干细胞-骨髓间充质干细胞-局部注射骨髓间充质干细胞和曲安奈德治疗兔跟腱炎的效果对比
中国组织工程研究 第16卷 第14期 2012–04–01出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research April 1, 2012 Vol.16, No.14
ISSN 1673-8225 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
2505Department of
Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, Zhejiang Province, China
Qiu Chao ★, Studying for master’s degree, Physician, Department of
Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, Zhejiang Province, China hynh24@yahoo. https://www.360docs.net/doc/4612796746.html,
Corresponding author: Hong Jian-jun, Master, Chief physician,
Associate professor, Master’s supervisor, Department of
Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, Zhejiang Province, China hjjwz@https://www.360docs.net/doc/4612796746.html,
Received: 2011-12-16 Accepted: 2012-03-03
温州医学院附属
二院骨科，浙江省温州市 325000
裘超★，男，1980年生，浙江省绍兴市人，汉族，温州医学院在读硕士，医师，主要从事骨科创伤的研究。 hynh24@https://www.360docs.net/doc/4612796746.html,
通讯作者：洪建军，硕士，主任医师，副教授，硕士生导师。温州医学院附属二院骨科，浙江省温州市 325000
hjjwz@https://www.360docs.net/doc/4612796746.html,
中图分类号:R394.2 文献标识码:A
文章编号:1673-8225 (2012)14-02505-04
收稿日期：2011-12-16 修回日期：2012-03-03 (20111216010/WJ ·S)
局部注射骨髓间充质干细胞和曲安奈德治疗兔跟腱炎的效果对比★
裘 超，洪建军，毛诚晃，卢晓郎
Local injection of bone marrow mesenchymal stem cells versus triamcinolone acetonide for treatment of Achilles tendinitis in rabbits
Qiu Chao, Hong Jian-jun, Mao Cheng-huang, Lu Xiao-lang Abstract
BACKGROUND: It remains to be disputed to apply long-lasting glucocorticoid for partial closure theray of Achilles tendonitis.
OBJECTIVE: Bone marrow mesenchymal stem cells and long-lasting triamcinolone acetonide were respectively injected into the achilles tendon of a rabbit model of Achilles tendonitis to dynamically observe related indices and investigate the effects of bone marrow mesenchymal stem cells and long-lasting triamcinolone acetonide on tissue structure and mechanical performance of Achilles tendon with tendonitis.
METHODS: Sixty rabbit models of unilateral Achilles tendinitis were randomly divided into four groups. Two groups were locally administered bone marrow mesenchymal stem cells and triamcinolone acetonide respectively once, and the remaining two
groups were locally administered bone marrow mesenchymal stem cells and glucocortocoid respectively twice with a time interval of 2 weeks.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with triamcinolone acetonide once group, rabbits in the bone marrow mesenchymal stem cells once or twice groups, rabbits exhibited regular, dense tendon bundles, increased fibroblasts, increased hydroxyproline content in the tendon tissue and increased maximum load strength of tendon (P < 0.05), in particular twice injections (P < 0.05). These findings suggest that local repeated injections of bone marrow mesenchymal stem cells exhibit better therapeutic effects than long-lasting triamcinolone acetonide application in treatment of Achilles tendinitis.
Qiu C, Hong JJ, Mao CH, Lu XL. Local injection of bone marrow mesenchymal stem cells versus triamcinolone acetonide for treatment of Achilles tendinitis in rabbits.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(14): 2505-2508. [https://www.360docs.net/doc/4612796746.html, https://www.360docs.net/doc/4612796746.html,]
摘要
背景：应用长效糖皮质激素局部封闭治疗跟腱炎在学术界一直很有争议。
目的：对跟腱炎模型兔跟腱局部分别注射兔骨髓间充质干细胞和长效糖皮质激素曲安奈德，动态观察相关指标，观察骨髓间充质干细胞和曲安奈德对跟腱炎的组织结构和力学性能的影响。
方法：将60只单侧跟腱炎新西兰大白兔模型随机等分4组，取其中2组分别于患侧跟腱局部注射骨髓间充质干细胞和曲安奈德1次；剩余2组则分别注射2次，注射间隔2周。
结果与结论：相比1次曲安奈德组，局部注射骨髓间充质干细胞1次和2次的跟腱炎模型兔跟腱腱束整齐、致密，断裂少，成纤维细胞增多，跟腱组织羟脯氨酸含量、跟腱最大负荷拉力均增加(P < 0.05)，2次注射的治疗效果更明显(P < 0.05)。说明局部重复注射骨髓间充质干细胞移植治疗跟腱炎的效果优于长效糖皮质激素曲安奈德。
关键词：跟腱炎；动物模型；骨髓间充质干细胞；曲安奈德；局部注射；兔 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.14.007
裘超，洪建军，毛诚晃，卢晓郎. 局部注射骨髓间充质干细胞和曲安奈德治疗兔跟腱炎的效果对比[J].中国组织工程研究，2012，16(14):2505-2508. [https://www.360docs.net/doc/4612796746.html, https://www.360docs.net/doc/4612796746.html,]
0 引言
近年来，跟腱的运动性损害呈逐步上升的
趋势[1]，目前对于跟腱炎没有统一的治疗策 略[2-3]，常用的非手术治疗方法之一是跟腱局部注射长效糖皮质激素(如曲安奈德)[4]，不过有研究认为注射疗效并不确切[5]，反而会加重跟腱炎发展，甚至易使跟腱断裂。骨髓间充质干细胞是细胞治疗和基因治疗的理想靶细胞[6]
，在组织损伤修复中有着广阔的应用前景[7]。目前骨髓间充质干细胞越来越多被移植治疗临床
疾病，如相关文献报道骨髓间充质干细胞局部移植治疗急性肝衰竭[8]，骨髓间充质干细胞局部移植治疗糖尿病足[9]。骨髓间充质干细胞也具有分化为肌腱细胞的潜能
[10]
，如果将间充质干
细胞注射到跟腱部位，是否能分化为肌腱细
胞，起到治疗跟腱炎作用，目前鲜有相关文献报道。
本次实验通过对跟腱炎动物模型局部分别注射骨髓间充质干细胞和曲安奈德，进行一系列指标动态观察、比较和统计学分析，旨在探讨2种治疗对跟腱的组织结构及力学性能的影响。
裘超，等. 局部注射骨髓间充质干细胞和曲安奈德治疗兔跟腱炎的效果对比
P .O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.360docs.net/doc/4612796746.html,
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1 材料和方法
设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2010-06/2011-07在温州医学院动物实验中心完成。
材料：
实验动物：健康6~8月龄新西兰大白兔跟腱炎模型60
只，雌雄不限，体质量3.0~3.2 kg ，由温州医学院动物实验中心制作提供，动物许可证号：医动字22-03001，兔均为左下肢跟腱炎，右下肢健康。实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》[11]。
试剂及仪器：
方法：
骨髓间充质干细胞的分离和鉴定：抽取同一批次健康
新西兰大白兔的骨髓，并进行骨髓间充质干细胞的分离、培养、扩增、收集。通过检测抗原表达情况和多向分化潜能来逆向推断是否为骨髓间充质干细胞。
将收集的细胞经流式细胞仪检测：90%以上的细胞表达CD29，不表达造血细胞标记CD34和CD45，说明分离培养获得的骨髓间充质干细胞纯度较高。
通过观察该骨髓间充质干细胞是否具有多向分化能力来进行鉴定：采用地塞米松、β-磷酸甘油、抗坏血酸磷酸盐联合诱导培养的骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，碱性磷酸酶染色阳性，证实其可以分化为成骨细胞。用为含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM ，0.25 μmol/L 地塞米松，50 μmol/L 吲哚美辛，0.5 mmol/L IBMX ，质量浓度10 mg/L 牛胰岛素的培养基诱导骨髓间充质干细胞 向脂肪细胞分化，油红染色阳性，证实其可以分化为脂肪细胞。
综上所述：证实所得细胞是骨髓中造血干细胞以外的一群处于未分化状态的非定向干细胞，即骨髓间充质干细胞，纯度为1×1010 L -1。
跟腱炎兔模型的建立及分组：将新西兰大白兔跟腱炎
模型60只，随机等分成4组。随机取2组，对其中1组兔以患侧跟腱止点上1 cm 处作为进针点，注射上述方法分离纯化的骨髓间充质干细胞0.25 mL(1×1010 L -1)1次，注入跟腱内及跟腱周围，设为1次干细胞组，另1组以相同
部位进针注射曲安奈德3 mg 1次，设为1次曲安奈德组，于注射后2周观察各项数据。取剩余2组中的1组，以上述方法注射相同剂量的骨髓间充质干细胞共2次，设为2次干细胞组，间隔时间为2周，另1组则同部位同法注射曲安奈德3 mg 共2次，设为2次曲安奈德组。分别于末次注射后2周观察步态并处死动物后取材。观察各组兔力量和活动频次的异同、兔患侧与健侧跟腱水肿度，光泽感，弹韧性变化。
标本的制备：采用麻醉后注射空气法处死兔，俯卧
位固定，常规消毒铺巾，取跟腱外侧旁正中切口切开皮肤、皮下、显露肌腱、游离并切取跟腱组织长约 10 cm 。
组织病理学观察：显微镜下观察干细胞组与曲安奈德
组试验兔患侧与健侧跟腱组织苏木精-伊红染色切片中细胞数量、排列、分布及胶原纤维排列等。
跟腱羟脯氨酸含量测定：将试验兔患侧跟腱组织研磨、
匀浆、稀释为2%的组织匀浆，严格按羟脯氨酸检测试剂盒说明操作，于721型分光光度计550 nm 波长处 (1 cm 光径，蒸馏水调零)测定其吸光度值，按试剂盒中说明计算组织匀浆羟脯氨酸中含量。
生物力学试验：取各组兔患侧跟腱标本，将跟腱上下
2端各固定于生物力学机上，开启生物力学机，使其线性增加拉力，记录跟腱断裂时所施加的最大拉力。
主要观察指标：各组兔跟腱组织的苏木精-伊红染色切片；患侧跟腱的羟脯氨酸含量；患侧跟腱的最大负荷拉力。
统计学分析：计量资料用x _
±s 表示,统计学软件使用SPSS 10.0软件包，所有数据进行正态性检验符合正态分布，组间均数差异比较采用配对样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 实验动物数量分析 实验兔60只均进入结果分析，无死亡和感染，无脱落。
2.2 实验兔步态观察 1次曲安奈德组兔注射后力量和活动频次改善较1次干细胞组兔明显，其后随着注射次数增多，2次曲安奈德组兔力量和活动频次改善不明显，甚至变差；2次干细胞组兔随着注射次数增多，力量和活动频次日趋改善。
2.3 兔跟腱标本外观 1次干细胞组兔患侧跟腱标本与1次曲安奈德组相似，均较健侧跟腱标本水肿、光泽差、弹韧性差；但2次干细组兔患侧跟腱标本与2次曲安奈德组相比，水肿明显减轻、光泽增加、弹韧性加强，较1次干细胞组标本外观改善。
2.4 兔跟腱组织病理学变化 图1组织病理切片示1次干细胞组的患侧跟腱与1次曲安奈德组的相比，其腱束
试剂及仪器 来源
醋酸曲安奈德
胎牛血清
羟脯氨酸检测试剂盒 FACS 流式细胞仪
生物显微镜
生物力学试验机
浙江新和成制药厂
Hyclon 公司
南京建成生物工程
美国Becton-Dickinson 公司 日本奥林巴斯
SHORE-WESTERN 美国
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更整齐、致密，断裂少，成纤维细胞增多；随着注射次数的增加，干细胞组跟腱腱束以上指标均增多，而曲安奈德组则呈反向变化。
2.5 兔跟腱羟脯氨酸含量的变化 1次干细胞组的羟脯氨酸含量高于1次曲安奈德组(P < 0.05)；2次干细胞组的羟脯氨酸含量要高于1次干细胞组和1次曲安奈德组(P < 0.05)。2次曲安奈德组的羟脯氨酸含量低于1次曲安奈德组(P < 0.05)，见表1。
2.6 兔跟腱最大负荷拉力变化 1次干细胞组的最大
负荷拉力大于1次曲安奈德组(P < 0.05)；2次干细胞组的最大负荷拉力大于1次干细胞组和1次曲安奈德组 (P < 0.05)。2次曲安奈德组的最大负荷拉力小于1次曲安奈德组(P < 0.05)，见表2。
3 讨论
本次实验各项观察指标检测结果提示：骨髓间充质干细胞局部注射移植治疗跟腱炎，能促进跟腱愈合；长效糖皮质激素大量多次局部注射对跟腱炎治疗无效，甚至加重病情。实验将骨髓间充质干细胞和曲安奈德分别注射入兔跟腱炎模型患侧跟腱，动态观察一系列实验指标，发现1次曲安奈德组兔注射后患肢力量和活动频次改善较1次干细胞组明显，其后随着注射次数增多，2次曲安奈德组兔步态改善不明显，甚至变差；2次干细胞组兔则步态改善明显。观察比较两组实验动物跟腱大体标本外观及组织病理学切片发现，随着干细胞注射次数增加，2次干细胞组兔的患侧跟腱较1次干细胞组在大体外观上水肿减轻，光泽增加，弹韧性加强；在组织病理切片示腱束变整齐，断裂减少，成纤维细胞增多。随着曲安奈德注射次数增加，2次曲安奈德组兔的患侧跟腱较1次曲安奈德组在以上2项观察指标呈反向变化。
胶原的合成代谢状况可反应跟腱的重建程度，羟脯氨酸在胶原纤维的代谢中起到重要的作用，其含量可代表胶原的合成量，且羟脯氨酸在胶原纤维中所占比例相对恒定，因此测定羟脯氨酸含量可直接反映胶原的含量。本次实验通过测定兔跟腱组织匀浆中跟腱羟脯氨酸含量，发现随着骨髓间充质干细胞注射次数增加，羟脯氨酸含量增多，注射曲安奈德则相反，而且各实验组之间羟脯氨酸含量差异均有显著性意义。取患侧跟腱标本做最高负荷拉力试验，发现随着骨髓间充质干细胞注射次数增加，跟腱最高负荷拉力递增，而注射曲安奈德则相反，而且各实验组之间的跟腱最高负荷拉力大小差异均有显著性意义。上述所有指标反映出骨髓间充质干细胞局部移植入试验动物患侧跟腱能促使腱内成纤维细
Figure 1 Histological sections of rabbit tendons from bone marrow mesenchymal stem cells group and
triamcinolone acetonide group (hematoxylin-eosin staining, x100) 图1 不同时期的骨髓间充质干细胞组和曲安奈德组兔跟腱
的组织学切片(苏木精-伊红染色，×100)
a: Normal Achilles tendon b: BMSCs first injection
c: BMSCs second injection d: Tendon with achilles tendinitis
e: Triamcinolone acetonide first injection
f: Triamcinolone acetonide second injection
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胞增加，胶原纤维生成增多，腱束变致密，排列整齐，跟腱干变粗，跟腱的最大负荷拉力提高，实验动物患肢力量和活动频次明显好转；长效糖皮质激素(如曲安奈德)局部注射虽能早期缓解患侧跟腱的疼痛和肿胀等症状，但随着注射次数、剂量增加，其他观察指标均呈恶化趋势。
综上所述：骨髓间充质干细胞局部移植能促使病损跟腱组织加快修复，减少康复时间，提高跟腱的最高负荷拉力，增加跟腱的抗拉性，减少激烈运动时自发性跟腱断裂的发生。因此，骨髓间充质干细胞局部移植治疗兔跟腱炎模型有效，干细胞移植入跟腱后，能在跟腱内转化为腱细胞，从而起到治疗作用，这为临床治疗跟腱炎开辟新的思路，并奠定动物实验基础。长效糖皮质激素局部封闭治疗跟腱炎疗效如何，争议很大，依据本次实验得出结论：长效糖皮质激素虽能早期缓解疼痛和肿胀症状，但同时也增加了对跟腱损害，反复注射使跟腱胶原纤维进行性减少，腱束变稀疏、紊乱，最终导致跟腱的力学性质降低，断裂风险增大，所以对于长效糖皮质激素局部封闭疗法应少用、慎用。
本文由于条件限制，在移植入骨髓间充质干细胞后的细胞标记，植入后跟踪检测，及干细胞如何在体内诱导分化为腱细胞等方面还有待于做进一步探讨和深入的研究。因长效糖皮质激素对跟腱的影响机制目前仍不明了，本次实验无法从机制层面对长效糖皮质激素治疗跟腱炎做进一步探讨。
致谢：感谢温州医学院动物实验中心的张磊老师在
模型制作上给予的很大帮助，感谢温州医学院分子生物学教研室的许芳老师在设备使用和试剂采购上给予的帮助。
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骨髓间充质干细胞研究进展(一)
骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展，但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞，BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells，HSC)之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast，。又由于它们来自骨髓的支持结构，并作为滋养层支持造血干细胞的生长，因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells，BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同，主要表现为梭形、纺锤形，少数为多角形。目前，BMSCs的分离方法主要有以下几种：(1)全骨髓培养，是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养，原代培养培养物以造血细胞成分居多，为利于BMSCs的贴壁生长，可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高，胎牛血清终浓度为10％～20％，有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除，对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代，3～4天换液一次〔1〕；(2)离心培养法，是根据骨髓中细胞成分比重的不同，采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500～2000r／min离心20～30min，采集交界处的单核细胞层，PBS洗涤2～3次后，加入培养液接种培养；(3)细胞表面分子标记分选法，主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素：(1)血清：血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用，不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大，常用1０%～20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度：BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关，一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制，或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子：一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属：一般认为BMSCs的生长特性相似，但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中，一般情况下，移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4～7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后，如果可以引起T细胞的免疫反应，则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应，而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后，这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外，使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后，间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在，表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外，除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外，实验也表明，随着干细胞的分化，其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之，间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells，AS)，在一
间充质干细胞分离与培养
文章编号:100025404(2001)0520553203论著 骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民 (第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提 要:目的 摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法 采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果 以选用4～24h贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ml的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4d进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论 建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 中图法分类号:R329.2文献标识码:A Cultivation and isolation of the bone marrow mesenchymal stem cells AI G uo2ping,S U Y ong2ping,Y AN G uo2he,RAN X ing2ze,LI U X iao2hong,LUO Cheng2ji,CHE NG T ian2min(Department of Radiation M edicine, Institute of C ombined Injury of P LA,Third M ilitary M edical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o observe s ome biological features of bone marrow mesenchymal stem cells and explore the best conditions for is olating and culturing in vitro.Methods C omm on cell culture technique,light and electron microscopy were used to study the effects of the growth,prolif2 eration,m orphology of the bone marrow mesenchymal stem cells in different adherent time,concentration of serum and cell density.Re sults The best culture condition in vitro for growth was4-24hours adherent time,5%-10%fetal bovine serum,(4-8)×104/ml cell density.The cells were spindle in shape and had a strong ability of proliferation.The time for cell duplication was3to4days.The cells showed the characteristics of stem cells in electron microscope.Conclusion The best condition for is olation and culture of bone marrow mesemchymal stem cells was success fully established and s ome biological features were obserred.It found a base for further investigation and using of mesenchymal stem cells. K ey w ords:mesenchymal stem cell;tissue engineering 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Mes2 enchymal stem cell,MSC),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道MSC在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1 材料与方法 1.1 骨髓MSC的分离 从胸骨无菌抽取约1～2ml的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ml,混匀,1200r/min,离心10min;弃上清,用0.01 基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(“973”项目)(G1999054205) 作者简介:艾国平(1969-),女,四川省隆昌县人,博士研究生,讲师,主要从事组织工程学方面的研究,发表论文6篇。电话:(023)68752355 收稿日期:2001201226;修回日期:2001203218m ol/L的P BS(pH7.2)洗2～3次,1200r/min,各离心10min;计数,以2×109/ml种入10%F BSα2ME M培养基,青霉素100U/ ml、链霉素100μg/ml,37℃,5%C O2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01m ol/L P BS(pH7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%F BSα2ME M培养基。 1.2 不同贴壁时间对MSC增殖的影响 选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72h的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3 不同浓度胎牛血清(F BS)对MSC生长的影响 细胞按4×104/ml种入96孔培养板中,分别加入以下F BS 浓度的α2ME M培养基:0%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48h后,加入20μl MTT (5mg/ml二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4h;尽量吸掉上清液,加入150μl二甲基亚砜,室温振荡10min,HT27000plus多孔读数仪490nm处读取D490值,以培养液作空白对照。 1.4 比较不同种植密度对MSC生长的影响 用含10%F BS的α2ME M培养基;细胞按以下密度(×104/ ml):0.3、0.6、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48h后,按上述方法测其D490值。 1.5 培养细胞生长曲线 细胞按0.5×104/ml种入24孔培养板,每孔培养液为1ml,每天取3孔测其D490值,连续测8d,绘出培养细胞生长曲线。 355 第23卷第5期2001年5月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE Vol.23,N o.5 May.2001
人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养
万方数据
ＩＳＳＮ１６７３—８２２５ＣＮ２１．１５３９／Ｒ赵凌云，等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养ｗｗＭ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ０引言 骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，取材方便，易于体外扩增，可进行自体移植，而不存在组织配型和免疫排斥的问题，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。 １材料和方法 设计：开放性实验。 单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科。 材料：实验于２００６—０２／１２在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者，对本实验均知情同意。基础培养液由含体积分数为０．１５胎牛血清和低糖仪一ＭＥＭ配置。低糖ｄ－ＭＥＭ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；淋巴细胞分离液（密度１．０７７ｇ／ｍＬ，上海试剂二厂生产）；胰蛋白酶，胎牛血清（Ｇｉｂｉｃｏ）；Ｃ０２培养箱（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦ９０）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦｓａｆｅ一１２００／ｃ）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；离心机（ＪＯＵＡＮＢ４ｉ多功能台式机）。 设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二、三作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。 方法： 骨髓间充质干细胞的分离及传代培养：在无菌条件下，以含５ｍＬ肝素钠生理盐水的２０ｍＬ注射器，于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织６ｍＬ，移入含５ｍＬ肝素钠生理盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含１０ｍＬ淋巴细胞分离液的离心管中，２０００ｒ，ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心吸取界面层细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液洗２次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，加入基础培养液，血细胞计数板计数，调整细胞的浓度，将细胞悬液按１０９—１０１０Ｌ－１接种于培养瓶，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２饱和湿度孵箱中培养。于培养后的两三天更换培养液，并用Ｄ－Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗２次，以去除未贴壁的造血细胞，以后每３ｄ换液一次，进一步去除未贴壁的细胞。观察细胞生长情况，待细胞融合成片、长满培养瓶底部后，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶流过所有细胞表面，盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现细胞变圆，部分脱壁，控制消化时间不超过３ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ有血清培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域，吹打过程中不要用力，结束后再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适 ５６５０量培养液计数，分别接种在新的培养瓶内。 骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养。以细胞数为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。 骨髓间充质干细胞贴壁率的测定：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养，每隔２ｈ进行细胞贴壁率检测。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的生长曲线。③骨髓间充质干细胞的贴壁率。 统计学分析：由第一作者采用ＥＳＡ４．０软件进行统计处理，数据以娃ｓ表示。 ２结果 ２．１骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下，骨髓间充质干细胞接种１ｄ即贴壁，２ｄ时贴壁细胞较多。经冲洗和换液去除悬浮细胞后，贴壁细胞继续培养３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（图１）。至１４ｄ细胞密集在集落中心，基本铺满瓶底，第３～５代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状（图２）。 图１原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（倒置显微镜，ｘ２０） ２．２骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后３ｄ内处于潜伏期，３ｄ后进入生长期，７ｄ后进入平台期。第３代骨髓间充质干细胞生长曲线见图３。 Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００。Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ 万方数据
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
_骨髓间充质干细胞在骨科中的应用
第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要：骨髓间充质干细胞（BMSC）是一种来自中胚层发育的早期干细胞，具有多向分化潜能的特性，可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词：骨髓间充质干细胞；骨科学；文献综述 doi：10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号：1672-2779（2011）-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞，①造血干细胞，它为循环血液提供前体细胞；②非造血性干细胞，它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞，在调节造血干细胞的长期存活，生长分化中起重要作用。早期分离培养时，发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入，人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用，又因其来自于骨髓基质，因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下，有向中胚层组织细胞分化的能力，又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明，在不同诱导条件下，BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中，通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导，能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长，将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位，3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示，植入物的结构与正常骨膜相似，并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养，培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明，在单层诱导培养条件下，人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年，Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等，结果成功地诱导出脂肪细胞，细胞内聚集脂滴，并表达过氧化物酶体增殖物激活受体，脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下，约95%的细胞向此系分化，细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞，这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目：广西壮族自治区科技厅自然基金[No：2010GXNSFA013223] 作者单位：1 广西中医学院附属瑞康医院骨科（南宁530011） 2 南方医科大学在读博士（南宁530011） *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少，仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%～0.01%，并随年龄的增加而减少，因此，必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种：①密度梯度离心法：主要根据骨髓中细胞成分的比重不同，清除红细胞，分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液（1.073 g/ml）和Ficoll 液（1.077 g/ml）进行密度梯度离心。值得注意的是，不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀，纯度较高，Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%，第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法：即全骨髓法，是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性，通过定期换液除去不贴壁细胞，收集贴壁生长BMSC，其纯度可达95%。目前多用这两种方法，细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法，更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止，BMSC的表面抗原具有非专一性，它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括：①粘附分子，如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体，如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员，包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它，如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志，如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等，也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外，BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子，但除细胞因子是持续性产生外，其它的仅仅在受到刺激后表达，BMSC还能产生一系列的基质分子，包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖，还能表达基质2细胞，细胞2细胞等相互作用的反受体，其中特别有关的是对CD44强表达，CD44是多种配体的受体，其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法，BMSC具有独特的代谢特点，几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性，酸
人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析
[基金项目]广东省科技计划项目资助(2002A3020206)。?论著? 人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析 陈建锋1,高 毅2,潘明新2 (1中国人民解放军第401医院,山东青岛266071;2南方医科大学珠江医院) [摘要] 目的 对人骨髓间充质干细胞(HM SCs)的生物学特性进行初步分析,为其临床应用奠定基础。方法 抽取4例健康人髋骨内骨髓5～20m l,密度梯度离心法分离HM SCs。体外培养扩增后流式细胞仪检测HM-SCs表面标记物;M M T法绘制生长曲线,计算细胞倍增时间;吉姆萨染色法检测细胞核型。结果 HM SCs表面标记物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HL A-A BC、U EA-1阳性表达;CD34、CD45、HLA-DR阴性表达;生长曲线呈S 形,细胞倍增时间随代次增加而延长;核型分析显示第3、6代HM SCs的染色体数目未发生改变。结论 密度梯度离心法可得到纯度较高的HM SCs,表可达人类间充质干细胞的表型特征。HM SCs可在体外较长时期培养。在第7代之前细胞增殖旺盛,之后细胞增殖能力逐渐下降;在第6代之前染色体数目未发生改变。 [关键词] 人;骨髓;间充质干细胞;细胞培养 [中图分类号] R329.2+7 [文献标识码] A [文章编号] 1002-266X(2006)29-0001-03 Isolati o n an d cu ltivati o n of hu man bone marrow mesen chym al stem cells in vitro an d analysis of th ei r biological characterization s CH EN J ian-f eng,GA O Y i,PA N M ing-x in (401H osp ital of PL A,Qingdao266071,P.R.China) Abstract:[Objective]T o establish a sim ple and feasible method t o culture and pr olifer ate human bone marro w der ived mesenchy mal stem cells(HM SCs)in v itro and analyze t heir biological characterizations.[M ethods]HM SCs w er e isolated by combining gradient density centrifug ation w ith plastic adherence.T he g row th curves o f HM SCs w er e dr aw n by M T T assay,cell phenoty pes wer e detected by flow cyt ometry,cell doubling time was caculated,and cell kar yoty pes wer e measur ed by Giemsa staining.[Results]T he posit ive ex pr essio n of cell pheno type of HM SCs includes CD29,CD44,CD71,CD105,CD166,HL A-A BC,U EA-1,w hile the neg ative expression of cell phenoty pe in-cludes CD34,CD45,HL A-DR.T he g row th curve of HM SCs w as“S”shaped.T he cell doubling time pro longed w ith the passag es increased.T he chr omosome number of HM SCs of passage3and6were both46,same as human be-ings.[Conclusion]HM SCs of higher purity can be isolated by combining gr adient density centrifug ation with plastic adher ence,and maintain cell pheno types as human beings.T he pr olifer ation ability of HM SCs is strong before pas-sag e7,but decreases r apidly later.T he chr omosome number of HM SCs remains orig inal befo re passage6. Key words:human;bone mar row;m esenchymal stem cell;cell culture 骨髓组织可分为造血和基质两大系统。骨髓基质细胞是来源于骨髓基质的一种间充质细胞,在空间上起支持作用,在造血方面起精细的调节作用。体外获得足够的基质细胞是进行各项研究的基础。2004～2005年,我们对人骨髓间充质干细胞(HM SCs)进行了体外培养扩增,并对其表型、生长曲线、核型等生物学特性进行了初步分析。现报告如下。 1 材料与方法1.1 HM SCs的获取及培养 采集4例无血液疾病志愿者髂骨内骨髓5～20ml。5m l骨髓标本中加入5 ml的PBS,900g离心10min2次,以PBS制成4×107细胞数的悬液,取5m l加到5ml Percoll分离液(1.073g/ml)上,900g离心30min,吸取富含有核细胞的中间细胞层。将获取的单个核细胞加2倍量的PBS,900g离心5min,弃上清,以1×106/ml的密度接种于50ml培养瓶中,加入HM SCs完全培养基10 ml。待贴壁细胞达到80%～90%融合后,以1÷3的比例传代培养。 1.2 HM SCs表型鉴定 取传至第3～6代HM SCs, 1 山东医药2006年第46卷第29期
大鼠的骨髓间充质干细胞提取
大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步，SD大鼠麻醉处死，75%乙醇皮肤消毒，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中。 心得体会：①鼠龄4周，重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了，骨髓都分化的太厉害，没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行，但是雌的比较厉害，咬人。Wistar 大鼠行不行，也行，但是就品种而言，SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起，腹腔麻醉，保证30秒老鼠躺倒，安乐死。如果你水平够高，可以直接用注射器抽取心脏内的血液，可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行，但老鼠太小，前肢更小，如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中（也可以用培养皿），管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了，青链霉素的浓度为500U／ml，这样是区别于生长液中青链霉素浓度，组织抑菌是200-500U／ml，生长液抑菌是20-100U／ml。就当初步的消毒吧！ ④整个手术过程要快，一般控制在20分钟之内，时间长了，骨髓会凝，不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝，可以叫上研究脂肪的，嗅鞘的，心肌的其他人员一起来，把剩下不要的老鼠尸体给别人，做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了，具体根据个人经验而言。 第二步，⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台，倒掉PBS后，再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液，用针头插到骨头的一端冲洗，然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm 培养皿中（皿最好倾斜45度），冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头，反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中，大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会： ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取，放到一次性培养皿的皿盖上，皿是用来承装细胞悬液的，这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中，所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了，甚至更少，如果不够5ml，可以加至5ml，这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准，基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留，方便去除的，相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞，当然这个过程要轻柔，避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的，因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失，临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用，但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液（含有glutamine的，Gibco公司的，500ml一瓶，大约60元）浓度90%，5ml细胞生长液中大约需要4.5ml
骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性的研究进展.
骨髓间充质干细胞分离培养和生物学特性的研究进展 邴爱英宋文刚 (泰山医学院 , 山东泰安 271016 关键词 :骨髓间充质干细胞 ; 分离培养 ; 生物学特性 中图分类号 :R392文献标识码 :A 文章编号 :1004-7115(2011 07-0549-04 骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells , BMSCs 亦称骨髓基质干细胞 (bone mar-row stromal cells , BMSCs , 是主要存在于机体骨髓腔中的一种干细胞 , 在一定的诱导条件下 , 可分化为多种胚层细胞 [1－2], 更重要的是骨髓间充质干细胞具有较强的免疫调节功能 , 进行异体移植时可避免免疫排斥反应 [3], 故对骨髓间充质干细胞的研究越来越受到广泛的关注。 20世纪 70年代中期 , Friedenstein 等首次报道 , 骨髓标本中小部分贴壁细胞在培养过程中能够分化形成类似骨、软骨的集落 , 并将之称为骨髓多能间充质干细胞 (marrow pluripotent stromal cells , 又称 BMSCs 。 1997年 , Prockop 成功分离出BMSCs , 发现其具有多向分化潜能 , 可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经样细胞和成肌细胞等。近年来 , 人们在研究中建立了人、猴、兔、大鼠等不同种属 BMSCs 的培养体系 , 其取材部位及方式等各有不同。 1骨髓间充质干细胞的分离与培养 BMSCS 的含量很低 , 约占骨髓有核细胞的 0. 001% 0. 010%左右 , 并且随着年龄增长递减 , 要利用 BMSCS 就必须实现 BMSCS 的体外分离培养和扩增。目前对骨髓间充质干细胞的分离、纯化、培养还没有统一的方法 , 现在较为常用的分离方法主要有 :贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪和免疫磁珠分离法。前两种方法获得的骨髓间充质干细胞成分复杂 , 纯度不够高。而用流式细胞仪和免疫磁珠分离技术虽然可获得高纯度的骨髓间充质干细胞 , 但对细胞活性和分化能力有较大影响 , 而且实验条件要求高 , 需要骨髓量较大。目前最