分子标记技术综述

分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用

分子标记技术

分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有极大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速[2]。

技术种类及原理

分子标记技术自诞生起已研究出数十种，尽管方法差异显著，但都具有一个共同点，即用到了分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种：

1.限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP）

RFLP是最早开发的分子标记技术，指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的，是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。

RFLP的等位基因其有共显性特点，可靠性高，不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个，标记结果稳定，重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，RFLP分析工作量大，成本高，使用DNA量大，使用放射性同位素和核酸杂交技术，不易自动化，尽管结合PCR技术，RFLP仍在应用，但已不再是主流分子标记。

2.随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphism，RAPD）

RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法，其基本原理是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性[4]。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。

与RFLP技术相比，RAPD技术操作简便快速，省时省力，DNA用量少，同时无需设计特定的引物，扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点：(1) RAPD标记是一个显

性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；(2)存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度DNA 片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的DNA片段；(3) RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差[5]。为了得到较稳定的结果，各种反应参数，例如温度，Mg2+、dNTP、引物、模板DNA、TaqDNA 聚合酶的浓度都必须事先进行优化，以得到令人满意的结果。

3.扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）

AFLP 是RFLP 与PCR相结合的产物，其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组DNA 产生不同大小的DNA 片段，再使双链人工接头的酶切片段相边接，作为扩增反应的模板DNA，然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增，最后在接头互补链的基础上添加1—3个选择性核苷酸作引物对模板DNA 基因再进行选择性扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段，根据扩增片段长度的不同检测出多态性[6]。引物由三部分组成：与人工接头互补的核心碱基序列、限制性内切酶识别序列、引物3’端的选择碱基序列（1—10 bp）。该技术的独特之处在于所用的专用引物可在知道DNA 信息的前提下就可对酶切片段进行PCR 扩增。为使酶切浓度大小分布均匀，一般采用两个限制性内切酶，一个酶为多切点，另一个酶切点数较少，因而AFLP 分析产生的主要是由两个酶共同酶切的片段。

AFLP 结合了RFLP 和RAPD两种技术的优点，具有分辨率高、稳定性好、效率高的优点；所需DNA量少，可通过改变限制性内切酶和选择性的碱基种类与数目调节扩增的条带数，具有较强的多肽分析能力；不受环境、季节的限制，聚类敏感，定位专一。但它的技术费用昂贵，对DNA 的纯度和内切酶的质量要求很高。尽管AFLP 技术诞生时间较短，但可称之为分子标记技术的又一次重大突破，被认为是目前一种十分理想、有效的分子标记。

4.简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）

SSR又叫微卫星DNA。卫星是指以少数几个核苷酸（一般1~6个）为单位多次串联重复的DNA序列，微卫星广泛均匀地分布在基因组上，其重复数和重复单位序列都是可变的，故多态信息含量大。微卫星两侧区域的DNA序列较为保守，且重复基因数变化不一，可与两侧保守的DNA序列相互补的方式设计特定的寡居核苷酸引物进行PCR扩增，扩增产物可用电泳进行分离[7]。其基本原理是根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。

SSR具有以下一些优点：(1)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少；(4)同连锁群或染色体具有对应关系，有助于图谱的连锁群或染色体的归并和不同连锁群的整合，并能有效准确区分大量的等位基因，因而可以区分同一物种不同基因型，甚至亲缘关系非常近的材料。显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息，因此一般都需要建立和筛选基因组文库、克隆、测序等一系列操作，成本较高。

5.简单重复序列间扩增（Inter-Simple Sequence Repeats，ISSR）

ISSR(inter-simple sequence repeat)是Zietkeiwitcz等于1994年发展起来的一种微卫星基础上的分子标记。其基本原理是用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3'端或5'端加上2-4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的inter SSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现[8]。

ISSR引物的开发不像SSR引物那样需测序获得SSR两侧的单拷贝序列，开发费用降低。与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不像SSR标记一样具有较强的种特异性;与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP相媲美，检测非常方便，因而是一种非常有发展前途的分子标记。

6.相关序列扩增多态性（Sequence-Related Amplified Polymorphism，SRAP）

SRAP是一种基于PCR的新型标记，具有产率中等，重复性好，操作简单等优点。其基本原理是该标记通过独特的双引物设计对基因的ORFs(Open reading frames)的特定区域进行扩增，上游引物长17bp，对外显子区域进行特异扩增。下游引物长18bp，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增[9]。因不同个体以及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同而产生多态性。

在该技术中，引物的设计很关键，上游引物5’端前10个碱基为“填充”序列，无任何特异组成，接着为CCGG序列，该序列组成核心序列及3’端3个选择性碱基；下游引物5’前11个碱基为“填充”序列，紧接着是AATT，该序列组成核心序列即3’端3个选择性碱基。正反引物分别针对序列相对保守的外显子与变异极大的内含子、启动子和间隔序列，因此多数SRAP标记在基因组中的分布是均匀的。

分子标记技术在植物药材亲缘关系中的应用

1.RAPD技术的应用

RAPD技术引起操作简便快速，省时省力，DNA用量少，同时无需设计特定的引物等优势在植物药材鉴定及亲缘关系分析中应用尤为广泛。

中药真伪鉴别：我国中药材品种来源复杂，互混、互代现象时有发生。传统的鉴定中药的方法对于某些品种，特别是经过多道工序加工后的药材无法准确鉴定。采用RAPD 指纹分析技术既可以鉴定一般经典方法不能鉴定的药材，又可以克服经典方法的局限性。黄丰[10]等对诃子（Folium Chebulae）及其混淆品进行DNA 多态性比较，有效地鉴别了诃子及其混淆品。罗恒[11]等从62条引物中筛选出4条引物，用于海风藤（CaulisPiperis Kadsurae）与其替代品的鉴别，对于制品和原植物的鉴别都获得了成功。Shaw等用RAPD方法对人参（Panax ginseng C. A. Mey）、西洋参（Panax quiquefolium L.）、三七（Panax pseudo-ginseng Wall.var.japonicus）及伪品进行鉴别，根据扩增产物有效地鉴别了3种药材。

种属的鉴别：种间的鉴别是关系中药材质量的一个因素。采用分子标记技术在部分中草药同科同属不同种或品种、亚种、变种之间的鉴别中取得了比较满意的结果。刘塔斯[12]等采用RAPD技术对不同产地的商品药材前胡进行多态性分析, 并构建聚类树型图解决了不同产地的商品药材前胡不易区分的难题, 其聚类树形图与经典前胡分类结果一致。盛丽[13]等用筛选出的7个随机引物对来自甘肃省不同产区的20个当归（Angelica sinensis）样品的基因组DNA 进行了RAPD 及其聚类分析，共扩增出82个位点、其中多态性位点58个，占70.7%。聚类分析表明20个当归样品可以聚为5类，其结果与当归的地理分布比较吻合。仇萍[14]等以湖南金刚藤主产区的15个菝葜材料为研究对象，用RAPD技术对其进行亲缘关系分析。在建立适合菝葜植物的PCR- RAPD 反应体系的基础上，从45个随机引物(10 mer)中筛选出14条，对所有供试材料进行正式扩增，共获得14张DNA指纹图谱，144条DNA谱带，其中有135条为多态带，建立了基于RAPD的菝葜植物亲缘关系树形图。房海灵[15]等应用RAPD 标记方法分析了薄荷属(Mentha L.) 7个种38个种源间的遗传多样性，并采用UPGMA聚类分析方法探讨了38个种源间的亲缘关系。结果表明，用20条随机引物从38个种源的总DNA 中共扩增出111条带，其中多态性条带91条，多态性条带百分率达81. 98%，表明薄荷属植

物种间和种内存在丰富的遗传多样性。赵庆芳[16]等采用RAPD 方法分析了来自3个百合（Lilium brownii var. viridulum）品系的15个栽培百合品种的遗传多样性和亲缘关系，聚类分析表明：来自3个品系的百合栽培品种在遗传关系上明显地聚为3类；亚洲百合品系和东方百合品系的品种有较近的亲缘关系，两者和铁炮百合品系的品种亲缘关系较远；在同一品系内部，相同花色的百合品种具有较近的亲缘关系。

2.ISSR技术

ISSR技术术由于其DNA用量少，实验重复性好，操作过程相对简单，技术要求低，多态性水平高等优点在植物药材亲缘关系鉴定中应用已崭露头角。

张忠廉[17]等应用ISSR分子标记技术，对14种千斤拔属植物进行亲缘关系分析；同时采用紫外分光光度法测其总黄酮量，分析千斤拔属植物种间亲缘关系，并对其进行初步质量评价，为筛选新药源提供理论依据。从60个ISSR引物中筛选出30个引物用于试验，共扩增出367个条带，其中多态性条带363条，共有带4条，多态性条带比例（PPB）为98.91%，遗传相似系数（GS）在0.5668～0.8338，表现出丰富的遗传多样性；亲缘关系最近的为云南千斤拔和蔓性千斤拔，遗传距离最远的为细叶千斤拔和墨江千斤拔；总黄酮量最高的为勐捧千斤拔，其次为蔓性千斤拔，云南千斤拔的总黄酮量也较高，有成为药用植物蔓性千斤拔替代品的潜力。葛娟[18]等运用RAPD和ISSR分子标记技术，对29份新疆红花栽培品种的遗传多样性进行检测，结果表明红花不同品种之间具有比较丰富的遗传变异。对比RAPD和ISSR 在PCR反应中的稳定性和检测变异的能力表明，ISSR的实验稳定性优于RAPD，而且ISSR能检测到比RAPD 更多的遗传变异。刘逸慧[19]等运用ISSR标记技术对来自浙江磐安和浙江、贵州、福建、湖北的4个白术栽培群体以及来自安徽的1个苍术栽培群体进行遗传多样性分析，结果表明中国栽培白术的种质遗传多样性较高，有利于培育高品质的药材。曹秀明[20]对东北产药材龙胆的3个不同品种进行了DNA提取和RAPD及ISSR分析，筛选出3条RAPD引物能把供试的3种龙胆区分开，聚类分析结果表明分子标记技术可用于龙胆的鉴别以及亲缘关系划分。

3.SRAP技术

SRAP 是一种基于PCR 的新型标记，具有产率中等，重复性好，操作简单等优点，在中药材的多样性分析，指纹图谱构建及道地性药材的研究中有着较广泛的应用。

张安世[21]等利用RAPD和SRPD标记技术研究11种苔藓植物的亲缘关系，并进行比较分析。结果表明：RAPD扩增的多态性比率达100%，SRAP扩增的多态性比率达96.9%，2种标记结果均显示了很高的多态性比率，利用SPSS 11.5软件对RAPD和SRAP扩增结果进行了聚类分析，两者均与形态学分类基本一致，但与形态学结果也有一定的差异。因此，RAPD和SRAP都有一定的局限性，需要多种标记方法相互结合、相互印证，才能得出客观的结果。黄璐琦[22]等从生物学角度认为道地药材是药材原植物的基因型及其所处的环境决定的，并探讨了以丹参作为道地性药材研究模式植物的可行性。李廷春[23]等建立和优化了丹参的SRAP反应体系，从88 对引物组合中筛选得到36 对多态性引物组合，对生长在四川中江、陕西商洛、山东、临沂、安徽亳州和安徽凤阳5个丹参主产区的6个丹参种群进行了遗传多样性分析，结果表明：36对多态性引物组合共产生782条多态性条带，显示了较高的多态性，说明SRAP技术可有效地应用于丹参的遗传多样性及亲缘关系的研究。谷凤平[24]以怀地黄DNA为模板，进行SRAP反应条件的优化，构建了怀地黄23个品种的DNA指纹图谱，为怀地黄品种鉴定、遗传多样性分析、分子标记辅助育种和质量综合评价等研究奠定了基础。钱丹[25]等采用SRAP分子标记对来源于12个产地的蒙古黄芪的样品进行了SRAP多态性分析，表明蒙古黄芪居群间遗传分化明显，SRAP技术可以有效用于蒙古黄芪的亲缘关系分析，为蒙古黄芪的种质资源评价提供一定的依据。

4.ALFP技术

ALFP技术结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR 技术的高效性，越来越多的应用于药用植物种质资源遗传多样性的研究。

白音[26]等采用AFLP技术对我国38种石斛属植物进行亲缘关系分析，从64对选择性引物中筛选出8对引物组合，共扩增出1644个位点，其中多态性位点1639个，占总扩增位点的99.7%，说明我国石斛属植物遗传多态性水平很高，国产石斛属植物亲缘关系比较复杂，并非是一个单系类群，可能存在一些并系类群或多系类群。陈要臻[27]等建立了白芷的扩增片段长度多态性的反应体系，并筛选出了适合白芷的引物，构建了白芷种质资源的AFLP指纹图谱，为今后利用AFLP标记技术进行白芷品种鉴定及种质遗传多样性分析提供了标准化程序。谢渊[28]等用AFLP 标记分别对石斛以及天麻进行分析，得到了清晰的石斛及天麻的AFLP 指纹图谱。张磊[29]等用AFLP 技术，对28个中国红花品种进行分析，为进一步红花种质量资源选育和筛选品质相关基因奠定基础。

AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段，所以说AFLP 技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。但是AFLP 技术受到专利保护，应用受到限制，试剂盒的价格昂贵；另外，操作中通常要利用同位素标记，对样品DNA质量要求严格等，限制了其在实践中的广泛应用。

分子标记技术在植物亲缘关系中的研究模式

在植物亲缘关系研究中最经常用到的分子标记技术有RAPD技术、ISSR技术及SRAP技术，这三种技术的研究模式一般为：样本的DNA提取、PCR反应体系的条件优化、引物筛选（设计）、基因扩增、电泳、利用软件进行数据分析（包括多态性分析及聚类分析）。

1.样本DNA的提取

首先是植物样本部位的选取，大多所选材料为植物的幼嫩部位叶[30]，叶片为一扁平器官，较薄，此生代谢产物较少，提取DNA相对比较简单，但选材会受季节的影响；选用药材直接作为鉴定材料的仅有少量的报道，尤其是经过特殊方法（如干燥等方法）进行处置过的植物药材，其遗传物质DNA被破坏（生物在死亡过程中，细胞会产生大量的核酸酶降解DNA）从而难以提取。因此样本的选择要看药物本身的特性及实际情况（如季节）而定。

其次是DNA提取方法的选择，一般采用传统CTAB法、SDS法、苯酚-氯仿法、高盐低pH法从植物的叶片或者幼苗中提取DNA，其中CTAB法较为常用。

最后是进行DNA的浓度及纯度检测，在核酸蛋白分析以上进行。测定样品在波长260nm 和280nm处的OD值，及OD260nm/OD280nm比值以检测样品的纯度，并按总DNA含量（ng/μL）=OD260nm×50×稀释倍数，计算DNA浓度。

2.PCR反应体系的条件优化

在PCR反应体系中，酶浓度、模板浓度、底物（dNTP）浓度、引物浓度、镁离子浓度这五个因素都是影响PCR扩增反应能否进行的重要因素。常用的条件优化反复是正交实验，选择模板量较多的样品，应用单因素多水平实验设计与正交实验设计相结合的方法，通过调整酶浓度、模板浓度、底物浓度、引物浓度等条件对反应体系进行优化，选择出扩增条带清晰的最佳反应体系。

3.引物筛选（设计）

RAPD技术及ISSR技术用的是随机引物，不需要进行特定的引物设计，但是要通过引物筛选得到扩增条带清晰、多态性高、重复性好且稳定性强的引物。这一筛选工作需要占用整

个实验的大部分时间和精力[30]。

SRAP技术需要进行特定的引物设计：上游引物一般长17 bp，5′端前10 个碱基为“填充”序列（filler sequence），无任何特异组成，接着为CCGG 序列，该序列组成核心序列及3′端3 个选择性碱基，可对外显子进行特异性扩增；下游引物长18 bp，5′端前11 个碱基为“填充”序列，紧接着是AATT。该序列组成核心序列即3′端3 个选择性碱基，可对内含子区域、启动子区域进行特异性扩增。

4.基因扩增

用筛选得到的引物对所有样本进行基因扩增（PCR）。参考相应文献以及反复实验确定出适合研究对象的PCR程序。

5.电泳

根据扩增产物的分子量大小选择琼脂糖电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行电泳，一般选用琼脂糖电泳。

6.利用软件进行数据分析（包括多态性分析及聚类分析）

根据扩增产物的电泳结果，统计每个引物扩增的条带数，在同一位置上出现的条带数计为1，无则计为0，构建（0,1）矩阵，计算扩增产物的总条带数、多态性条带及多态性比率。将（0,1）矩阵输入计算机，算出各样品之间的遗传距离D。样品间D值越大，表示其亲缘关系越远，样品间D值越小，表示其亲缘关系越近。

根据各品种间的遗传距离，利用NTSYS软件[31]进行各品种间UPGMA（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean）聚类分析，构建聚类树形图。该法的基本思想是：首先将多元性样品各自看成一类，然后根据样品间的相似程度，再选择最相似者加以合并。每合并一次减少一类，如此继续下去，直至将所有的样品合并成为一类为止。

除NTSYS软件外，其他的软件也可用于聚类分析：SPSS11.5分析软件[32]，按Average Linkage法进行聚类分析，建立聚类树状图；采用POPGENE软件[33]计算每对引物的多态性位点数和多态性位点百分率，有效等位基因数Ne，遗传相似性和Nei’s遗传距离进行分析。

用分子标记技术鉴定植物药材亲缘关系的时间周期

用分子标记技术鉴定植物药材的一般过程为：样本DNA的提取、PCR反应体系的条件优化、引物筛选（设计）、基因扩增、电泳、利用软件进行数据分析，其中样本DNA的提取及引物筛选对时间周期的影响较大。某些植物药材的季节性很强，如草本植物，鉴定这些药材的亲缘关系时需要充分考虑到这一点，在合适的季节取材是后续实验不受影响的保障。引物的筛选（设计）是整个实验过程中占用时间和精力最多的一大块，RAPD技术和ISSR技术用到的是随机引物，需要在大量的引物中选出扩增条带清晰、多态性高、重复性好且稳定性强的引物；SRAP技术需要先进行引物设计，然后在设计出的引物中进行筛选。这部分工作很关键，耗时间也长。

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