几种松科植物基因组总DNA的提取
西北植物学报Κ2004Κ24;3ΓΠ523—526
A cta
B ot.B orea l.-O cciden t.S in.
文章编号Π100024025;2004Γ0320523204
几种松科植物基因组总D NA的提取Ξ
胡雅琴1Κ肖娅萍13Κ王孝安1Κ白晓波1Κ傅志军2
;1陕西师范大学生命科学学院Κ西安710062Μ2宝鸡文理学院Κ陕西宝鸡721000Γ
摘 要Π采用CTAB法和蛋白酶K法Κ提取校园内几种松科植物新梢、种子及幼叶的总DNAΚ经琼脂糖凝胶电泳检测Κ无降解发生Λ利用PCR2SSCP初步分析了这几种针叶树的叶绿体m atK基因Κ结果表明Π提取的总DNA可以进行PCR2SSCP分析Λ
关键词ΠDNA提取ΜPCR2SSCPΜ针叶树
中图分类号ΠQ946.33 文献标识码ΠA
Isola tion of tota l D NA from P i naceae plan ts
HU Ya2qin1ΚX I AO Ya2p ing13ΚW AN G X iao2an1ΚBA I X iao2bo1ΚFU Zh i2jun2 ;1Co llege of L ife ScienceΚShaanxiN o rm al U niversityΚX iπan710062ΚCh inaΜ2Bao jiU niversity of A rts and ScienceΚBao jiΚShaanxi
721000ΚCh inaΓ
AbstractΠW e ex tracted genom ic DNA from several sp ecieπs leafΚseed and b ranch of P inaceae by m ethods of CTAB and P ro teinase K.T he ob tained DNA w as assayed by agaro se gel electrop ho resis.T he resu lt show ed that the ex tracted to tal DNA hadnπt degradated.T he ch lo rop h lase gene m atK and a fracti on w ith in th is gene w ere analyzed by PCR2SSCP.T he resu lt indicated that the iso lated to tal DNA w as ready fo r u sing in PCR2SSCP.
Key wordsΠiso lati on of to tal DNAΜPCR2SSCPΜcon ifer
随着分子生物学的发展ΚDNA分子水平上进行的遗传分析愈来愈受到生物工作者的重视Κ此类分析大都从DNA提取开始Κ因此得到高纯度、高产率的基因组总DNA是分子生物学实验关键的第一步Λ
目前Κ提取植物基因组总DNA常用方法有ΠCTAB法、蛋白酶K法、SD S法等Λ不同的植物Κ提取的方法各异Κ如邹喻苹等[1]用低pH介质、高盐沉淀蛋白质的方法成功的从银杉、南川升麻等植物中提取和部分纯化了细胞总DNAΜ刘小勇等[2]用SD S2CTAB改进法简便快速地提取了地衣、蜜环菌、泡桐丛枝等的基因组总DNAΛ对于同一植物Κ选用不同的部位提取的效果不同[3]Λ在针叶树中Κ用于总DNA提取的材料主要是种子和针叶Κ也有报道用尚未木质化的新梢作为提取材料[4]Κ采用的方法主要是SD S法和CTAB法Λ
SSCP;single stranded confo rm ati on po lym o r2 p h is mΓ单链构型多型性是20世纪90年代发展起来的用于遗传分析的方法Λ它的基本程序为Π将扩增得到的双链DNA高温解链后快速冷却Κ在非变性条件下使单链DNA在底温下由于碱基的部分互补发生自身折叠Κ形成具有一定空间结构的构象Λ这种构象由DNA单链碱基决定Κ其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用;主要为氢键Γ来维持Κ相同长度的DNA单链序列不同Κ甚至单个碱基不同所形成的构象不同Κ电泳迁移率也不同[5]Λ利用分辨率非常高的
Ξ收稿日期Π2003207216Μ修改稿收到日期Π2003211220基金项目Π国家自然科学基金资助项目;30070083Γ作者简介Π胡雅琴;1979-ΓΚ女;汉族ΓΚ在读硕士Λ
介质如聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测出这种构型的改变Λ目前ΚSSCP技术已广泛应用在临床诊断Κ尤其在基因突变分析方面Λ随着植物基因序列信息的不断积累ΚSSCP已开始用于植物的遗传分析[6]Λ本实验选取华山松、雪松、白皮松、油松的针叶Κ未木质化的新梢;略有木质化的新梢可剥取其韧皮部Γ和幼嫩种子作材料Κ分别采用CTAB法和蛋白酶K法进行基因组总DNA的提取Κ并对提取的总DNA进行了PCR扩增Κ获得叶绿体的m atK基因Κ并对扩增产物进行了SSCP分析Λ
1 材料与方法
1.1 实验材料
华山松;P inus a r m and iiΣ、雪松?Ced rus d eo2 d a raΣ、白皮松?P inus bung eanaΣ、油松?P inus tabu2 laef or m isΓ针叶、未木质化的新梢及幼嫩种子均采自陕西师范大学校园;部分材料采回后于-20℃冰箱中冷冻贮藏ΓΛ材料经陕西师范大学生命科学学院田先华副教授鉴定Λ
1.2 主要药品与试剂
药品Π扩增所用T aq酶、dN T P及SSCP所用甲酰胺均购自上海生物工程有限公司Κ所用引物也由该公司合成Λ
引物1Π5′2GAA CTCGTCGGA T GGA GT G23′
引物2Π5′2TAAA CGA TCCTCTCA T TCA CGA23′
扩增产物长度约为1050bpΛ
主要试剂Π;1ΓCTAB提取液ΠN aC l1.5m o l LΜT ris2HC l100mm o l LΚpH8.0ΜED TA20mm o l LΚpH8.0ΜCTAB2%Μ;2Γ30%丙烯酰胺Π丙烯酰胺;A crΓ N2N2亚甲基双丙烯酰胺;B isΓ29∶1Μ;3ΓSS2 CP样品缓冲液Π95%甲酰胺ΚED TA10mm o l LΚ二甲苯氰0.5m g mLΚ溴酚蓝0.5m g mLΜ;4Γ染色液Π0.5g A gNO3Κ加水定容至500mLΜ;5Γ显色液Π12g N aO HΚ0.2g N a2CO3Κ3mL甲醛Κ加水定容至1000mLΛ
1.3 实验方法
1.3.1 总D NA提取 CTAB法Π材料于预先冷冻的研钵冰上研磨成细粉Κ取适量分装入加有PV P的1.5mL Eppondo rf管中Μ迅速加入65℃预热CTAB 抽提液500ΛLΚ混匀Κ相同温度下保温40m inΚ其间不时摇匀Μ2000rpm离心3m inΚ取上清Μ2次加入等体积氯仿2异戊醇Κ颠倒混匀Κ10000rpm离心5 m inΜ取上清Κ加入2倍体积无水乙醇Κ-20℃放置40m inΜ12000rpm离心3m inΚ弃上清Μ加入200ΛL70%乙醇洗涤液Κ10000rpm离心1m inΚ弃上清Μ室温下干燥30m inΜ加100ΛL灭菌三蒸水Κ4℃保存备用Λ
蛋白酶K法Π材料于预先冷冻的研钵冰上研磨成细粉Κ取适量分装入加有PV P的1.5mL Eppon2 do rf管中Μ迅速加入500ΛL SD S;0.5%ΓΚ加入2ΛL 的蛋白酶KΚ混匀Κ37℃水浴消化8h～10hΜ2次加入等体积平衡酚Κ颠倒混匀Κ10000rpm离心5 m inΚ取上清Μ2次加入等体积氯仿2异戊醇Κ颠倒混匀Κ10000rpm离心5m inΚ取上清Μ加1 10体积的醋酸钠和2倍体积无水乙醇Κ-20℃放置40m inΚ12000rpm离心3m inΚ弃上清Μ加入200ΛL70%乙醇洗涤液Κ10000rpm离心1m inΚ弃上清Μ室温下干燥30m inΜ加100ΛL灭菌三蒸水Κ4℃保存备用Λ
提取的总DNA经1%琼脂糖5V c m电泳Κ溴化乙啶染色Κ检测降解Κ选取电泳结果好无降解的样品B eckm an核酸蛋白分析仪上测波长为260nm和280nm的吸光度Λ
1.3.2 PCR扩增 DNA扩增体系Π10mm o l L dN T P s1ΛLΜ10×buffer5ΛLΜ25mm o l L M g+2 3.0ΛLΜp ri m er1;10pm o l LΓ2ΛLΜp ri m er2;10 pm o l LΓ2ΛLΜ总DNA200ngΜT aq酶
2.5UΜ灭菌三蒸水补足50ΛLΛ样品置于Eppondo rf PCR仪扩增Λ扩增程序Π94℃预变性3m inΚ94℃变性45sΚ58℃50sΚ72℃80sΚ30个循环后72℃延伸10m inΛ1.
3.3 SSCP分析 PCR产物2～3ΛLΚ加入10ΛL SSCP样品缓冲液Κ95℃保持6m inΚ迅速置于冰上2m in后立即上样Λ凝胶浓度为3.5%Λ
电泳条件Π稳压80VΚ电泳8hΛ银染色法检测电泳结果Π;1Γ三蒸水洗涤15sΜ;2Γ加染色液Κ置脱色摇床上15m inΜ;3Γ三蒸水洗涤3次Κ每次15sΜ;4Γ加入显色液Κ脱色摇床上显色Κ至谱带清晰为止Μ;5Γ双层玻璃纸封存Λ
2 结果与分析
2.1 D NA浓度及纯度测定
用1%琼脂糖凝胶电泳Κ点样孔只滞留少量DNAΚ说明提取的总DNA样品中基本不含多糖类具粘滞性的物质Λ提取过程中未用RNA酶处理Κ凝胶上溴酚蓝附近可见弥散荧光Κ说明样品中含较多的RNAΚ但从扩增结果看ΚDNA样品中存在RNA 对扩增结果没有影响Λ
实验中多次用CTAB提取雪松的针叶总DNAΚ琼脂糖凝胶电泳后发现只有降解带Κ而用雪松未木质化新梢作材料Κ得到质量较高的总DNAΜ华山松的针叶虽然能提取出总DNAΚ但效果也不如新梢Κ说明同一植物不同部位提取的效果不同Λ用蛋
425西 北 植 物 学 报24卷
白酶K法提取总DNA时Κ分别采用华山松、油松、白皮松幼嫩的种子提取Κ都得到了理想的总DNAΜ而用针叶和新梢作材料时Κ均未得到总DNAΚ说明不同的组织器官适用不同的提取方法Λ在实验中Κ我们还尝试用-20℃冷藏1个月的针叶和新梢作材料提取总DNAΚ也获得了较好的结果Κ表明常规冷冻可以短期保存材料Λ
DNA纯度及产率见表1Λ从表中可看出Κ大部分样品总DNA的A260 A280比值都位于1.8±0.2Κ说明提取的样品纯度较高Λ
表1 总D NA样品吸光度
T ab le1 T he A b so rbance of the to tal DNA samp le
树种Species
样品
Samp le A260A280A260
A280
DNA质量
W eigh t of DNA
;ΛgΓ
油松P.tabu laef or m is 针叶Conifer0.14100.08771.60770.7050
1.166330.60211.93705.8315新梢B ranch
2.00431.21481.649930.065种子Seed1.65083p1.15841.425024.762
雪松C.d eod ara 新梢B ranch0.087230.05121.70311.3080
0.29150.17311.68394.3725
0.42280.21012.01236.3420
白皮松P.bung eana 针叶Conifer1.30540.57142.28456.5270
0.622330.33881.83679.3345新梢B ranch0.70330.46671.506910.550
1.10120.65851.672516.518种子Seed1.95903p1.15841.691129.385
华山松P.ar m and ii 针叶Conifer0.58930.55211.06738.8395新梢B ranch0.768430.41021.87323.8420
0.43570.21012.07376.5355
0.36320.21071.72375.4480种子Seed1.52720.68342.23477.6360
0.768430.45941.67263.
8420
0.38110.22361.70435.7165
注Π3为后续PCR2SSCP所用的样品ΜP代表采用蛋白酶K法Λ
N o teΠT he PCR2SSCP DNA is m arked3and the DNA extracted by P ro teinase K m ethod is m arked P.
2.2 PCR-SSCP分析
从凝胶;图1Γ上可看出Κ样品变性不完全Κ在
远离点样孔的凝胶下方看到有双链DNAΚ而变性的
单链区有两条主带Λ雪松只出现了一条单链带Κ可能
是因为雪松的两条DNA单链构型一致Λ
图1 泳道1、2、3为华山松Μ泳道4、5、6为油松Μ
泳道7、8为雪松
F ig.1 L anes1Κ2Κ3are P.a r m and iiΜ
L anes4Κ5Κ6are P.ta tu tif or m isΜ
L anes7Κ8are C.d eod a ra
3 讨 论
许多分子生物学研究需要有效分离出基因组总
DNAΚ提取过程中影响因素很多Κ除了材料本身所
含的一些代谢物的影响外Κ提取操作也是关键的环
节Κ如操作不当可造成DNA样品有机抽提液的污
染Λ
植物细胞裂解后释放的次生代谢产物—多酚类
化合物易于被氧化Κ被氧化的多酚结合到DNA分
子上而导致DNA降解Λ许多植物组织都富含酚类
化合物Κ而且其含量会随着植物的生长而增加Κ故一
般选取幼嫩的植物组织作为材料来提取总DNAΛ针
叶树中Κ多酚的含量比其他种类的植物要高Κ因此在
本实验中Κ我们选取了刚发芽的幼嫩的针叶和新梢Λ
在操作过程中Κ当组织被研磨细胞破碎后Κ酚类化合
物会释放出来Κ被氧化后会与DNA不可逆的结合Κ
产生褐化效应Κ导致总DNA失去活性Κ进而会造成
在用氯仿-苯酚抽提时丢失Λ去除酚类化合物的一
般途径是先防止其氧化Κ再将其与总DNA分开Λ
525
3期胡雅琴Κ等Π几种松科植物基因组总DNA的提取
PV P 有很强的结合多酚化合物的能力Κ
可与多酚结合形成复合物Κ可以在抽提液中加入PV P 以去除多
酚的影响[7]Λ
植物组织中所含的多糖对总DNA 样品的纯度影响较大Κ若提取的样品中含较多的多糖ΚDNA 溶解于三蒸水后会形成粘稠的溶液Λ此外Κ多糖可以抑制多种酶如限制性酶、T aq 酶的活性Λ
这些都将对后续的操作产生严重的影响Κ故在总DNA 的提取过程中Κ必须将多糖类化合物除去Λ在我们的提取过程中Κ用CTAB 法可有效地去除多糖Κ因CTAB 可与多糖结合成复合物Κ在DNA 沉淀时去除Λ在用蛋白酶K 法提取总DNA 过程中Κ多糖可以在沉淀DNA 时加入低浓度N aA c 有效除去Λ
用蛋白酶K 提取总DNA 时Κ用针叶树的针叶和新梢都未提取出总DNA Κ我们认为这并不能说明蛋白酶K 不适合植物营养器官总DNA 的提取Κ因为在提取过程中发现Κ研碎后的细胞组织极易沉到
管底Κ未能与蛋白酶K 充分接触Λ如果能将细胞有效悬浮在抽提液中Κ使蛋白酶K 充分作用Κ应该可以得到理想的结果Λ
实验中Κ我们还采用-20℃冰箱存储1个月的针叶和新梢作材料Κ得到了较理想的总DNA Κ说明-20℃可以短期保存针叶树的幼嫩针叶和未木质化的新梢Κ这在一定程度上克服了材料季节性生长对实验的限制Λ
一个DNA 片段经高温变性后冰上迅速复性Κ在聚丙烯酰胺凝胶上电泳可以产生两条SSCP 谱带Κ因而常用于分析单拷贝基因的差异Λ我们扩增的基因是叶绿体的单拷贝基因2m atK 基因Κ
该基因编码一种成熟酶Κ属功能基因Κ因此具有很高的保守性Κ可用于分析不同科属间植物的关系Λ经聚丙烯酰胺凝胶电泳Κ产生两条单链主带Κ且各属带的差异较大Κ说明提取的总DNA 可以用来做PCR 2SSCP 遗传分析Λ
参考文献Π
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625西 北 植 物 学 报24卷
植物基因组DNA的提取
植物基因组DNA的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。 1 OD260相当于dsDNA 50 μg/ml，ssDNA 33 μg/ml和ssRNA 40 μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm 的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 μl量程各一支)、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、1.5 ml EP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。 三、试剂 1. 2×CTAB buffer 70%乙醇 RNaseA 0.5×TBE缓冲液(工作浓度) 凝胶加样缓冲液(6×) 6. 核酸染料 7. DNA marker 8. 酚/氯仿(1:1, V/V)
植物基因组DNA提取
植物基因组DNA提取 一、实验目的 1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。 2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验仪器及试剂 实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。 实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸（EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。 四、实验步骤 1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。 2.将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。 3.加入700 l的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。 4.置于65℃的水浴中，每隔10 min轻轻摇动，30 min后取出。
5.加入200 μl KAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30 min。 6.10000 rpm离心5 min，上清移至新离心管中，12000 rpm离心5 min。 7.上清移至新离心管中，加入700 μl异丙醇，-20℃冰箱30 min。 8.10000 rpm离心5 min，弃上清，加入500 μl 70%乙醇漂洗。 9.弃液体，晾干。 10. DNA纯度与浓度测定（使用nanodrop）。 （1）DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。 OD260/OD280 ≈ 1.8：说明较纯； OD260/OD280 > 1.8：说明可能有RNA污染； OD260/OD280 < 1.8：说明可能有蛋白质污染。 五、注意事项 1. 叶片磨得越细越好。 2. 注意移液器的正确使用。 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 六、结果与分析 1.植物DNA提取所用试剂的作用？ 2.植物DNA提取的关键步骤有哪些？ 3.植物DNA提取后的用途有哪些？ 4.从化学结构、化学性质、存在场所以及功能等方面比较DNA和RNA的异同。
植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根)培训资料
植物基因组D N A提取试剂盒(北京天根)
植物基因组DNA提取试剂盒 1 取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分研磨。 2 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 3 加入700 μL氯仿，充分混匀，12,000 rpm（~13,400×g）离心5 min。 注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。 4 小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，充分混匀。 5 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。） 6 向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7 向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8 重复操作步骤7。 9 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂
洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。 10 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。 注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μL，体积过小影响回收率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2 min，12,000 rpm （~13,400×g）离心2 min。
植物DNA提取方法
1.2实验方法 1.2.1 茶花基因组DNA的提取 采用CTAB法[8]提取DNA，所有试剂（有机溶剂除外）和器皿都经高压灭菌，主要步骤如下： （1）取两片幼嫩新鲜叶片，置于预冷的研钵中，倒入适量液氮，迅速研磨成粉末状，随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇，继续研磨成略有流动性的糊状或粥状，转入1.5ml的离心管中，于65℃水浴锅中保温约60min. (2)待混合物冷却至室温后加入等600ul的CI（氯仿：异戊醇=24：1）溶液混匀，轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液，常温下10000rpm离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。 （3）重复步骤（2）一次。 （4）取步骤（3）上清液加入2.5倍体积无水乙醇，仔细混匀，-20冰箱30min以上，沉淀DNA 4℃，12000rpm离心10min. (5)弃去上层有机溶剂，加500ul75%乙醇洗涤沉淀，4℃下8000rpm离心5min,弃去上清，洗涤沉淀3次。 （6）倒置或者37度培养箱烘干. (7)加50ulTE缓冲液溶解DNA，于-20℃冷藏备用。 1.2.2 DNA含量和质量的测定 （1）紫外分光光度法：取4ml提取的DNA，将之稀释200倍，测定提取的DNA在260nm 和280nm处的吸光度值，得出OD260/280的值以及DNA和蛋白质浓度。如蛋白质浓度过高，需纯化。 （2）琼脂糖凝胶电泳：配制1.0%琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液中，电压5V/cm电泳约60min，溴化乙锭染色20min,在凝胶成像系统上观察并拍照。 1.2.3 PCR扩增 (1)PCR反应在Biometro PCR仪上进行，反应体系为25ul:ddH2O 14ul,10×Buffer 2.5ul,MgCl(25mM) 2.5ul,dNTPs(2.5mM) 2.0ul,primer(2.0uM) 1.0ul,DNA 2.7ul(约
植物DNA提取
实验1 植物DNA的提取 实验目的 采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。 掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。 实验原理 1、原理 核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中,前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。 在浓氯化钠溶液(1～2mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA 核蛋白的溶解度很 小；而在稀氯化钠溶液(0.14mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95％乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA或溶于上层水相，或存在于中间残留物中，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，将其注入两倍体积的95％乙醇溶液中，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的
DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。 在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性。又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。 2、DNA的提取原理 （1）CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法：先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。 （2）SDS法是植物总DNA的提取方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞壁，然后加入SDS使细胞膜破裂，并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开。加入KAc可使SDS—蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更加完全。 3、DNA的浓度测定和纯度分析 （1）定磷法：是对样品中核酸（DNA和RNA）含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸（硫酸或高氯酸）消化成无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的钼蓝，在660nm处有最大光吸收。 （2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。
实验报告-植物基因组的提取和检测
题目：植物基因组DNA的提取与检测 一、实验目的 1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理； 2.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。 二、实验原理 1.在液氮中对植物组织进行研磨，破碎细胞； 2.SDS等离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来； 3.苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质； 4.上清液中加入异丙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE缓冲液中，即得植物基因组DNA 溶； 5.DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。 三、实验材料 1.设备 移液器，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心管 2.材料 植物幼嫩叶片 3.试剂 （1）细胞提取液：100mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 5mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.25% SDS，1%β-巯基乙醇（去除酚类） （2）氯仿:异戊醇（24:1） （3）其它试剂：液氮、无水乙醇、 TE缓冲液、异丙醇、洗涤缓冲液 四、方法和步骤 1、取500μL细胞提取液于650C水浴（金属浴）中加热备用； 2、研钵用液氮预冷，新鲜植物叶片（自来水清洗，蒸馏水冲洗干），去除叶脉，剪成细条状，置于研钵中研磨成粉末状（越细越好）； 3、取0.1g粉末（大约两勺半）转移至500μL预热的细胞提取液中，迅速摇匀，650C 水浴（金属浴）中保温30min，10min左右温和颠倒混匀一次； 第 1 页
植物组织DNA的提取和鉴定
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 实验目的 1.通过实验学习并掌握用CTAB来提取DNA的方法。 2.了解CTAB的成分及作用。 3.学习PCR的原理并掌握其方法。 4.学习琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。 实验原理 植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，简称CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。 T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA 序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体；T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。 PCR基本原理： 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，具有类似细胞内DNA的复制过程:由一对
植物基因组 DNA 提取
植物基因组D NA 提取 2ml 离心管提取 取新鲜叶片采用C TAB 法，按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法，略加改进，具体操作过程如下： 1. 2.0 ml 离心管加入离心管盖大小新鲜叶片2片； 2. 液氮充分研磨成粉末，加入900 μL CTAB 缓冲液； 3. 65 ℃水浴1小时，期间摇匀3次； 4. 置于4℃冰箱冷却至15 ℃以下； 5. 加入900 μL25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇，上下混匀2-5 分钟，保证样品与氯仿 充分混合； 6. 12,000 rpm 离心20-30 分钟； 7. 取上清液约800 μL，加入预先加好的700 μL 异丙醇的1.5 ml 离心管中，轻 轻上下颠倒混匀； 8. -20℃冰箱静止30 分钟以上； 9. 12,000 rpm 离心15-20 分钟，弃上清夜； 10. 75%酒精洗涤沉淀，弃上清液，12,000 rpm 离心15-20 分钟； 11. 风干D NA，让酒精挥发干净（4 小时以上或过夜）； 12. 加入100 μL 的纯水（含终浓度为1%RNase）溶解D NA； 13. 放入37 ℃环境中，约60 分钟消化R NA； 14. 取2 μL DNA 进行检测。 50ml 离心管提取 取新鲜叶片采用C TAB 法，按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法，略加改进，具体操作过程如下： 1. 取新鲜叶片在研钵用液氮研磨成粉末； 2. 向50ml 离心管里加入叶片粉末，至刚好覆盖住管圆底部，加入20mlCTAB 缓 冲液充分混匀； 3. 65 ℃水浴1小时，期间摇匀3次； 4. 取出，冷却至15 ℃以下； 5. 加入20ml 的25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇，上下混匀2-5min，保证样品与氯仿
植物基因组DNA提取二方法
一、植物基因组DNA提取 【实验目的】 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 【实验原理】 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 【仪器、材料、试剂】 (一) 仪器 1．高速离心机 2．烘箱 3．冰箱 4．水浴锅 5. 高压灭菌锅 （二）材料 1．十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 2. 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3．乙二胺四乙酸（EDTA） 4. 氯化钠
5．2-巯基乙醇 6. 无水乙醇 7. 氯仿 8. 异戊醇 （三）试剂 1. CTAB抽提缓冲溶液: 250ml 配制方法：称取CTAB 4g，放入200 ml的烧杯，加入5 ml的无水乙醇，再加入100ml的三蒸水，加热溶解，再依次假如56 ml的5mol\l NaCl、20 ml 的1 mol\l Tris-HCl 20ml( PH8.0)、8ml 的0.5 mol/l EDTA定容至250 ml摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温, 冷却后加入2ml的1% 2-巯基乙醇（400ul），4℃保存。 2. 氯仿:异戊醇=24：1（配制方法如实验二） 3．TE缓冲液: PH8.0（配制方法如实验二） 【实验步骤】 (一) DNA的提取 1. 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热； 2. 取少量叶片置于试管中，用小杵磨至粉状； 3. 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀； 4. 置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出； 5. 冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇(24:1) 至满管，振荡2~3 min，使两者混合均匀； 6. 10000 rpm离心10 min，与此同时，将600 μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中； 7. 10000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物； 8. 10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出 9. 加入800 μl 75%的乙醇，将DNA洗涤 30 min； 10. 10000 rpm离心30s后，立即倒掉液体，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）； 11. 加入50 μl 0.5 × TE缓冲液，使DNA溶解； 12. 置于-20℃保存、备用。
实验2、植物基因组DNA的提取
实验二、植物基因组DNA的小量提取 【实验目的】 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 【实验原理】 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因DNA水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 【实验材料】 拟南芥叶片 【试剂和器材】 DNA提取液（1L）：称取24.228g Tris-HCl（0.2M, pH=9.0），LiCl 16.956g（0.4M），EDTA9.306g（2.5mmol/L），全部溶解完全后加入10g SDS先加入少量双蒸水搅拌至透明定容。 器材：研钵，恒温水浴，离心机，离心管等。 【实验步骤】 1、剪取新鲜幼嫩的植物叶片1~2片于1.5 mL离心管中. 2、先加入少量的DNA提取液100 μL，用研磨棒充分研磨尽量避免提取液溅出。 3、再加入600 μL的DNA提取液，使DNA提取液的总体积为700μL，上下颠倒混合均匀。 4、放入高速离心机4℃条件下12 000 rpm离心15 min。 5、取上层水相，移入标有相应序号的新的离心管中，加入600 μL的异丙醇（与加入DNA 提取液的总体积相同），上下颠倒混匀。放置于-20℃冰箱中40 min或以上，使DNA沉淀。 6、放入高速离心机，4℃条件下12 000 rpm离心10 min，沉淀DNA，弃上清。 7、加入1 mL 70%的乙醇洗涤，放入高速离心机，4℃条件下12 000 rpm离心5 min。 8、重复步骤（7），洗去DNA中的杂质。 9、将离心管倒置在吸水纸上，待干燥后，加入20 μL 60℃双蒸水，DNA完全溶解后，放4℃ 冰箱待用，长期保存需放入-20℃。 【实验结果】 可以看到管底有沉淀，待检测
实验四 植物DNA的提取
实验四植物DNA的提取 一、实验目的 掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。 二、实验原理 1、核酸提取的基本原理 核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。 在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。 吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。 为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。 在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性，又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。 SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。
植物基因组DNA提取步骤
植物基因组DNA提取实验操作步骤 1取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分研磨。（植物细胞有细胞壁,液氮可以让细胞冷冻起来,变得很脆,这样容易破细胞壁。同时,液氮的超低温可以大大降低酶活性,防止降解。 注： 1、液氮的温度是-196℃，不要冻伤自己的手，带上手套。 2、用一个保温杯，大一点的，把液氮取出来放在保温杯里，盖上盖子。 3、然后用液氮将研磨棒和研钵预冷。 4、将样品快速放入研钵中，快速研磨，在液氮挥发完之前再加入液氮，一定不要让液氮挥发完或者样品呈现那种黏糊的状态，这样样品中DNA容易降解。 5、等到样品呈现细粉末状态了基本就可以了，用药勺把样品迅速舀到1.5ml 离心管里。） 2将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。（水浴时间依实验具体情况而定，看样品裂解情况，具体看裂解液变得清澈透明为止） 3加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm（~13,400×g）离心5min。 注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。 4小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。 5将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm（~13,400×g）离心30s，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。） 6向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8重复操作步骤7。 9将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂
植物DNA提取方法总结
植物DNA的提取分离技术 摘要：主要介绍了近年来国内外几种常用的DNA提取方法：CTAB法、SDS法等，并在对其进行了简单的归纳总结与比较分析同时，并介绍了一些新的改良方法和其他植物提取方法 关键词：植物DNA 提取方法研究进展 市售中药材大多为干品,而中药材的加工和贮藏整个过程,如日晒、高温烘干等都不利于DN的完整性, 为达到要求目前国内外研究发现并使用的DNA提取方法有很多[1-12]，其中被最为广泛应用的DNA提取方法是传统的CTAB法和SDS法[13]。由于不同植物的材料组分和干湿程度各异，因此对不同植物DNA的提取存在着不同的效果。目前许多学者都在致力于研究不同的植物DNA提取方法。他们在探索新方法的同时，也针对不同的植物，在传统的提取方法上进行着一些新的改良。 1.十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法 在目前众多的DNA提取方法中，CTAB法是其中最为广泛应用的一种。它既可以裂解细胞，又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的沉淀，因而经常被应用于植物的DNA提取工作中。 1.1方法及原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽
提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 1.2 CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP 充分溶解，在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离。 β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 1.3适用范围及一些改良 由于CTAB提取法能够有效地去除多糖及酚类物质的沉淀，因而适用于从含酚类及糖类物质较高的植物材料中提取DNA。经研究发现CTAB提取法在落羽杉属树木、黑木相思、野生稻、野燕麦、枸杞、花生的DNA的提取中，相比较其他提取方法来说都是最好的提取方法。为了缩短提取流程，提高提取质量，研究人员在传统方法的基础上，针对不同植物的特点，对一些提取步骤进行了改进。李先进［11］在对四种药用蕨类DNA提取的比较研究中发现，由于酚类物质极其容易被氧化，因此可以在最开始研磨材料的时候加入4%PVP，以防止研磨中细胞组织破裂后酚的氧化，从而获得更为理想的DNA。黄永莲［5］
植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析
《分子生物学》实验报告 实验一植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析【实验目的】
通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 μg/mL，ssDNA 33 μg/mL和ssR NA 40 μg/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm 的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 μL 量程各一支)、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、 1.5 mL EP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品
植物基因组提取(CATB法)
植物基因组提取(CATB法) 一、实验目的 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验材料 水稻幼叶 四、主要试剂配方 2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。 五、实验步骤 1. DNA的提取 （1）2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。 （2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状； （3）加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动； （4）将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二； （5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出； （6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀； （7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中； （8）10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物； （9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中； （11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解； （12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗
实验一 CTAB法提取植物基因组DNA
实验一CTAB法提取植物基因组DNA 实验目的： 学习从植物组织中（幼叶）提取基因组DNA的基本原理和方法。 实验原理： 采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类），其对DNA的抽提产生不利的影响，所以在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐的溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀（CTAB能溶于乙醇）即可使核酸分离出来。 CTAB溶液在低于15度时会形成沉淀洗出，因此再将其加入冰冷的植物材料中之前必须预热（65度），且离心温度不要低于15度。 实验步骤： 1、取幼嫩的植物叶片（3-5g）剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内。加入等体积的65℃预热的DNA提取缓冲液置于65℃的恒温水浴摇床上1-2h(1.5h)。 2、加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒5分钟，静置5分钟，之后于12000rpm离心10分钟。 3、吸取上层水相，重复步骤2一次。 4、吸取上层水相，加入预冷2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒2分钟并置-20℃冰箱内10min，待DNA沉淀后于12000rpm离心收集，收集的DNA于70%乙醇中洗2-3次。将弃去乙醇风干后的DNA加适量水使其溶解。 5、待DNA完全溶解后加入1-2μl不含RNAaseA（10mg/ml），37℃保温1h以除去DNA中的RNA。 6、于Eppendorf管中加入1mL氯仿：异戊醇（24：1）轻轻上下颠倒10分钟后10000rpm离心10分钟。 7、吸取上层水相并先后加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍总体积的预冷的无水乙醇，接着置于-20℃冰箱，10分钟后10000rpm离心10分钟，弃去无水乙醇，加入70％乙醇洗涤2-3次，风干，最后将DNA溶于适量（200-500μl）TE中。