PAK4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定
［文章编号］ １６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０１－００１１－
０４［收稿日期］ ２０１１－１０－
０７［基金项目］ 国家自然科学基金资助课题（３０８７１３９０，３０６７２３３１，３０８００４１５
）［作者简介］ 代 炜（１９７８－）
，男，辽宁省葫芦岛市人，主治医师，医学博士，主要从事肿瘤信号转导通路的研究。［通信作者］ 孙长伏（Ｔｅｌ：０２４－２２８９１０２６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈａｎｇｆｕｓｕｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ）ＰＡＫ４基因ＲＮＡｉ慢病毒载体的构建与鉴定
代 炜１，张红艳２，李彦姝２，李 妍２，孙长伏１
（１．中国医科大学口腔医学院口腔颌面外科口腔颌面－头颈肿瘤外科，辽宁沈阳１１０００２；
２．中国医科大学细胞生物学教研室细胞生物学卫生部重点实验室，辽宁沈阳１１０００１
）［摘 要］ 目的：构建ＰＡＫ４基因ＲＮＡｉ慢病毒载体，并对其在涎腺腺样囊性癌细胞株ＳＡＣＣ－
８３细胞中干扰效率进行鉴定。方法：针对ＰＡＫ４基因ＲＮＡｉ有效靶序列，合成Ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ，退火形成双链ＤＮＡ，与经Ａｇ
ｅⅠ和ＥｃｏＲⅠ酶切后的ｐＧＣｓｉｌ－ＧＦＰ载体连接产生ｓｈＰＡＫ４ｉ－Ｌ
Ｖ慢病毒载体，ＰＣＲ筛选阳性克隆，测序鉴定。用ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ载体、ｐＨｅｌｐｅｒ１．０载体和ｐＨｅｌｐ
ｅｒ ２．０质粒共转染包装细胞２９３Ｔ细胞，包装产生慢病毒，以２９３Ｔ细胞绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）的表达水平测定病毒滴度。结果：ＰＣＲ扩增出插入片段，测序证实成功构建了ＰＡＫ４－ｓｈＲＮＡ慢病毒载体ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ。包装并浓缩慢病毒，滴度为２Ｅ＋９ＴＵ·ｍＬ－１。将病毒感染ＳＡＣＣ－８３细胞，ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测ＰＡＫ４的ｍＲＮＡ表达下调７０％以上。结论：成功构建了ｓｈＰＡＫ４ｉ－Ｌ
Ｖ病毒载体并建立了ＳＡＣＣ－８３－
ｓｈＰＡＫ４ｉ细胞模型，为ＰＡＫ４在肿瘤信号转导通路中的研究提供工作基础。［关键词］ ＲＮＡ干扰；ＰＡＫ４基因；质粒构建；慢病毒；癌，腺样囊性
［中图分类号］ Ｒ７３９．８７ ［
文献标志码］ ＡＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ
ｏｆＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ
ＰＡＫ４ｇｅｎｅＤＡＩ Ｗｅｉ １，ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｙａｎ２，ＬＩ Ｙａｎ－ｓｈｕ２，ＬＩ Ｙａｎ２，ＳＵＮ Ｃｈａｎｇ
－ｆｕ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｒａｌ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｒｏｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ－Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｔｕｍｏｒ Ｓｕｒｇｅｒｙ
，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｓｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０００２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ
１１０００１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）ｏｆ ＰＡＫ４ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ
ｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ＰＡＫ４ｓｈＲＮＡ ｉｎ ＳＡＣＣ－８３ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ
ｏｌｉｇｏ ＤＮＡ ｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
ＰＡＫ４ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅｐＧＣＳＩＬ－ＧＦＰ ｖｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
ＰＡＫ４ｉｓｈＲＮＡ ｗａｓ ｎａｍｅｄ ａｓ ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ，ａｎｄ ｉｔｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ
ＰＣＲ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ ＨＥＫ－２９３Ｔｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ，ｐＨｅｌｐｅｒ１．０ａｎｄ ｐＨｅｌｐｅｒ２．０．Ａｌｌ ｖｉｒｕｓ ｓｔｏｃｋｓ ｗｅｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ
ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｔｉｔｅｒｏｆ ｖｉｒｕｓ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＧＦＰ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ＰＣＲ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔｔｈｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ ｏｆ ＰＡＫ４ｓｈＲＮＡ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ
．Ｔｈｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｗａｓ ２Ｅ＋９ＴＵ·ｍＬ－１．Ｔｈｅ ＳＡＣＣ－８３ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗａｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＡＫ４ｇｅｎｅｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ａｂｏｕｔ ７０％ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ
ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｓｈＰＡＫ４ｉ－ＬＶ ｉｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ
ａｎｄ ＳＡＣＣ－８３－ｓｈＰＡＫ４ｉｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ ｉｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｉｔ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ＰＡＫ４ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ
ｉｎ ｔｕｍｏｒ．Ｋｅｙ
ｗｏｒｄｓ：ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ；ＰＡＫ４ｇｅｎｅ；ｐｌａｓｍｉｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ；ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ；ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ａｄｅｎｏｉｄ ｃｙｓｔｉｃ１
１第３８卷 第１期
２０１２年１月吉 林 大 学 学 报 （医 学 版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．１ Ｊａｎ．２０１２
慢病毒载体使用手册
LentiCRISPRv2 and lentiGuide-Puro: lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R epeats) is a microbial nuclease system involved in defense against invading phages and plasmids. CRISPR loci in microbial hosts contain a combination of CRISPR-associated (Cas) genes as well as non-coding RNA elements capable of programming the specificity of the CRISPR-mediated nucleic acid cleavage. Lentiviral CRISPR/Cas can infect a broad variety of mammalian cells by co-expressing a mammalian codon-optimized Cas9 nuclease along with a single guide RNA (sgRNA) to facilitate genome editing (Shalem*, Sanjana*, et al., Science 2014). Protocols for cloning into the lentiviral transfer plasmid and general considerations for producing lentivirus are described below. Separate protocols are available for amplifying the genome-scale CRISPR knock-out (GeCKO) libraries. This protocol is for creating individual lentiviral CRISPR plasmids targeting a single genomic locus. lentiCRISPRv2 (one vector system): This plasmid contains two expression cassettes, hSpCas9 and the chimeric guide RNA. The vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. lentiGuide-Puro (two vector system): This plasmid expressed only the chimeric guide RNA. It does not contain Cas9. Please use lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) to first integrate Cas9 into your cell line. The lentiGuide-Puro vector can be digested using BsmB I, and a pair of annealed oligos can be cloned into the single guide RNA scaffold. The oligos are designed based on the target site sequence (20bp) and needs to be flanked on the 3' end by a 3bp NGG PAM sequence, as shown on the next page. Which vector to use: lentiCRISPRv2 is identical to the original lentiCRISPRv1 but produces nearly 10X higher titer virus. lentiGuide-Puro produces >100X higher titer virus over lentiCRISPRv1 and should be used in cell lines where Cas9 has already been integrated in (e.g. using the separate lentiCas9-Blast lentivirus). For applications where Cas9 cannot first be introduced (e.g. primary cells), lentiCRISPRv2 is recommended. After transduction, use puromycin to select for cells with lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro. Lentiviral production: Before starting any lentiviral work, please ensure compliance with your Environmental Health and Safety office and government/organization/university. Briefly, to make lentivirus, a transfer plasmid (e.g. lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro) must be co-transfected into HEK293(F)T cells with the packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260). As a positive control for viral production, we often use a CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319). Target design notes and online resources: For application of Cas9 for site-specific genome editing in eukaryotic cells and organisms, we have computationally identified suitable target sites for the S. pyogenes Cas9 and calculated most likely off-targets within the genome. Please visit https://www.360docs.net/doc/4b13519728.html, to access these Cas9 target design tools. Complete plasmid sequences, protocols, a discussion forum and additional information can be found at the Zhang Lab GeCKO website: https://www.360docs.net/doc/4b13519728.html,/gecko/ . Citation: Please reference the following publications for the use of this material. Improved lentiviral vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Sanjana NE*, Shalem O*, Zhang F. Nature Methods (2014). Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Shalem O*, Sanjana NE*, Hartenian E, Shi X, Scott DA, Mikkelsen T, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F (2014). Science, 343, 83-7. DOI: 10.1126/science.1247005
过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1
过表达慢病毒载体构建和包装手册 Version1.0 吉凯基因 二零一一年五月
目录 简介 (3) 第一部分过表达慢病毒载体的制备 实验流程 (4) 实验材料 (5) 过表达克隆制备 (6) 第二部分慢病毒包装与滴度检测 实验流程 (17) 实验材料 (18) L e n t i v i r u s病毒包装 (21) 病毒的收获及浓缩 (22) L e n t i v i r u s滴度测定 (24) 参考文献 (33)
简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。 吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。 本手册为吉凯基因RNAi慢病毒载体的构建和病毒包装的通用操作流程，目的是为了方便大家交流使用，部分细节内容未能做到一一详述，敬请谅解。同时希望大家能够针对手册中的错误和问题，提出宝贵的意见。
维真生物-如何阅读基因载体图谱
如何阅读基因载体图谱 基因载体是基因工程的核心，也是基因治疗中强有力的生物工具，我们先来认识和阅读载体图谱吧。 一、载体分类及载体组成元件 载体分类 1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体 病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞，进行感染的分子机制。可发生于完整活体或是细胞培养中。可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件： （1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒； （2）介导外源基因的转移和表达； （3）对人体不致病； （4）在环境中不会引起增殖和传播。 非病毒载体一般是指质粒DNA。 2、按进入受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体、穿梭载体（含原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达）。 3、按功能分类：克隆载体、表达载体 克隆载体：具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段（外源基因）的载体。 表达载体：克隆载体中加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA顺序）有关的元件即成为表达载体。 载体组成元件 1、复制起始位点Ori：即控制复制起始的位点。Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。 2、抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+ （1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。 （5）hygr：使潮霉素β失活。 3、多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段，它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。还要再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 4、P/E：启动子/增强子 5、Terms：终止信号 6、加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用 示例阅读载体： pENTER载体 1）human ORF + pENTER载体 2） CMV启动子，T7启动子 3） ORF的C端融合了Flag和His tag 4) 多克隆位点，常用AsisI 和 MluI(人源基因上不常见的)
如何阅读质粒图谱(更新版本)
如何阅读质粒图谱 最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机会,将我学到的东西整理一下,于 大家分享。 载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素 #复制起始位点Oril 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 ＃抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+l ,Kan+ ＃多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段l ＃P/E 启动子/增强子l ＃Termsl 终止信号 ＃加poly（A）信号l 可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（卡那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 ＃启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。 ＃增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。 ＃核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。l ＃转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
慢病毒载体包装构建过程
慢病毒载体包装构建过程 原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。 辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括：慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。 载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。 为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。 一、实验流程（1和2为并列步骤） 1.慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 2.慢病毒干扰质粒载体的构建 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体 3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活
所有质粒载体汇总
酿酒酵母表达载体 pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP, 酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF pY15TEF, pY16TEF, 酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47, 酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424,酵母双杂交系统：酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109;质粒pGADT7,pGBKT7 ;对照质粒pGBKT7-53 , pGBKT7-lam , pGADT7-T , PCL1，酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,丫187,丫190, 毕赤酵母表达载体 pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZ a A,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc , 配套毕赤酵母Pichiapink, 毕赤酵母宿主X33, KM71 , KM71H , GS115, 原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62等原核表达载体，包括pET系列，pET-GST, pGEX 系列(含GST标签)，pMAL 系列pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,- p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis 系列，pQE 系列,pTrc99a,pTrcHis系列， pBV220,221,222,pTXB 系列，pLLP-ompA,pIN-III-ompA (分泌型表达系列),pQBI63 (原核表达带荧光)pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His,pET Dsb,pET GST,pET Trx pQE2, pQE9 pQE30,31,32, pQE 40 pQE70 pQE80L pQETirs system pRSET-A pRSET-B pRSET-C pGEX4T-1,-2,-3,5x-1,6p-1,6p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPi nPoi nt-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF (+) , pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk 233- 3,pACYC184,pBR322,pUC119 pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK (+) ,pBlueScript SK (-) pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C,大肠杆菌冷激质粒：pColdI pColdII pColdIII pColdTF原核共表达质粒：pACYCduet-1,pETduet- 1,pCDFduet-1, pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣：pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞：DH5a JM101 JM103
慢病毒包装原理及应用
慢病毒包装系统简介及应用 一、慢病毒包装简介及其用途 慢病毒（Lentivirus ）载体是以HIV-1 （人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA 表达载体中，是由RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA 合成的，这是因为RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA 不会带poly A 尾。当RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续4 个或5 个T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物3' 端形成1~4 个U 。U6 和H1 RNA 启动子是两种RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA 和～50ntRNA 茎环结构（stem loop ）。在siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA)，载体包含位于RNA 聚合酶Ⅲ启动子和4 ～5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA 。构建载体前通常要通过合成siRNA 的方法，寻找高效的siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA 表达载体。 慢病毒载体（Lentiviral vector ）较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 二、这一系统的目的，主要是为了解决以下问题： 1. 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，这就为RNAi，cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 2. 进行稳转细胞株的筛选； 3. 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液； 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。
慢病毒载体,稳定表达
慢病毒载体，稳定表达 一、慢病毒 逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA 转变为cDNA，再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。 慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。 最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。 慢病毒结构： 2个调节基因： （1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。 （2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。 4个辅助蛋白（附属）基因： （1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生； （2）vpr和nef参与疾病的表现。 慢病毒的优势： 1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因； 2.可感染分裂和非分裂细胞； 3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验； 4.可以更换特异性启动子； 5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；
二、慢病毒载体 慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。 慢病毒包装过程： 慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。 慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物） 三、慢病毒的使用和优势 慢病毒的使用量的取决因素：滴度，感染体积，MOI ，细胞密度 滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位） 检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。 实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。 图3 MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。 最后，818 一些有关慢病毒方面的产品： 1.关于慢病毒载体构建方面： ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】 shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，shRNA慢病毒】 miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，miRNA/inhibitor慢病毒】
慢病毒载体构建步骤研究
一、简介 慢病毒( Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I 型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA 半衰期短，体外合成siRNA 对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA 的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。慢病毒载体能够产生表达shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA ，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA 的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶川启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶川有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA 聚合酶川遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3'端形成1~4个U。 U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶川依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达?21ntRNA 和?50ntRNA 茎环结构(stem loop )。在 siRNA 表达载体中，构成siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状RNA (small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶川启动子和4?5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可 折叠成具有1~4个U 3 '突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前 通常要通过合成siRNA 的方法，寻找高效的siRNA ，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA 表达载体(筛选)。 二、实验流程(大致的简单过程) 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的
如何阅读质粒图谱
一、载体主有病毒和非病毒两大类，其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素 复制起始位点Ori，即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+ 多 克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段 P/E：启动子/增强子 Terms：终止信号 加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记： （1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。 （5）hygr：使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆
载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 相关概念： 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或 操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。 增强子/沉默子－为真核λ基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。沉默子－负增强子，负调控序列。 核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。 λ转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT 或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream有一段GT或T富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。 三、载体及其分类 载体：即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，是用来携带目的 基因片段进入受体细胞的DNA。 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体：都有一个松弛的复制子，能带动 外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（所以有时实验时扩增效率低下，要注意是不是使用的严谨型载体）（2）表达载体：具有克隆载体的基本元件 （ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。
慢病毒(Lentivirus)载体构步骤和方法
一、简介 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。 二、实验流程（大致的简单过程） 慢病毒表达载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体(自己构建)和包装质粒（购入）同时共转染细胞，在293T细胞(购入)中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 大致的实验流程： 1. 根据目的基因相关信息（序列，序列号等），构建含有外源基因或siRNA的重组载体；（即质粒构建，已构建好，质粒可以永久保存） 2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒； 3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒（购入）共转染293T 细胞[1]，进行病毒包装和生产，收集病毒液； 4. 浓缩、纯化病毒液； 5. 用高质量的病毒液感染细胞(293T细胞)； 6. 通过定量PCR精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和Western 分析实验结果； 7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。 三、重组质粒构建流程 1.基因的获得: shRNA寡核苷酸序列的设计和合成(将正确序列克隆入载体中，退火形成双链，PCR扩增) 2.回收 A．酶切产物的胶回收：一般做50-100ul 体系，然后跑电泳回收，回收量一般为30ul。B．PCR扩增产物的胶回收 原理：首先利用低熔点琼脂糖凝胶电泳DNA片段，分离目的条带DNA，然后紫外光下切割含目的DNA条带的胶块，利用胶回收试剂盒回收纯化DNA片段。试剂盒的胶回收
常用pGEX载体图谱
Rosetta系列的表达菌株可以提供T7 RNA聚合酶，它能表达PET系列载体上的外源基因。。。pGEX系列载体上的外源基因不需要T7 RNA聚合酶，普通的大肠杆菌经IPTG诱导即可表达 Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成 蛋白标签： A myc tag is a polypeptide protein tag derived from the c-myc gene product that can be added to a protein using recombinant DNA technology. It can be used for affinity chromatography, then used to separate recombinant, overexpressed protein from wild type protein expressed by the host organism. It can also be used in the isolation of protein complexes with multiple subunits. A myc tag can be used in many different assays that require recognition by an antibody. If there is no antibody against the studied protein, adding a myc-tag allows one to follow the protein with an antibody against the Myc epitope. Examples are cellular localization studies by immunofluorescence or detection by Western blotting. The peptide sequence of the myc-tag is (in 1- and 3-letter codes, respectively): N-EQKLISEEDL-C, N-Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-C, where N stands for Amino-terminus and C stands for Carboxy terminus. The tag is approximately 1202 Daltons in atomic mass and has 10 amino acids. It can be fused to the C-terminus and the N-terminus of a protein. It is advisable not to fuse the tag directly behind the signal peptide of a secretory protein, since it can interfere with translocation into the secretory pathway. A monoclonal antibody against the myc epitope, named 9E10, is available from the non-commercial Developmental Studies Hybridoma Bank