蔗糖密度梯度离心手册-Sucrose Gradient separation manual
密度离心法(精)
密度离心法是样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。该法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点： ① 离心时间较长；②需要制备梯 度；③操作严格，不宜掌握。 等密度离心法 1．原理 等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，粒子上浮；在弯顶处粒子密度大于介质密度时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即粒子密度等于介质密变，此时dr／dt 为零粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。2．注意点： ①离心时间要长 ②可用角式转头或水平式转头 ③粒子密度相近或相等时不宜用 ④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度 ⑤不能用刹车 四、梯度溶液的制备 (一)梯度材料的选择原则： 1．与被分离的生物材料不发生反应，且易与所分离的生物材料分开。 2．可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH 变化较小。 3．不会对离心设备发生腐蚀作用。 4．容易纯化，价格便宜或容易回收。 5．浓度便于测定，如具有折光率。 6．对于分析超迷离心工作来说，它的物理性质，热力学性质应该是己知的。 (二)梯度材料的应用范围下面简单介绍几种常用的密度梯度材料的性质及其应用范围。1．蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1．33g/ml，且由于价格低，容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。 2．聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll—400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。
密度梯度离心法-是利用不同颗粒之间存在沉降系数差,在一定离心力作用下
Ficoll密度梯度离心法-是利用不同颗粒之间存在沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带 Ficoll密度梯度离心法-是利用不同颗粒之间存在沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带，根据血液中各成分比重的不同：红细胞>中性粒细胞>淋巴细胞>单核细胞>血浆(包括血小板)，用Ficoll-Paque单核细胞分离液(相对密度为 1.077±0.001，介于中性粒细胞与淋巴细胞之间)将脐血细胞分成不同的层次。 学术术语来源—— 人脐血间充质干细胞培养方法的比较 文章亮点： 1 以软骨组织工程技术种子细胞为研究方向，选取人脐血为实验材料，利用密度梯度离心法分离出脐血单核细胞，并分别应用MesenGro人间充质干细胞培养基和DMEM培养基贴壁培养进行分离纯化脐血间充质干细胞，结果提示在培养间充质干细胞的数量、形态、生长速度和培养时间诸方面，MesenGro人间充质干细胞培养基均优于DMEM培养基。 2 对两种培养方法进行比较，掌握了人脐血间充质干细胞体外培养的适宜条件和方法，为下一步诱导脐血间充质干细胞成软骨分化和动物实验打下基础，为软骨组织工程技术研究提供了一定的理论和实验支持。 关键词： 干细胞；脐带脐血干细胞；体外培养；脐血；间充质干细胞； MesenGro人间充质干细胞培养基；DMEM培养基；广东省自然科学基金 主题词： 胎血；间质干细胞；培养基；细胞，培养的 摘要 背景：脐血中含丰富的间充质干细胞，可以作为组织工程中一种新的种子细胞
来源。 目的：应用两种培养基体外培养、扩增、分离纯化脐血间充质干细胞，比较其生物学特性的差异。 方法：无菌条件下采取40份足月顺产的脐血，肝素抗凝。应用Ficoll密度梯度离心法分离脐血单核细胞，随机分为两组，其中20份用MesenGro人间充质干细胞培养基进行培养，20份用DMEM培养基进行培养。对比两组梭形的间充质干细胞出现时间、细胞集落出现时间、培养时间、原代细胞数量。选用生长情况良好的原代脐血间充质干细胞，用流式细胞仪检测间充质干细胞表面特异性标记表达情况。 结果与结论：MesenGro组梭形的间充质干细胞平均出现时间、细胞集落平均出现时间、原代细胞平均培养时间、原代细胞平均数量为均优于DMEM组(P < 0.01)。流式细胞仪检测显示，培养的细胞强表达间充质干细胞表面标志CD73和CD105，阳性率99.1%，不表达造血干细胞表面标志CD45和CD34，阴性率99.3%。结果提示在培养间充质干细胞的数量、形态、生长速度和培养时间诸方面，MesenGro人间充质干细胞培养基均优于DMEM培养基。选用MesenGro 人间充质干细胞培养基可以更纯、更快、更好地从脐血中培养出表达间充质干细胞表面标志的细胞。
实验1蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体
蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体 一实验目的 掌握手工制作密度梯度的技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。二实验原理 概述 密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。 密度梯度区带离心法又可分为两种： （1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。 离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心
一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1.28 kg/cm3和60％。 此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间 （2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心从而形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。 离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。 等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。 Cl），其密度可达等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝（C S 1.7g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。 梯度溶液的制备 （1）梯度材料的选择原则。作为一种理想的梯度材料应具备以下几点：①与被分离的生物材料不发生反应即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。②可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。③不会对离心设备发生腐蚀作用。④容易纯化，价格便宜或容易回收。⑤浓度便于测定，如具有折光率。⑥对于超速离心分析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。这些条件是理想条件，完全符合每种性
离心技术
离心技术 离心技术是根据颗粒在匀迷圆周运动时受到一个外向的离心力的行为发展起来的一种分离分析技术。 1．用于工业生产的，如化工、制药、食品等工业大型制备用的离心技术，转速都在每分钟5000转以下。 2．用于生物、医学、化学等实验室分析研究的，转速从每分钟几千到几万转以上，此类技术的使用目的在于分离和纯化样品，以及对纯化样品的有关性能进行研究。 一、基本原理 1．离心力Centrifugal force (F) F=mω2r ω：旋转角速度(弧度／秒) r:旋转体离旋转轴的距离(cm) m：颗粒质量 2．相对离心力Relative centrifugal force (RCF) RCF 就是实际离心力转化为重力加速度的倍数 RCF=F离心力／F重力 = mω2r/mg= ω2r/g g为重力加速度(980．70g/sec2) 同为转于旋转一周等于2π弧度，因此转子的角速度以每分钟旋转的次数(每分钟转数n 或r/min)表示： 一般情况下，低速离心时常以r／min来表示，高速离心时则以g(或数字Xg)表示。 用“X g”表示每分钟转速可以真实反映颗粒在离心管不同位置的离心力。Dole&Cotzias 制作了转子速度和半径相对应的离心力列线图(图2—15)。 3．沉降系数Sedimentation coefficient (S) 当转子内样品绕着旋转轴离心时，样品沉降率是由样品颗粒的大小、形状、密度和溶剂的粘度、密度以及离心加速度决定的，在一般情况下，样品的沉降特征可以用沉降系数来表示： S：是指单位离心场中粒子移动的速度。 S的物理意义是颗粒在离心力作用下从静止状态到达等速运动所经过的时间。 S在实际应用时常在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，单位为秒，1S二1×10-13秒。对一定的样品，在一定的介质中，样品沉降系数S 也常保持不变。文献中常用沉降系数以描述某些生物大分子或亚细胞器大小。 二、离心设备 离心技术所使用的设备是由离心转子、离心管及附件等组成。 (一)离心机 1. 低速离心机 一般最高转速在6000r/min以下。实验室中常用于分离制备。 2．高速离心机带有能够冷却的离心腔制冷设备，这类离心机的速度控制比上述的低速离心机来得准确，工作时的实际速度和温度可通过仪表显示；配有一定类型及规格的转子，可根据需要选用。此类离心机的最高转速在25000r／min以下，常用于生物大分子的分离制备。
蔗糖梯度密度离心
纯化病毒常用的方法是蔗糖密度梯度离心法，能得到比较纯的病毒。其过程如下：1、将收集的组织或脏器或其他,用玻璃匀浆器充分研磨后制成悬液,经反复冻融3 次后,置- 20 ℃冰箱中,备用。 2、先以5000g离心15分钟后，获取上清夜，然后再20000g高速离心30分钟后取上清夜。 3、接着10万g超速离心2h，将沉淀用少量STE溶解。 4、先在超速离心管中加入5-8mL的第3步所获取的含病毒样品的溶解液，然后在离心管中依次加入30 % , 45 % , 60 %的蔗糖,加的时候是用长针头从底部往上加的。11万g离心2.5h,发现在30 %与45 % 以及45 % 与60 %之间都有一条明亮的带，用长针头将两条不同部位的带都吸取出来，分别收集到不同的瓶内。 5、去蔗糖；用STE缓冲液适量稀释纯化的病毒，然后11万g离心3h,用少量STE （根据沉淀的量决定加入多少）缓冲液把沉淀悬起，即最后获得了纯化的病毒。-20度冻纯备用，用时可用分光光度计测定其病毒含量。 问：我在做病毒纯化时，需先用超速离心，再用蔗糖密度梯度离心，求助高手用蔗糖密度梯度离心时的转速与超速离心时的转速有联系吗，是相等还是蔗糖密度梯度离心的转速要比超速离心的速度高？若为后者，那又若何决定蔗糖密度梯度离心时的转速？谢谢！ 答：1、病毒的纯化时，先用超速离心，你应该查一下资料，看在多大的转速时能够把病毒离心下来．那么你的这一步的转速应该至少不小于该转速，你这一步离心下来的沉淀中含有病毒和蛋白成分。 2、因此你的第二步工作就是要将病毒与其他的蛋白以及杂质分离开，密度梯度离心就可以达到该目的。这时你的离心速度要考虑病毒的大小和蔗糖的密度，使得病毒不能沉淀道管底又可与蛋白层分开。这也可能要具体问题具体分析。问：谢谢主任的指点，我的病毒直径为100nm。查阅了有观资料，超速离心为21000rpm,45min，我用24000rpm2hr，我用20%-60%连续蔗糖密度梯度离心，该病毒在蔗糖中的浮密度为1.18mg/ml，请问我的糖密度梯度离心速度大概是多少？谢谢！ 答：我们实验室IBV （80-100nm）的纯化是：l 病毒纯化浓缩（方法一） 1、冷冻之尿囊液解冻后，4℃，11000rpm离心20min。 2、取上清，加入30%PEG6000（含7.85%NaCl）至沉淀出现（终浓度约为7~8%），4℃放置（或搅拌）过夜。 3、4℃，19000rpm离心20min，弃上清，沉淀用适量TEN溶解。 4、4℃，35000rpm离心3hrs，弃上清，沉淀用适量TEN溶解。 5、4℃，33000rpm蔗糖密度梯度离心2.5hrs（蔗糖梯度：20%, 30%, 40%, 50%, 60%）。 6、抽取40%蔗糖带（含IBV病毒），-40℃保存。 你的我想也差不多吧！ 答：你的病毒在蔗糖中的浮密度为1.18mg/ml，如果经过足够长的时间的离心话，那么大概就沉淀在40%-50%靠近40%的这已层中。（40%的蔗糖25度时的浓度为1.176，50%的蔗糖25度时的浓度为1.230）现在必须知道病毒的沉降系数才能算出她你所需要的时间。单纯回答你的离心速度时豪无意义的，必须与时间结合来说明你的离心。一定的速度加上一定的时间才能把病毒分开。
密度梯度离心法分离PBMC操作流程
密度梯度离心法分离PBMC 1.在15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液Ficoll。 2.取5mL抗凝静脉血与5mL无菌PBS按照1：1充分混匀，用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，动作一定要轻，注意保持清楚的界面。外周血，PBS，淋巴细胞分离液最终体积比为1：1：1。 3. 水平离心400g×30分钟。（注意：为保证分离效果，需将离心机升降速率调至最低，即升速为1，降速为0，这样调整后，升降速会比较慢，总体离心时间约为1小时。） 4.离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。 血浆和PBS 单个核细胞 淋巴细胞分离液 红细胞和粒细胞 5.去除部分上层液体（用移液管吸取，不可倾倒），余下约1mL，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一15mL离心管中，加入5倍以上体积的PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。 6.末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，可根据情况适量增减时间。 7. 加入10mL PBS，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。
8. 末次离心后，弃上清，加入含有10%FBS的RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。 用本法分离PBMC，每1mL全血可分离得到1~2×106PBMC，不同人个体之间存在一定差异。活细胞百分率在95％以上。 注意： 1.所有操作都应在无菌条件下进行。 2.在分离前Ficoll和PBS等试剂均需在37℃恒温水浴中预热半小时以上。 3.吸取单个核细胞时不可避免会吸到Ficoll，而Ficoll密度比细胞要大，因此步 骤5中需加入足量PBS稀释，若PBS体积太小可能会导致细胞无法离心收集。
差速离心法和密度梯度离心法的区别
差速离心法和密度梯度离心法的区别 教学问题：高中生物必修1中研究细胞器的分离方法是差速离心法，必修2中研究DNA复制方式——半保留复制的方法是密度梯度离心法，两者之间有什么区别？ 一、差速离心法 差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。 1．工作原理 通常两个组分的沉降系数差在10倍以上时可以用此法分离。例如某样品中有大、中、小三个组分，用差速离心法分离时，把样品放在离心管内，先按大组分的沉降系数选择离心转速和离心时间，当离心结束时正好使大组分全部沉降到离心管底部，这时中小组分中的一部分也会沉降到底部。若原始样品液中三个组分的含量相等，则在原始样品液中大组分占总组分量的三分之一。通过一次离心后分离出的大组分沉淀占总组分量约90%。如要进一步提纯可以把此沉淀物再溶解，再按大组分的沉降条件离心，得到大组分的第二次离心沉淀。通过多次对沉淀和上清液差速离心，可以把三个沉降系数有差别的组份分离提纯，所以这个方法又称为分步离心法。 2．差速离心法的优缺点 差速离心法的优点是样品的处理量较大，可用于大量样品的初分离。其缺点是分离复杂样品和要求分离纯度较高时，离心次数多，操作繁杂。由于沉淀的多次清洗、溶解、再沉淀，容易引起中间损失，所以离心分辨力差。实际分离时由于离心时的对流、扩散和收取沉淀时的污染，对于一些沉降系数相差不大的组分无法进行完全的分离提纯。产品的纯度和回收率都达不到上述理论值。因此差速离心法主要用于大量样品的初步分离提纯。 二、密度梯度离心法 密度梯度离心法又称为区带离心法，可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有良好的分辨率。离心时先将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中。 1．工作原理 不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘油。 密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。
病毒纯化密度梯度离心法
病毒纯化，即应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓缩的病毒样品。病毒提纯是病毒学研究的重要前提，病毒微细形态结构的研究、病毒抗原蛋白的分离提纯、病毒化学成分及其遗传物质－DNA或RNA的详细研究都需要高纯度的病毒样品。病毒纯度只是一个相对的概念，很难有绝对的标准，通常以下几点可以作为判定依据。 物理均一性：测定病毒样品的物理均一性，是证明其纯度的常用方法，包括电镜检查、病毒粒子沉降系数和扩散常数及其在凝胶电泳、等电聚焦中的迁移率等。 病毒滴度与蛋白含量的比例：测定病毒材料的感染力或其血清学反应、滴度与其蛋白含量的比例，也是一种通常采用的纯度测定方法。病毒滴度对蛋白含量的比例越高，说明病毒的纯度越高。 免疫学反应：免疫反应单一而无非特意反应，则说明病毒材料比较纯净。 结晶形成：病毒粒子在十分纯净的情况下，经常可以形成结晶，但少数混有杂质的病毒样品亦可形成结晶，所以这也只是一个相对标准。 病毒纯化方法: 1 超速离心法，其中的平衡梯度密度离心是常用的方法，在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。因为病毒颗粒跟其他生物分子大小不一样，所以病毒在梯度离心过程中形成独特的条带，从而达到分离纯化的效果。但此法对仪器的要求很高，转速至少30000rpm/min，在这个转速下要求离心时间7-8小时。 2 现在开发出各种亲和树脂，能有效地吸附病毒粒子，从而达到病毒纯化的目的。Biomiga公司所开发的病毒纯化系列试剂盒，采用新型材料，能有效吸附腺病毒、腺相关病毒、慢病毒等，加入适当浓度的离子溶液将病毒粒子解离回收，最后对病毒进行脱盐处理，所得病毒纯度高，整个操作简便，极大地缩短了纯化时间，针对需要纯化大量病毒的客户提供大量提取试剂盒，满足客户不同需要。
(CsCl 密度梯度离心法)
中量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法） 李渊越1.将菌液倒入装有50mL TB的锥形瓶中，或从培养好的平板上挑取单克隆，锥形瓶置于37℃摇床 350rpm 培养16-20h,至OD600到10-12。（OD600到40为用TBS培养基在我们的培养条件下所能达到的最高浓度，在此浓度时，菌处于对数生长期） 2.将培养好的菌液到入国产50mL离心管中，每管不超过45mL。（有实验表明，若往离心管中装入超过45mL的 液体，离心后，液体的终体积仍为45mL。因此，一次不应离超过45mL的液体，否则将污染离心机。） 3.室温离心5,000rpm，5min。弃上清，控干。 4.加P1-RNase至终体积到7mL，震荡重悬至菌均匀分散。（按该法最多只能裂解45mL 13OD的细菌，如需裂解更 多细菌，请按比例增加。否则将导致细菌裂解不完全，反而提到更少的菌。） 5.加14mL P2，盖上盖子，上下颠倒混匀2min。（该步一定要混匀，以达到将细菌完全裂解的目的。加入P2后可见溶 液澄清粘稠，该步反应时间不应过久） 6.加7mL P3。（P2和P3之间反应时间不要超过5min。混匀后可见絮状沉淀。该步若置于冰上，沉淀效果更好。但位于室温的反应 以足以达到实验需要。）用H2O配平至对称管重量差<0.1g。 7.室温（4度更好，但没有必要。）离心，10,000 rpm, 5min。 8.将上清用滤纸过滤至另一国产的50mL管中。加0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀后室温（不可置于 4度。若置于4度，将会使部分盐析出）静置10min。（分子克隆p35） 9.室温离心10,000rpm 15min。 10.弃上清，在加1.8mL H2O溶解完全后，平均分至两个1.5mL管中，再分别往每管中加入二分之 一体积的PEG8000，4C沉淀2小时。 11.3,000 rcf离心3min，弃上清。（可以不要非常完全控干） 12.加1.55mL CsCl溶液溶解至沉淀完全溶解。10,000 rcf 3min离心，弃去不溶物质。 13.往2mL超速离心管中加入50ul 2mg/mL EB。加之前用卷纸把枪头外壁的EB擦干。（将外壁的EB擦干 是为了防止EB残留在离心管的管口。） 14.将DNA移至2mL超速离心管中,并用H2O将体积补至2mL。（此时，溶液的密度为3.10g/2mL，共含1.55g CsCl。） 15.配平至对称管重量差<0.02g，封口。（该步配平时，可按1ulH O重0.001g来补加H2O进行配平以缩短时间。）在封口 2 后，上下颠倒混匀。 16.打开超速离心机，按Memu -> Programme -> Plasmid-CsCl -> OK。（该步为149,000rpm 2h 升速max 降速 6。） 17.按Vacuum 至真空度<400后按 Start。（不等真空度至<400其实也可启动，但这可能将造成离心机反复升降速，故制 定此规则。）等升至最大转速后才能离开。（该步为离心机安全操作必须，请务必做到。） 18.2h后，取出转头，离心管。若转头内有液体需将其洗净，擦干。（因为此时泄漏的液体含有EB，因此需要 将其洗净，擦干。） 19.先用8号针头在离心管上部插个洞，再用1mL注射器抽出所需的红色DNA条带至1.5mL离心管 中。 20.加入1mL水饱和正丁醇，上下颠倒混匀（勿用振荡器）约20下。（或更多，使上部液体尽可能变红。）将 1.5mL管置于离心机中，按Short键 5秒，松手。弃去上层液体。（离心的目的是为了加速液面分层，因此 也可省去。） 21.重复20步2-3遍，至下层看不到红色后再萃取一遍。（再萃取一遍的目的是为了确保EB完全去除。） 22.往溶液中补加等体积的H2O，平均分成若干管，使每管终体积为400ul。往每管中分别加入1mL(2.5 倍体积)无水乙醇，颠倒混匀。13,500 rpm 5min 4C。弃上清。（该步的目的是为了除去溶液中残留的CsCl。）23.加1mL预冷的70%乙醇洗一遍。13,500 rpm 5min 4C。弃上清。（该步的目的是为了除去21步中管壁上残留 的部分含CsCl的液体。） 24.加400ul H2O或TE溶解。（对于高拷贝质粒，45mL菌液将获得500-1,500ug左右质粒。）
Ficoll密度梯度离心
外周皿中提取人淋巴细胞（PBMC）的方珐主要有：Ficoll密度梯度离心珐，percoll分层液珐 我主要使用的是Ficoll密度梯度离心珐，给你介绍下 Ficoll密度梯度离心珐： （一）原理： 常用来分离人外周皿单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的聚蔗糖（Ficoll）-泛 影葡胺（Urografin）（F／H）分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分 子量为400，000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后 漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。xī取分层液液面的细胞，就可从 外周皿中分离到单个核细胞。 （二）方珐： 1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 2. 取肝素抗凝静脉皿与等量Hank‘s液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层 液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 3. 离心后管内分为三层，上层为皿浆和Hank‘s液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴 细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括 淋巴细胞和单核细胞。此外，还hán有皿小板。 4. 用máo细皿管擦到云雾层，xī取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hank‘s液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。 5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛皿清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于皿球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 单个核细胞浓度（细胞数／1毫升细胞悬液）＝ 4个大方格内细胞总数 —————————— × 104×2（稀释倍数） 4 6. 细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活 细胞百分率。 活细胞数 活细胞百分率＝—————— ×100％
大量提取质粒DNA(CsCl密度梯度离心法)
大量提取质粒DNA（CsCl密度梯度离心法） 李渊越 1.预约摇床、超速离心机。 2.配TB培养基（1L锥形瓶中装250 ml培养液），并灭菌。质粒做好转化，并涂板。 。 、 。 17.超离后，取样品，用5 ml注射器加上12#针头，抽取EB带，（离心完可见两条EB带，上面一条细浅 的带为断裂的质粒DNA,应抽取下面一条粗浓的EB带）放入50ml管中。 18.以灭菌水饱和正丁醇溶液萃取EB，直到溶液澄清无色。 19.加入等体积TE（一定要加。若不加，在无水乙醇沉淀时，会沉淀下部分CsCl）。 20.加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀（如果不充分混匀，可能会导致离下的DNA是透明的，容易随 上清一起倒掉）。6,000rpm，20min，（注意方向）去上清（注意沉淀不会贴壁，不要倒掉）。 21.加入450 μl (~900ul)水，把50mL离心管平放（注意方向），溶解，直到溶解完全（约需室温过夜）。 22.用枪小心将液体吸入1.5mL离心管中（如>450ul，可分成两管），加入十分之一体积的3 M NaAc (pH 5.2)，再加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，置于4C或-20C 15-30min。13,000 rpm 离心10min。 23.用1mL 70%预冷的乙醇洗沉淀一次，13,000rpm 离心10min。 24.去上清，以1mL TE溶解完全，测定浓度。
lysozyme-EDTA-RNase溶液 溶菌酶0.4 g 0.5M EDTA (pH=8.0) 25mL RNase A (100mg/mL) 120uL H2O 25mL 25％蔗糖: 蔗糖25 g 1 M Tris-HCl（pH 8.0） 5 ml 过滤，加纯水定容至100 ml，置于4 ℃保存。 0.5 M EDTA（pH 8.0）: EDTA·Na·2H2O 186.1 g NaOH 约20 g 加800 ml纯水溶解完全后，调pH至8.0，定容至1 L，湿热灭菌，常温保存。 Triton-lysis: 10% Triton-100 5mL 1 M Tris-HCl（pH 8.0） 15 mL H2O 100mL 湿热灭菌，常温保存。 PEG8000： PEG8000 150 g 5 M NaCl 150 ml 加纯水定容至500 ml，湿热灭菌，常温保存。 EB（2mg/ml）： EB 20mg 加超纯水10ml，溶解，室温保存。
实验1 蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体
实验1 蔗糖密度梯度离心法提取叶绿体 实验原理2、1 概述密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能像差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。 密度梯度区带离心法又可分为两种： （1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。 离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同
沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1、28 kg/cm3和60％。 此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间（2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心从而形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。 离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。 等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。
优化的密度梯度离心法提取质粒DNA
第16卷 第4期 衡水学院学报 Vol. 16, No. 4 2014年8月 Journal of Hengshui University Aug. 2014 收稿日期：2014-01-20 作者简介：高英杰(1978-),男,河北饶阳人,河北师范大学生命科学学院实验师; 赵红桃(1983-),女,河北行唐人,河北师范大学生命科学学院讲师,理学博士. DOI:10.3969/j.issn.1673-2065.2014.04.013 优化的密度梯度离心法提取质粒DNA 高英杰，赵红桃 (河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050024) 摘 要：质粒常被用做基因的载体．纯化质粒DNA 的方法可以分为3种：碱裂解法、煮沸裂解法和SDS 碱裂解法．这些方法可以纯化共价闭合环结构质粒DNA ，而大量获得高纯度的闭环结构质粒DNA 最经典方法是氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法．该方法经过我们的实践与优化，减少了质粒中蛋白质和基因组DNA 的污染，提高了质粒的纯度和得率，所得到的质粒用于拟南芥原生质体转化，效率高达60 % ~ 70 %，明显高于普通的质粒小量抽提试剂盒所提取的质粒DNA ． 关键词：质粒DNA ；氯化铯-溴化乙锭；密度梯度离心法；拟南芥原生质体；转化效率 中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：1673-2065(2014)04-0049-03 质粒DNA 是一种基因运载工具，在分子生物学、基因工程中有着极为广泛的应用，作为质粒载体有3个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点．而质粒DNA 的分离提取是分子生物学实验中最基本的工作．现在已经建立了多种提取纯化质粒DNA 的方法[1]，这些方法都包括3个步骤：培养细菌，收集和裂解细菌，纯化质粒DNA ．由于质粒的大小不同，收集质粒的方法应有所区别，大于15 kb 的质粒要用温和的方法．小于15 kb 的质粒可以用较剧烈的方法，有些大肠杆菌例如：HB101不能用加热的方法裂解．分离纯化质粒的方法各有利弊，根据不同的实验要求对所提纯质粒的纯度也有所不同，通常提出的质粒都存在一定量的RNA 和菌体染色体DNA 的污染[2]．纯化质粒DNA 最经典的方法是氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法[3]，溴化乙锭可以插入DNA 碱基之间，溴化乙锭与线状DNA 和闭环DNA 结合有差别，在饱和溴化乙锭的氯化铯梯度溶液中线状DNA 的浮密度为1.54 g/cm 3，闭环DNA 的浮密度为1.59 g/cm 3，所以离心的结果是线状DNA 和闭环DNA 会停留在离心管的不同区域，从而将闭环DNA 分离纯化出来． 氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心具体还可以分为连续梯度和不连续梯度．区别在于氯化铯溶液浓度在离心管中是否连续，如果是一个连续的浓度梯度，例如加入10 mg/mL 溴化乙锭的终浓度1.55 g/mL 的氯化铯溶液，经过超高速离心后会与DNA 、RNA 等形成一个连续的浓度梯度，闭环DNA 会悬浮于某一层，从而可以收集纯化．不连续梯度是将3个不同浓度的氯化铯溶液逐一加至离心瓶中形成3种不同浓度氯化铯，这3种浓度的氯化铯并不混合，而是形成独立的三层进行离心．我们采用连续浓度梯度的方法对质粒DNA 进行分离，最终优化出了一套纯化方法，用氯化铯溴化乙锭连续密度梯度法可以得到理想的DNA ，用于后续的实验． 1 仪器与方法 1.1 仪器 日立超速离心机，型号CP100WX ，转头型号SRP83VT ． 1.2 方法 1) 配制试剂：溶液I(50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L pH 8.0 Tris-Cl ，10 mmol/L pH 8.0 EDTA)，溶液Ⅱ(0.2 mol/L NaOH, 1 g/L SDS)，溶液Ⅲ(294 g/L 醋酸钾, 115 mL/L 冰醋酸)，EB 溶液(10 mg/mL)，10 × SSC(1.5 mol/L NaCl, 0.15 mol/L 柠檬酸钠)． 2) 接菌到试管中，摇到混浊后扩培到1 L 2×YT 培养基中，37 ℃ 摇培过夜； 3) 收集菌体，离心条件： 4 000 r/min ，4 ℃，20 min ，弃上清．加入25 mL 溶液Ⅰ，振荡重悬菌体； 4) 加入50 mL 溶液Ⅱ并缓慢颠倒，冰上放置 2 min ； 5) 加入40 mL 溶液Ⅲ颠倒混匀，冰上放置5 ~ 10 min ；
(整理)密度梯度离心法densitygradientcentrifugationmethod.
密度梯度离心法density gradient centrifugation method，为得到必要的浓度梯度，可采用浓氯化铯溶液，也可以采用蔗糖等一些小分子溶液，预先在分离超离心机的样品地内制备出密度梯度，在其上面再加上一层少量的大分子溶液后，离心，大分子就形成层状而沉降。不连续密度蔗糖梯度离心液一般可以采用优级纯的蔗糖用超纯水配制成百分比浓度分别为16.1%、37.4%、45%的蔗糖溶液，从离心管底部逐层向上铺设。也有用8层Feicoll梯度离心,即在14mL离心管中由下至上从84％到35％Feicoll液，按7％递减，各加1．0mL，形成7层Feicoll 梯度。连续密度蔗糖梯度离心液则需要用专用仪器配制。 密度梯度离心 又称速率—区带离心,沉降系数较接近的物质分离的方法； 原理：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉
降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。 介质梯度应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。常用的有蔗糖、甘油； 密度梯度液的制备用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度； 操作：离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心形成区带。离心后不同大小、不同形状、有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度液中形成若干条界面清楚的不连续区带； 可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分
〔1〕亦称平衡密度梯度离心法。用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。自1958年米西尔逊（M．Meselson），斯塔尔（F．W．Stahl），维诺格拉德（J．Vinograd）成功地分离了〔15N〕DNA和〔14N〕DNA 以来，该法取得许多成果。为得到必要的浓度梯度，多采用浓氯化铯溶液，所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名称，还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。通常利用分析超离心机，但在将细胞颗粒成分进行分离等
密度梯度离心基础
密度梯度离心基础 一、概论 在密度梯度离心中，单一样品组份的分离是借助于混合样品穿过密度梯度层的沉降或上浮来达到的。梯度液的密度随着离心半径的增大而增加。密度梯度可以予形成，也可以在离心过程中自形成，密度梯度可以分为：速率—区带（Rate-Zonal）离心和等密度（Isopycnic）离心。 在速率—区带离心中混合样品以很薄的一层铺在梯度液的上部，在离心过程中由于不同组份“颗粒”在梯度液中沉降速率的差别，而在离心的某一时刻形成了数个含有单一组份颗粒的“区带”。离心过程中在最“重”的样品（或者说沉降得最快的样品）形成沉淀前就停止了。样品在离心后与梯度液一起收集，用常规技术去除梯度材料后就得了某个较纯的成份。每个单一组份的沉降速率取决于它们的形状、尺寸、密度、离心力的大小、梯度液的密度和粘性系数。 对于相类似的生物体组份常常形状也相似。在速率—区带离心中我们常常使梯度液的最大密度不超过在该梯度中的浮密度。利用这类生物体组份在尺寸上的差异而形成的沉降速率的不同，选择某一特定时刻，当它们中的各个纯样品区带之间的距离拉得最远时停止离心即可以达到分离目的。 与速率—区带离心法不同的是，等密度离心是依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的。混合样品可以铺在梯度液之上，也可以置于梯度液之下，甚至和梯度液混在一起。最后一种方法依靠离心力来形成梯度（自形成梯度）在形成梯度的过程中由于样品各单一成份向它们自己的等密度区靠拢即达到了分离纯化的目的。对于速率—区带离心，梯度液最大密度一般小于样品中各组份的密度，也就是说是在样品正在沉降过程中的不是在形成沉淀后来分离样品；而等密度离心法中，梯度液的初始最大密度常常超过样品各组份的密度，利用每个单一组份沉降或上浮到它们各自的等密度区来达到分离的目的。 密度梯度离心法的理论基础是（参考文献1） 每种纯样品成份在梯度液中的沉降速度可以表达为： 式中：v是某一时刻样品的沉降速度（厘米/秒） d：样品颗粒的直径（厘米），我们在初步计算时就假设样品颗粒为球体。非球形颗粒样品，可以以上式为基础进行修正。 σ：样品颗粒的密度（克/厘米3） ρ：密度梯度液的密度（克/厘米3） η：密度梯度液的粘性系数（克/厘米?秒） ω：离心机主轴的旋转角速度（1/秒），ω=2πN÷60，N：转/分 r：颗粒所在位置与旋转轴心之间的距离，即离心半径（厘米） 当：σ>ρ时，v>0即样品顺离心力方向沉降 σ<ρ时，v<0即样品逆离心力方向上浮 σ=ρ时，v=0即样品停止沉降或上浮，“稳定”在这一位置 用这个公式可以很好地解释在速率—区带离心法或等密度离心法中单一样品的沉降（或上浮）行为。 二、转头的选择：
密度梯度离心实验报告
实验一密度梯度离心法提取叶绿体 [实验项目] 密度梯度离心法提取叶绿体 [实验目的] 掌握手工制作密度梯度技术，了解蔗糖密度梯度离心的原理及优缺点。[实验原理] 不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带。用不同浓度的蔗糖制成浓度梯度，在离心条件下，叶绿体和比他沉降系数小的细胞组分会聚集中到梯度交界处，而沉降系数较大的细胞组分则沉淀到离心管底部，这样可粗略的分离叶绿体。 [实验仪器设备] 超速冷冻离心机（BECKMAN L8-60MR）一台 荧光显微镜（(Olympus，FX-35WA，Japan)）一台 组织捣碎机一台 [实验材料] 新鲜菠菜叶片 [实验药品] 匀浆介质(0.25mol/L蔗糖，0.05mol/L Tris-HCl缓冲液 pH 7.4)；称取88.55g 蔗糖，6.05g Tris，溶解在近800ml蒸馏水中，加入约4.25ml 0.1mol/L HCl，最后定容至1000ml。 60%蔗糖溶液，50%蔗糖溶液，40%蔗糖溶液，20%蔗糖溶液，15%蔗糖溶液。 [实验内容] 1、洗净菠菜叶片，沥干水分，去除叶柄、主脉，称取50g，剪碎。 2、加入预冷到0℃的匀浆介质200ml，用组织捣碎机高档捣碎2min。 3、捣碎液双层纱布过滤到烧杯中。 4、滤液500r/min离心5min，轻取上清液。 5、在Polyallomer离心管内一次加入50%和15%蔗糖溶液（或依次加入60%， 40%，20%，15%蔗糖溶液），注意要用滴管吸取15%蔗糖液沿离心管壁缓缓
注入，不能搅动50%蔗糖液面，一般两种溶液各加12ml（四个梯度各加6ml），加液完成后，可见两种溶液接口处折光稍有不同，这样密度梯度便制好了。 6、在制好的密度梯度上小心的沿着管壁加入3ml粗离心过的上清液。 7、严格平衡离心管，分量不足加入少许上清液。 8、用甩平转头离心（18000r/min）90min。 9、取出离心管，可见叶绿体在密度梯度液中间形成带，用滴管轻轻吸出滴 于载玻片，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察。 [实验数据记录及处理] 图1 蔗糖密度梯度离心后叶绿体分离图 从离心机中取出离心管，观察到离心管内有一层绿色带，用四种蔗糖浓度制成梯度的管内区带出现位置比用两种蔗糖浓度制成梯度的管内位置略低于。 图2 荧光显微镜检测叶绿体 荧光显微镜在470~490nm波长的激发光下可看到视野中有大量红色椭圆形物体，应该为叶绿体。 [实验结论] 通过蔗糖密度梯度离心可粗略的分离得到叶绿体。 [实验注意事项] 1.细胞破碎时,不必过细，减少破碎叶绿体的产生。过滤时不要用力挤压,以避免对叶绿体被膜的破碎。