转绿色荧光蛋白基因的青枯雷尔氏菌生物学特性
中国农业科学 2008,41(11):3626-3635
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2008.11.024 转绿色荧光蛋白基因的青枯雷尔氏菌生物学特性
车建美1,2，蓝江林1，刘 波1
（1福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州 350003；2福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福州 350002）
摘要：【目的】采用电击法对青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）进行gfp/luxAB基因双标记，研究标记前后菌株的生长差异、以及侵染性和致病性的变化。【方法】通过电击法进行青枯雷尔氏菌的遗传转化，采用番茄组培苗对标记菌株的侵染条件和侵染过程进行初步研究。【结果】成功地采用gfp/luxAB基因标记了青枯雷尔氏菌。标记后的菌体细胞形状与亲本菌株形状相同，均为长椭圆形，近杆状，整个细胞呈现绿色荧光，PCR 结果表明，从标记青枯雷尔氏菌菌株的基因组DNA中扩增出约3.0 kb的gfp基因片段。标记菌在对数生长期，荧光素酶活性快速增加，到稳定期，荧光素酶活性降低。在无选择压力条件下连续移植20次，仍然保持均匀而且强烈的绿色荧光，荧光稳定性保持在100%。gfp基因标记前后的菌株在培养的最适温度、最佳pH值及生长曲线上基本一致，在番茄组培苗内的侵染路线相同，致病力均达到90%以上。【结论】将gfp和luxAB融合基因成功转入青枯雷尔氏菌，融合基因在标记菌株中的表达高效稳定。导入的gfp基因对宿主的生长特性及致病性没有影响。
关键词：青枯雷尔氏菌；电击法；gfp/luxAB基因
GFP Tagging Ralstonia solanacearum with gfp/luxAB mini-Tn5
CHE Jian-mei1,2, LAN Jiang-lin1, LIU Bo1
(1Agricultural Bioresource Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003; 2Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Fujian Agriculture and Forestry University, Ministry of Education, Fuzhou 350002)
Abstract: 【Objective】The Ralstonia solanacearum strain was chromosomally tagged with the marker genes gfp and luxAB by electroporation. The growth properties and the pathogenicity of the tagged strain and the wild type strain were compared in this paper.【Method】The R. solanacearum strain was transformed by the electroporation. The condition and processor of the invasion of the GFP-tagged strain was observed in the tomato tissue culture plants. 【Result】Transformant was screened for the green fluorescence by fluorescence stereomicroscopy. A 3.0 kb fragment of the gfp gene and luxAB gene was amplified from the genome DNA of the GFP-tagged strains. Morphologically, the cells of the engineered strain were similar to wild type strain as determined by laser scanning confocal microscopy. Luciferase activity of the GFP-tagged strain increased rapidly during the log phase, but decreased in the stationary phase. The green fluorescence could be kept until 20 times of subcultures. It was the same for the GFP-tagged strian and the wild type strain in the culture temperature, pH value and growth curve. These results confirmed that the dual marker was inserted successfully into the R. solanacearum strain. The pathogenicity of the wild type strain and the GFP-tagged strain was over 90% which means gfp gene had no effect on the pathogenicity. 【Conclusion】The GFP-tagged R. solanacearum is obtained in this study. The growth propertities and the pathogenicity of the GFP-tagged strain is the same to the wild type strain.
Key words: Ralstonia solanacearum; Electroporation; gfp/luxAB gene
收稿日期：2007-11-06；接受日期：2008-02-22
基金项目：国家自然科学基金（30871667），国家“863“计划项目（2006AA10A211），福建省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金（STIF-Y03），福建省计委项目（闽计农经[2002]48号），福建省自然科学基金项目（2006J0068），福建省外专局项目（Y20063500001），福建省农林科学院项目（闽农科院发[2005]256-13）
作者简介：车建美（1977-），女，山东乳山人，博士研究生，研究方向为生物技术及生物防治。Tel：0591-********；E-mail：chejm2002@https://www.360docs.net/doc/4d12423091.html,。
通讯作者刘波（1957-），男，福建惠安人，研究员，博士，研究方向为微生物生物技术与农业生物药物。Tel：139********；E-mail：fzliubo@https://www.360docs.net/doc/4d12423091.html,
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0 引言
【研究意义】植物细菌性青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种毁灭性的土传细菌病害。青枯雷尔氏菌寄主广泛，可侵染44个科数百种植物[1]。植物青枯细菌致病的分子机制是植物与微生物相互作用机制研究的重要领域之一。在植物根际土壤中和植株体内存在着大量的青枯雷尔氏菌，这给青枯雷尔氏菌侵染致病机理的研究带来了困难。将gfp基因转入青枯雷尔氏菌将有助于研究青枯雷尔氏菌在活体植物体内的侵染过程，建立菌体生物量的直观测定方法，从而为更加深入地研究青枯雷尔氏菌致病机理及青枯病生物防治机制奠定基础。【前人研究进展】绿色荧光蛋白（GFP）最早是从水母中分离出来的，是一种非酶性报告因子，该蛋白能够自身催化形成发色结构并在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光，作为报告基因，GFP是目前能在活细胞中表达的发光蛋白之一，作为荧光标记分子，GFP既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害[2]。GFP检测方便，荧光稳定，易于构建载体且对活细胞无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞可以继续传代[2]。利用GFP标记进行病原菌侵入活体细胞过程的跟踪观察更开创了病理学研究的新时代[3~5]。Unge等[6]的研究证明了荧光与菌体细胞数量呈线性关系，也为通过荧光直接对细菌记数提供了一个方便快捷的方法。gfp基因在其它细菌上的转化有过许多报道，但是，青枯雷尔氏菌gfp基因转化非常困难，国内外许多学者都试图进行青枯雷尔氏菌gfp基因转化，然而，成功的例子非常少，通过NCBI检索，仅见两篇关于gfp 基因转入青枯雷尔氏菌的报道[7,8]，一篇是采用自然转化的方法将来自AW1-gfp38菌株的Tn5::gfp转入青枯雷尔氏菌K60[7]，另一篇则采用细胞融合的转录方法将hrp-gfp基因转入GMI1000[8]。【本研究切入点】未见关于采用电击转化法进行青枯雷尔氏菌的gfp基因转化的报道。目前在国内未见关于青枯雷尔氏菌gfp 基因转化的报道。【拟解决的关键问题】在本研究中，作者采用带有gfp/luxAB双标记基因的pUT mini-Tn5转座载体，通过电击转化法成功地将它整合到青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）染色体上，并利用荧光显微镜检测GFP在标记菌中表达后发出的绿色荧光，同时进行了转化菌体的gfp基因检测和转化菌株的微生物学异质性检测，研究转化菌株的生物学稳定性，为青枯雷尔氏菌gfp基因转化和致病机理的研究提供方法。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株和质粒 青枯雷尔氏菌（R. solanacearum）编号Rs91菌株为本实验室从番茄植株上分离纯化得到并保存。大肠杆菌（Escherichia coli）CC118为转座载体pUT gfp/luxAB的宿主菌，由瑞典农业大学微生物系Janet K. Jasson教授惠赠，其中带有双标记基因gfp/luxAB [9]，质粒图谱见图1。
图1 质粒pUT gfp/lux图谱
Fig. 1 The map of pUT gfp/lux
1.1.2 培养基、抗生素与试剂 大肠杆菌（E. coli）CC118的培养基为LB培养基；青枯雷尔氏菌的培养基为0.1×TSB；质粒大量提取及纯化试剂盒为德国QIAGEN公司的QIAGEN Plasmid Maxiprep Kit；抗生素卡那霉素（Kanamycin，Km）购自Sigma公司；电转化仪为Bio-Rad Gene Pulser Ⅱ；立体荧光显微镜（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品。凝胶成像仪BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging System、离心机为德国生产的Hettich mikro200R。引物gfplux Forw Not I（5'-gcggccgcataggta aaggagaagaac ttttcact -3'）和引物gfplux Rev Not I（5'-gcggccgct tacgag tggtatttgacgatgtt-3'）由美国Invitrogen公司合成。
1.2 试验方法
1.2.1 青枯雷尔氏菌的gfp转化
1.2.1.1 质粒的提取 参照文献[10]。质粒提取及纯化步骤按QIAGEN质粒大量提取试剂盒提供的方法进行。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，上样量为2 μl。
1.2.1.2 青枯雷尔氏菌感受态细胞的制备 从0.1× TSB固体平板上挑取新鲜的青枯雷尔氏菌单菌落于20 ml 0.1×TSB液体培养基中，30℃，150 r/min振荡
3628 中国农业科学41卷
培养过夜，按照1%接种比例接入500 ml 0.1×TSB液体培养基中，30℃，150 r/min振荡培养，每1 h测定1次OD600。收集生长中期的培养物于冰水浴中放置30 min后，用无菌水冲洗细胞4次，最后将细胞悬浮于1 ml无菌水中，并在－70℃冰箱保存备用。
1.2.1.3 青枯雷尔氏菌的电击转化参照文献[10]。电击转化后取200 μl菌液涂布于含有50 μg·ml-1卡那霉素的0.1×TSB固体培养基上，30℃培养。电击转化的参数为：电压2.5 kV、电容25 μF、电阻400 ?。
1.2.1.4 阳性转化子的荧光检测及激光共聚焦显微检测 检测方法参照文献[11]。通过观察菌落发出的绿色荧光直接筛选阳性转化子，命名为Rs91-GFP。1.2.2 青枯雷尔氏菌Rs91-GFP的鉴定及荧光检测 1.2.2.1 Rs91-GFP的PCR检测 引物gfplux Forw Not I和引物gfplux Rev Not I（由瑞典农业大学Janet 教授组内博士生设计，该引物可扩增gfp和lux片段的全部序列）。采用灭菌的牙签挑取少许新鲜培养的单菌落加入25 μl PCR反应体系中。25 μl PCR反应体系中含有2 μl 10×Buffer；1 μl 2 mmol·L-1dNTPs；1 μl 10 μmmol·L-1引物。所用模板DNA分别为Rs91-GFP基因组DNA、Rs91基因组DNA（阴性对照）、以及质粒DNA（阳性对照）。PCR循环参数为：94 ℃预变性 2 min；进入94℃ 10 s，60℃ 30 s，68℃ 8 min，共10个循环；然后进入94℃ 15 s，60℃ 30 s，68℃ 8 min，共20个循环；最后68℃延伸10 min。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，上样量为3 μl，最后用Bio-Rad 2000型凝胶成像仪拍摄。
1.2.2.2 Rs91-GFP的荧光素酶活性检测 按照1%的比例将过夜培养的Rs91-GFP培养液接入0.1×TSB 液体培养基（含50 μg·ml-1 Km），置30℃、150 r/min 恒温摇床振荡培养，每2 h测定1次荧光素酶活性。荧光素酶测定方法参照文献[9]。试验重复3次。
1.2.3 Rs91-GFP的稳定性检测 按照1%的比例将过夜培养的Rs91-GFP培养液接入0.1×TSB液体培养基中，置30℃、150 r/min恒温摇床振荡培养，每12 h 移植1次，连续20次，分别于第2、8、12、16和20次，适当稀释涂布于0.1×TSB固体培养基上，培养48 h后统计菌体数量并于荧光显微镜下观察GFP表达情况。
1.2.4 青枯雷尔氏菌Rs91-GFP菌株的生长特性
1.2.4.1 Rs91-GFP生长曲线的测定按照1%的比例将新鲜培养的标记前后的菌株培养液接入0.1×TSB 液体培养基（含有50 μg·ml-1 Km）和0.1×TSB液体培养基中。置30℃、150 r/min恒温摇床振荡培养，每
隔1 h取样，用UV-2550紫外分光光度计测定OD600
值，试验重复3次。
1.2.4.2 培养温度对Rs91-GFP生长的影响 将培养
好的Rs91-GFP接入0.1×TSB液体培养基（装瓶量
25 ml/250 ml），接种量为1%，分别于25、30、35、40、45℃、200 r/min摇床培养。
1.2.4.3 初始pH对Rs91-GFP生长的影响 先将
0.1×TSB液体培养基（装瓶量25 mL/250 mL）的pH
值调为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，将培养好的Rs91-GFP
接入液体培养基，接种量为1%，于30℃，150 r/min
恒温摇床培养。
所有生长特性的测定试验均在培养 3 h后测定
OD600值。调零对照为0.1×TSB液体培养基，另一对
照为Rs91。
1.2.5 青枯雷尔氏菌Rs91-GFP菌株的定殖和侵染特性
1.2.5.1 温度对Rs91-GFP菌株定殖的影响Rs91- GFP菌株于0.1×TSB液体培养基中，30℃下振荡培
养48 h，取培养也配制成103 cfu/ml的孢子悬浮液，
备用。番茄组培苗至4～5片真叶长出。挑选长势均一
的组培苗，用无菌的组培刀伤根，接入菌液，以清水
处理为对照，每处理接3瓶（每瓶3株苗），分别置
于19℃，22℃，25℃，28℃和31℃培养。取整株苗称
重，按比例稀释，每个样品选择两个稀释度，吸取0.1
ml均匀涂布0.1×TSB平板上。将涂布好的平板放入30℃的培养箱中培养，观察平板上菌的生长情况。待
平板上的菌落明显形成且易计数时，取出统计平板上
单菌落数量。
1.2.5.2 Rs91-GFP菌株在番茄组培苗体内转移路线
的测定 Rs91-GFP菌株的培养同上。番茄组培苗至
4～5片真叶长出。挑选长势均一的组培苗，用伤根法
接菌6瓶（每瓶3株苗），以清水处理为对照。接菌
9 h后，每3 h取1瓶，取根部，基部和上部茎，叶片
分别称重研磨，按比例稀释（具体稀释倍数视样品而定），Rs91-GFP的培养方法同上。
1.2.5.3 Rs91-GFP菌株对番茄组培苗致病性影 响 Rs91-GFP菌株的培养及番茄组培苗的接菌方法
同上。将组培苗置于30℃培养，每天观察组培苗的生
长状况，统计组培苗的萎蔫及死亡率。
2 结果与分析
2.1 pUT gfp/luxAB质粒DNA的提取
通过琼脂糖凝胶进行电泳，得到1条条带，质粒
11期 车建美等：转绿色荧光蛋白基因的青枯雷尔氏菌生物学特性 3629 DNA 的分子量为10 kb 左右。所提取的质粒DNA 未
见拖尾，说明质粒提取效果较好，没有杂菌污染和宿
主DNA 污染，因此，可以用于青枯雷尔氏菌的转化
研究（图2）。
M: Marker; P: pUT gfp/lux
图2 质粒pUT gfp/lux 的电泳图谱
Fig. 2 The plasmid of pUT gfp/lux
2.2 GFP 标记的青枯雷尔氏菌的获得及转化子的荧
光检测
本研究成功地将gfp/luxAB 双标记基因整合到青
枯雷尔氏菌Rs91染色体上，得到绿色荧光蛋白基因
标记的青枯雷尔氏菌Rs91-GFP ，将转化后的菌落置于
荧光显微镜下观察，发现菌落发绿色荧光，菌落与出
发菌株形状相同，为近圆形菌落；在荧光显微镜下观
察转化后菌株的细胞形态，发现标记后菌株的细胞形
状与亲本菌株形状相同，均为长椭圆形，近杆状，整
个细胞呈现绿色荧光，说明已经将gfp 基因转入青枯
雷尔氏菌（图3和图4）。
图3 GFP 标记菌株Rs91-GFP 发光菌体
Fig. 3 The cells of GFP-tagged R. solanacearum strain
Rs91-GFP 图4 青枯雷尔氏菌Rs91的菌体形态 Fig. 4 The cell of R. solanacearum strain Rs91 2.3 青枯雷尔氏菌Rs91-GFP 菌株的鉴定及荧光检测 2.3.1 GFP 标记菌株的PCR 鉴定 从含gfp 基因的质粒DNA 和青枯雷尔氏菌Rs91-GFP 基因组DNA 上均扩增出大小约为3.0 kb 的片段，与预期的片段大小一致，而Rs91基因组DNA 中扩增不到目的片段，说明gfp 基因已经成功转入青枯雷尔氏菌（图5）。
M ：Marker ；1：质粒；2～6：5个GFP 标记的青枯雷尔氏菌Rs91-GFP 菌落；7：青枯雷尔氏菌Rs91 M: Marker; 1-6: 5 colonies of Rs91-GFP; 7: Negative control 图5 PCR 检测GFP 标记青枯雷尔氏菌菌株Rs91-GFP Fig. 5 PCR amplified the GFP fragment of the GFP-tagged R. solanacearum strain Rs91-GFP 2.3.2 Rs91-GFP 荧光素酶活性的检测 试验结果如图6所示，在Rs91-GFP 生长的过程中，荧光素酶活性先呈线性增长，到达稳定期之后荧光素酶活性迅速下降。在初始培养的2 h ，Rs91-GFP 的荧光素酶活性为6.33 quanta·s -1·ml -1，随着Rs91-GFP 生长进入对数期，荧光素酶活性也呈线性增长，由6.33 quanta·s -1·ml -1升为7.24 quanta·s -1·ml -1，当Rs91-GFP 生长达到稳定期时，荧光素酶活性达到最大值，即7.38 quanta·s -1·ml -1；到了稳定期，即培养的12 h 之后，由于代谢能力下降导致荧光素酶活性逐渐降低，由对数期的7.38 quanta·s -1·ml -1降为培养48 h 后的6.04 quanta·s -1·ml -1。
3630 中 国 农 业 科 学 41卷
对照Rs91菌株在整个生长过程荧光素酶活性都低于
100 quanta·s -1·ml -1，
处于试验仪器要求的背景荧光强度允许的范围之内。
2.4 青枯雷尔氏菌Rs91-GFP 的稳定性检测
结果表明每隔12 h 连续移植20次后，菌体数量
变化差异不明显，在继代培养2次时，菌体数量为190
×106个/ml ，在移植培养8次后，菌体数量为181×
106个/ml ，
移植培养16次时，菌体数量178×106个/ml ，移植培养20次后，菌体数量达到209×106个/ml 。将
不同移植时间的菌液涂布于平板上培养观察绿色荧光
表达的情况时，发现在移植培养2次，8次甚至20次
后，所有菌落均保持着均匀并且强烈的绿色荧光，说
明标记基因在Rs91-GFP 中的稳定性很高，移植20次
后荧光稳定性仍然保持在100%（表1）。
图6 Rs91-GFP 的荧光素酶活性检测 Fig. 6 The luminometry activity during the fermentation of R. solanacearum strain Rs91-GFP 2.5 Rs91-GFP 的生长特性
表1 青枯雷尔氏菌Rs91-GFP 的稳定性
Table 1 Effect of R. solanacearum strain Rs91-GFP continuous transfer on the fluorescence stability
移植次数 Time for cultural transfer
2 8 12 16 20
培养时间 Culture time (h) 24 96 144 192 240 菌体数量 CFU(×106) 190 181 138 178 209 荧光强度 Luminescence intensity
+++ +++ +++ +++ +++ 发光菌体比例 Ratio of the luminescent bacteria (%)
100 100 100 100 100
+++：强；++：中；+：弱
+++: Strong; ++: Medium; +: Weak
2.5.1 Rs91-GFP 生长曲线的测定 Rs91和
Rs91-GFP 的生长动力学曲线如图7所示。在相同的培
养条件下，Rs91和Rs91-GFP 的生长曲线的变化趋势
基本相同。但是从生长速度上看，Rs91-GFP 明显滞后，
在初始培养的3 h 时，Rs91和Rs91-GFP 的OD 600分
别为0.129和0.121，二者基本相同；在生长5 h 后，
Rs91和Rs91-GFP 均进入对数生长期，其延续时间和
OD 600均有所不同，Rs91的对数生长期为5～15 h ，
OD 600为0.174～1.164；
Rs91-GFP 的对数生长期为5～19 h ，OD 600为0.139～0.171。
之后，Rs91和Rs91-GFP 均进入稳定生长期。
2.5.2 温度对Rs91-GFP 生长的影响 Rs91和
Rs91-GFP 在不同温度下的生长情况没有显著性差异
（P ＜0.01）。随着温度的升高，Rs91和Rs91-GFP 的
生长迅速加快，但是如果温度过高，生长就会变得缓
慢。培养温度为20℃时，Rs91和Rs91-GFP 生长缓慢，
其OD 600分别为0.414和0.459；培养温度为35℃时，
青枯雷尔氏菌Rs91和Rs91-GFP 生长迅速，其OD 600
图7 青枯雷尔氏菌Rs91-GFP 菌株的生长曲线 Fig. 7 The growth curve of the Rs91-GFP strain 分别为3.255和2.119；当培养温度提高为40℃时，Rs91和Rs91-GFP 的生长略有缓慢，其OD 600分别为2.238和2.129。总体看来，Rs91和Rs91-GFP 的最适宜培养温度为35℃。青枯雷尔氏菌进行gfp 基因转化后，不同生长温度对其生长的影响没有改变，与转化
11期车建美等：转绿色荧光蛋白基因的青枯雷尔氏菌生物学特性 3631
前一致（图8）。
图8 温度对青枯雷尔氏菌Rs91-GFP菌株生长的影响
Fig. 8 The effect of temperature on the growth of the R. solanacearum strain Rs91-GFP
2.5.3 初始pH对Rs91-GFP生长的影响 青枯雷尔氏菌Rs91和Rs91-GFP在初始pH下的生长情况没有显著性差异（P＜0.01）。随着培养初始pH的升高，Rs91和Rs91-GFP呈现先升高后降低的生长趋势。在pH为5.0时，Rs91的OD600为0.869，Rs91-GFP的OD600为0.999，二者的生长较为缓慢，当pH由偏酸变为中性时，二者的生长也加快，当pH为7.0时，达到最大，Rs91的OD600为1.353，Rs91-GFP的OD600为1.679；随着pH变为碱性，Rs91和Rs91-GFP的生长又逐渐变得缓慢，当pH为9.0时，Rs91的OD600为0.908，Rs91-GFP的OD600为1.152，二者生长速度不如pH 中性条件下的生长速度快。总的看来，青枯雷尔氏菌进行gfp基因转化前后，在中性的条件下生长最好（图9）。
图9 pH对Rs91-GFP生长的影响
Fig. 9 The effect of pH value on the growth of the R. solanacearum strains Rs91-GFP 2.6 Rs91-GFP菌株的定殖和侵染特性
2.6.1 温度对Rs91-GFP定殖的影响 不同温度下Rs91-GFP菌株对番茄组培苗整株的定殖见图10。在接种72 h后，番茄组培苗整株含菌量不同，当培养温度为19℃时，番茄组培苗整株中Rs91-GFP含量为65.92×104 cfu·g-1，当培养温度提高时，Rs91-GFP含量也随之提高，当培养温度为25℃时，Rs91-GFP含量为269.07×104 cfu·g-1，当培养温度为28℃时，Rs91-GFP含量达到最大值，为1 805.03×104 cfu·g-1，当培养温度继续升高，到31℃时，番茄组培苗整株中Rs91-GFP含量随着温度的升高，反而下降为586.3×104 cfu·g-1。因此，不同温度对番茄组培苗整株中Rs91-GFP含量具有不同的影响，在研究番茄组培苗中Rs91-GFP定殖的最佳培养温度为28℃。
图10 温度对青枯雷尔氏菌Rs91-GFP定殖的影响
Fig. 10 The effect of different temperatures on the infection of the R. solanacearum strain Rs91-GFP to the roots
of tomato plants
2.6.2 青枯雷尔氏菌Rs91-GFP在番茄组培苗体内转移路线的测定 在番茄组培苗培养9 h后，首先在根部出现青枯雷尔氏菌Rs91-GFP，菌体数量为0.75×105 cfu·g-1，在培养的12 h后，茎基部出现青枯雷尔氏菌Rs91-GFP，菌体数量为0.591×105 cfu·g-1，茎上部和叶部还没出现青枯雷尔氏菌Rs91-GFP；培养的15 h 后，青枯雷尔氏菌Rs91-GFP已经到达叶部，在叶片的菌体数量为0.262×105 cfu·g-1。在培养的18 h后，番茄组培苗的各部位均可检测到青枯雷尔氏菌Rs91- GFP，由此可见，Rs91-GFP在番茄组培苗的转移路线由番茄组培苗的根部开始，逐渐向顶部转移（表2）。
2.6.3 青枯雷尔氏菌Rs91-GFP对番茄组培苗致病性影响 gfp基因标记前后的青枯雷尔氏菌对番茄组培
3632 中国农业科学41卷
表2 青枯雷尔氏菌Rs91-GFP在番茄组培苗不同部位的含量
Table 2 The growth routes of the R. solanacearum strain Rs91-GFP in the tomato plants (×105 cfu·g-1)
培养时间Culture time (h)
9 12 15 18 21 24
根部Root 0.75 4.90 35.6 12.5 16.4 36.7
茎基部Base
stem 0 0.591 0.11 0.217 0.122 34.88
茎顶部Top
stem 0 0 0.596 0.067 0.238 0.412
叶片Leaf 0
0.262
0.553
3.25
2.85
苗的致病性无显著性差异（P＜0.01）。Rs91和Rs91-GFP侵染24 h后的死亡率分别为14%和12%；侵染48 h后的死亡率分别为35%和30%；侵染72 h 后的死亡率分别为65%和60%；在侵染92 h，死亡率均达到90%以上。从致病性上可以看出，gfp基因的标记并不会影响菌株的侵染能力（图11）。
图11 青枯雷尔氏菌Rs91-GFP菌株对番茄组培苗致病性影响
Fig. 11 The pathogenicity of the R. solanacearum strains of Rs91-GFP and Rs91
3 讨论
gfp基因和luxAB基因是目前应用较为广泛的两种标记基因[9,12~14]。应用gfp/luxAB双标记系统的优点是可以增强检测的特异性及灵敏度，虽然二者都是利用它们表达产物的荧光特性对标记物细胞进行检测，但二者的发光机制不同，GFP的发光不需要底物，而荧光素酶需要催化底物后才能发光，利用这个不同点将两个基因融合并在靶标细菌中表达后可以同时监测细胞总的数量及其能量状况[9]。目前未见采用gfp/luxAB双标记系统进行青枯雷尔氏菌的标记及相关研究的报道。
荧光素酶检测的最大优点是不损害监测对象，便于在整体水平或离体器官内测定基因产物是否表达[15]。De Weger等[16]将lux基因导入植物根瘤菌中，通过发光检测设备监测指示菌生成的光线，在线监测了细菌侵入植物的整个过程。本研究成功地采用luxAB标记了青枯雷尔氏菌，并对其荧光素酶活性进行了定时检测。结果表明在对数生长期，荧光素酶活性呈线性递增，到了稳定期，由于代谢能力下降导致荧光素酶活性逐渐降低。由于荧光素酶表达的检测不受活体材料的影响，因此，可以直接利用其监测标记菌株侵入植株的整个过程，为进行青枯雷尔氏菌的侵染过程的观察提供直观的检测工具。
李法峰等[17]用Tn5转座诱变粪产碱菌后，一株转化子由于Tn5转座片段的插入使该菌株以色氨酸为前体的IAA合成途径被阻断。因此，外源基因在目标菌株中的转化只是成功的第一步，而接下来对插入型标记菌株的形态特征、生长及生理特性进行研究是很有必要的。本研究中采用显微镜对标记前后两个菌株菌落及菌体形态的观察结果表明，标记菌株的菌体形态同野生型青枯雷尔氏菌的菌体相似。对两个菌株生长曲线的比较来看，外源基因整合到目标青枯雷尔氏菌的基因组后，由于外源基因的随机插入可能影响到细菌代谢过程所需的某些酶的正常表达，因而与出发菌株相比生长势有所减弱。这种由于外源基因插入而导致转化株生长滞后的现象在别的菌株中也有出现，如冯永君等[18]在比较水稻内生优势成团泛菌YSl9及其GFP标记的YSl9B：gfp菌株的生长后指出，与野生型菌株相比，标记菌株的代时延长了14%。
微生物的生命活动是由一系列生物化学反应组成的，而这些反应受环境因子如温度和pH的影响极为明显，因此温度和pH也是决定细菌发酵培养物质量的一个很重要的因素。更重要的是温度还可能影响绿色荧光蛋白在标记菌株中的表达[19]，本研究结果表明，外界基因的插入不会影响青枯雷尔氏菌培养的最
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适宜生长温度和最适宜pH范围，两个菌株最适生长温度均为30℃，最适pH为7.0，以上这些结果为标记菌株的发酵培养应用提供了重要的技术参数。
本研究中标记的青枯雷尔氏菌在0.1×TSB培养基非选择性培养基中每隔12 h连续移植20次后，还能检测到100%的GFP荧光细胞，这种GFP荧光的高度稳定性部分归功于GFP的晶体结构稳定性[20,9]。另外被广泛认同的观点是，与带有gfp基因的质粒型转化子相比，gfp通过转座载体整合到细菌染色体后的表达更稳定[21]。例如，Leff等[22]用带有gfp基因的重组质粒转化E. coli，并用这个质粒介导的gfp基因作为标记监测GEMs在水环境中的存活能力，发现质粒上携带的gfp基因在几天内就丢失了，而gfp基因插入Pseudomonas sp. 染色体后，GFP标记的菌株接种到土壤中13个月后还能检测到。
从1996年起，GFP标记系统被广泛应用于各种环境微生物研究中，如水环境[23]、土壤[21]、根际[24]、叶片[25]、生物被膜[26]等。一旦某个菌株被标记了gfp 基因，就可以很容易地通过绿色荧光这个表现型来监测这个菌群内表达gfp的细胞。最常用的检测方法是平板计数法，它只需在普通的近紫外光源照射下就可监测发绿色荧光的菌落数，这是一种实验室的常规方法，简单、直观而且成本低。本研究利用平板计数法观察了GFP标记的青枯雷尔氏菌在番茄组培苗内的定殖情况。研究结果表明，标记菌株在接种后的9 h 后在根部出现，12 h后茎基部出现青枯雷尔氏菌，茎上部和叶部还没出现青枯雷尔氏菌，15 h后青枯雷尔氏菌已经到达叶部，在以后的时间各部位都有青枯雷尔氏菌。周俊初等[27]通过激光共聚焦显微镜成功地观察并记录了gfp标记的根瘤菌在紫云英幼苗根部的定殖、感染及幼小根瘤与成熟根瘤不同层面中由gfp表达的绿色荧光。
近年来，随着遗传工程微生物（GEMs）在生物防治、促进植物生长和生物降解等农业及环保各个领域的广泛应用，GEMs在环境中释放后的安全性问题也日益受到重视。因为带有重组DNA的微生物经人为释放到环境中后，重组DNA有可能通过细菌间基因水平的交换进行不受控制的基因飘移，并可能产生不良后果，已有实验证实自然遗传转化可以在细菌间进行[28,29]。因此GFP标记系统不仅对农业或环境有益微生物的定殖活动、作用方式及作用机理的研究具有重要意义，而且还将成为GEMS在环境中释放后安全性研究的一种有效的手段。青枯雷尔氏菌绿色荧光蛋白标记的成功，将有助于研究青枯雷尔氏菌对活体植物的侵染机制，避免了传统分离方法的繁琐步骤，以及其它相似细菌的相互影响，同时还可以利用荧光与菌细胞成线性关系，建立菌体生物量的直观测定方法，并为研究青枯雷尔氏菌的致弱机理及生物防治奠定了基础。
4 结论
采用gfp基因标记了青枯雷尔氏菌（Rs91），标记后的菌株（Rs91-GFP）的菌体细胞形状与亲本菌株形状相同，均为长椭圆形，近杆状，整个细胞呈现绿色荧光。从Rs91-GFP菌株的基因组DNA中扩增出约3.0 kb的gfp基因片段。Rs91-GFP在的对数生长期，荧光素酶活性快速增加，到了稳定期，荧光素酶活性降低。Rs91-GFP的生长速度较Rs91缓慢。在无选择压力条件下连续移植20次，Rs91-GFP所有菌落都仍然保持均匀而且强烈的绿色荧光，荧光稳定性保持在100%。Rs91-GFP和Rs91在培养的最适温度、最佳pH值及生长曲线上基本一致。Rs91-GFP和Rs91在番茄组培苗内的侵染路线相同，致病力均达到90%以上。
致谢：本研究的大部分工作是在瑞典农业大学微生物系Janet K. Jansson教授实验室完成；感谢国家外专局和福建省外专局对作者工作给予的支持；感谢Janet K. Jasson 教授提供pUT gfplux（mini-Tn5）转座载体；深切感谢Janet K. Jasson教授及实验室的博士生及实验室管理员在瑞典期间给予本人的热心指导和试验所需要的大量仪器和试剂的无偿提供!
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