-1000bp左右（可以用琼脂糖凝胶电泳来鉴定）。

2.3 氯化铯等密度离心纯化交联的染色质

氯化铯等密度离心可以除去未交联的蛋白质、DNA和RNA样品中加入0.5%的十二烷基肌氨酸钠，通常在4000rpm离心72h。离心后，在离心管的密度梯度顶部可以见到Sarkosyl-脂类-蛋白的聚集物。用连接到蠕动泵的0.25mm毛细管从梯度的底部分部收集染色质组分，在4℃透析过夜。

2.4 染色质免疫沉淀和免疫沉淀复合体的纯化

用目的蛋白特异性的抗体进行染色质免疫沉淀。抗体的量要进行优化，$防止非特异的结合。用ProteinA/G-Agarose/Sepharose回收免疫沉淀复合体。经过洗涤除去非特异结合的染色质后，用1%SDS+NaHCO3洗脱免疫沉淀复合体。2.5 交联反应的逆转和DNA的纯化

在免疫沉淀复合体中加入不含Dnase的Rnase，65℃保温6h使交联逆转。经酚氯仿抽提-乙醇沉淀纯化DNA。纯化的DNA极少，可用色谱定量。

2.6 染色质免疫沉淀的DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定

染色质免疫沉淀的DNA的分析方法有许多种。如果目的蛋白的靶序列是已知的或者怀疑某个序列是目的蛋白的靶序列，可以采用狭缝杂交和PCR分析;如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋白在基因组上的分布情况,找出反式作用因子的结合位点,可以采用Southern杂交、ChIP克隆和DNA芯片方法。

2.6.1 验证目的蛋白与DNA靶序列的特异性结合

通过狭缝杂交（Slot-blot）实验用靶序列特异性探针与染色质免疫沉淀的DNA杂交来验证目的蛋白与DNA靶序列的特异性结合。其相对富集率可以通过比较探针与特异性和非特异性抗体(即未免疫的IgG)所免疫沉淀的M5A的杂交信号而测定。还可以根据靶序列设计引物，用定量或半定量PCR的方法，比较特异性和非特异性免疫抗体所沉淀的DNA的PCR产物的量；或者比较根据靶序列设计的引物和远离靶序列设计的引物的PCR产物的量。比值越大，则说明靶M5A序列与目的蛋白相结合的可能性越大。

2.6.2 研究未知蛋白质的DNA结合位点

如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋白在基因组上的分布情况，则可用Southern杂交法。用免疫沉淀的DNA本身就可以作为Southern探针。但是因为免疫沉淀富集的DNA极少（通常只有几个8ng),通常需要用PCR 方法扩增富集的DNA探针。将免疫沉淀的DNA用限制酶切后，与合适的接头相

连，然后用与接头序列匹配的引物扩增该DNA序列。以放射性标记后的PCR产

物作Southern杂交的探针，扫描整个基因组确定目的蛋白结合位点的分布情况。

由于使用染色质免疫沉淀技术得到的结果是大量而又复杂的，因此运用普

通方法对其结果的分析和处理就显得力不从心。近年来发展起来的基因芯片（chip）染色质免疫沉淀ChIP技术相结合(chip-ChIP)的方法,大大促进了在基因组水平上高通量对DNA和蛋白质的相互作用的研究。需要一个

PCR（Ligation-Mediated PCR）步骤来扩增染色质免疫沉淀富集的DNA。特异

性染色质免疫沉淀的DNA和对照DNA的PCR产物分别用Cy5和Cy3荧光光标记，用于与含有整个基因组的M5A芯片进行杂交。通过比较两种荧光信号的强度筛

选出目的蛋白可能的结合序列$在基因组的水平上绘制出目的蛋白的分布图谱。2.7 目的蛋白和DNA靶序列特异结合的进一步验证

染色质免疫沉淀分析得到的结果有很大一部分是假阳性，需要采用其他方法

验证结果的真实性。用PCR方法进行独立的ChIP分析、电泳迁移率变动分析、酵母单杂交系统及荧光素酶报告系统最终确定目的蛋白与靶DNA序列的特异性

结合。