醛糖还原酶基因多态性及其活性与广_省略_族2型糖尿病微血管病变关系的研究_巫丽丽

屋尘螨诱导气道上皮炎症介质的表达机制及醛糖还原酶抑制剂的调控作用

屋尘螨诱导气道上皮炎症介质的表达机制及醛糖还原酶抑制剂 的调控作用 第一部分屋尘蟎刺激的人支气管上皮细胞表达炎症介质的改变目的通过测定人支气管上皮细胞在被屋尘螨和地塞米松刺激前后,IL-29、IL-6及NF-κB的表达情况,及相互关联,进一步探讨三者与屋尘螨引起的气道炎症的关系。方法将人支气管上皮细胞分为A组(空白对照组)、B组(300ng/mL屋尘螨)、C组 (100ng/mL屋尘螨)、D组(3000ng/mL屋尘螨)、E组(300ng/mL屋尘螨 +100 ng/mL 地塞米松),检测各组细胞IL-29、IL-6及NF-κB/p65的mRNA相对表达量及上清液中IL-29及IL-6的蛋白含量。 结果屋尘螨刺激24小时后,B组、C组、D组的IL-29、IL-6蛋白及mRNA、NF-κB/p65mRNA表达明显的高于A组,并且,E组经屋尘螨和地塞米松共刺激24小时后,IL-29、IL-6蛋白及mRNA、NF-κB/p65mRNA表达明显低于那些仅被屋尘螨刺激的组别,但高于空白对照组,各组间差异有统计学意义(F值分别为 191.983;415.311;65.377;283.037;294.367;P值均<0.01),且屋尘螨浓度越高,IL-29、IL-6蛋白及mRNA、NF-κB/p65mRNA表达水平增高越明显。且各组IL-29 mRNA、IL-6mRNA均与NF-κB/p65mRNA水平呈现正相关 (r=0.899,P=0.000;r=0.883,P=0.000)。 结论屋尘螨可能通过激活NF-κB炎症信号通路,进而引起IL-6、IL-29的表达增加,参与屋尘螨引起的气道炎症的发生发展过程。第二部分屋尘螨诱导人支气管上皮细胞表达炎症介质的机制目的通过测定NF-κB/p65 siRNA对屋尘螨刺激的人支气管上皮细胞的NF-κB及IL-6、IL-29的表达水平的影响,探讨屋尘螨致气道炎症的发生机制。

荧光法测定醛糖还原酶活性的优化.

荧光法测定醛糖还原酶活性的优化 作者：王俊杰方会龙段小毛肖和平谷娟李玲欧阳冬生 【摘要】目的找出优化NADP生成荧光法测定红细胞醛糖还原酶 (AR) 活性的方案。方法通过研究血红蛋白浓度、激发荧光水浴时间以及NADP溶液贮存时间对荧光强度的影响，优化红细胞AR活性测定的NADP生成法；以此方法测定正常及糖尿病大鼠AR活性。结果 NADP生成法的精确度受血红蛋白影响，在终止反应后的NADP溶液中加入250 μl 6％高氯酸沉淀血红蛋白可消除此影响；水浴激发荧光时间5、30、60 min，荧光值变异系数无差异；在激发 荧光前将反应体系生成的NADP溶液贮存于-20℃的条件下至少可以稳定保存4 w。糖尿病大鼠AR活性明显高于正常对照组(P<0.05)。结论优化的NADP生成法可以更准确测定红细胞AR活性。 【关键词】糖尿病；醛糖还原酶；荧光；活性 【Abstract】Objective To optimize the the NADP generating fluorimetric method for aldose reductase (AR) activity. Methods The effect of haemoglobin，the time of aqueous bath arousing fluorescence and storage time of NADP solution on the fluorescent value was observed. It was optimized that the NADP generating fluorimetry assayed erythrocytes AR activity. AR activity of normal and diabetic mellitus rat were examined.Results The accuracy of this assay was influenced by hemoglobin concentration which could be eliminated by adding 250 μl 6﹪ perchloric acid to precipitate hemoglobin as the reaction was terminated. It had no difference for the variation coefficient of fluorescence value when the time that the fluorescence was provocated through waterbath was 5,30,60 min. NADP solution could be stored in the condition of -20℃ fo r 4 weeks at least. AR activity was higher in diabetic rats than that of normal rats(P＜0.05). Conclusions Optimized NADP generating fluorimetry can measure activity of erythrocyte AR accurately.

醛糖还原酶基因AR的克隆

醛糖还原酶基因AR的克隆 一、醛糖还原酶DNA模板的构建 抽取人体血液，经过亲和色谱法提取mRNA，该过程可用商业化的试剂盒分离系统，得到高纯度mRNA。再用RT-PCR法，逆转录出c-DNA,再合成AR基因。 二、引物设计 登陆NCBI网站，进入“核酸”中，输入醛糖还原酶的登陆码：U37100，找到该序列： 1 CAAAAACAGC AACAGAAAGC AGGACGTGAG ACTTCTACCT GCTCACTCAG AATCATTTCT 61 GCACCAACCA TGGCCACGTT TGTGGAGCTC AGTACCAAAG CCAAGATGCC CATTGTGGGC 121 CTGGGCACTT GGAAGTCTCC TCTCGGCAAA GTGAAAGAAG CAGTGAAGGT GGCCATTGAT 181 GCAGGATATC GGCACATTGA CTGTGCCTAT GTCTATCAGA ATGAACATGA AGTGGGGGAA 241 GCCATCCAAG AGAAGATCCA AGAGAAGGCT GTGAAGCGGG AGGACCTGTT CATCGTCAGC 301 AAGTTGTGGC CCACTTTCTT TGAGAGACCC CTTGTGAGGA AAGCCTTTGA GAAGACCCTC 361 AAGGACCTGA AGCTGAGCTA TCTGGACGTC TATCTTATTC ACTGGCCACA GGGATTCAAG 421 TCTGGGGATG ACCTTTTCCC CAAAGATGAT AAAGGTAATG CCATCGGTGG AAAAGCAACG 481 TTCTTGGATG CCTGGGAGGC CATGGAGGAG CTGGTGGATG AGGGGCTGGT GAAAGCCCTT 541 GGGGTCTCCA ATTTCAGCCA CTTCCAGATC GAGAAGCTCT TGAACAAACC TGGACTGAAA 601 TATAAACCAG TGACTAACCA GGTTGAGTGT CACCCATACC TCACGCAGGA GAAACTGATC 661 CAGTACTGCC ACTCCAAGGG CATCACCGTT ACGGCCTACA GCCCCCTGGG CTCTCCGGAT 721 AGACCTTGGG CCAAGCCAGA AGACCCTTCC CTGCTGGAGG ATCCCAAGAT TAAGGAGATT 781 GCTGCAAAGC ACAAAAAAAC CGCAGCCCAG GTTCTGATCC GTTTCCATAT CCAGAGGAAT 841 GTGATTGTCA TCCCCAAGTC TGTGACACCA GCACGCATTG TTGAGAACAT TCAGGTCTTT 901 GACTTTAAAT TGAGTGATGA GGAGATGGCA ACCATACTCA GCTTCAACAG AAACTGGAGG 961 GCCTGTAACG TGTTGCAATC CTCTCATTTG GAAGACTATC CCTTCGATGC AGAATATTGA 1021 GGTTGAATCT CCTGGTGAGA TTATACAGGA GATTCTCTTT CTTCGCTGAA GTGTGACTAC 1081 CTCCACTCAT GTCCCATTTT AGCCAAGCTT ATTTAAGATC ACAGTGAACT TAGTCCTGTT 1141 ATAGACGAGA ATCGAGGTGC TGTTTTAGAC ATTTATTTCT GTATGTTCAA CTAGGATCAG 1201 AATATCACAG AAAAGCATGG CTTGAATAAG GAAATGACAA TTTTTTCCAC TTATCTGATC 1261 AGAACAAATG TTTATTAAGC ATCAGAAACT CTGCCAACAC TGAGGATGTA AAGATCAATA 1321 AAAAAAATAA TAATCAT 该段序列在70---1020bp可以合成蛋白质 1、将上述数据导入到软件中（Primer Premier）

抗糖尿病并发症药物——醛糖还原酶抑制剂

醛糖还原酶抑制剂的作用原理和应用 盛凯丽 （浙江工业大学药学院生物制药1001班201018360314）摘要：糖尿病慢性并发症的发生和恶化与糖代谢多元醇通路异常有关，醛糖还原酶是此 多元醇通路中的关键限速酶。因此，醛糖还原酶抑制剂成为公认的预防、改善和治疗糖尿病并发症的有效对策。 一．醛糖还原酶抑制剂及其作用： 它是抑制醛糖还原酶（EC1,1,1,21）活性的化合物。（醛糖还原酶是哺乳动物体内催化葡萄糖向山梨醇的转化的一种酶，这个过程是糖尿病并发症如白内障和神经疾病的主要起因。）醛糖还原酶抑制剂可有效抑制糖尿病病人许多器官中山梨醇含量的异常升高，因此这类抑制剂，如Thiazocin A和B等可作为糖尿病并发症的防治药。 二．醛糖还原酶(ALR2)与糖尿病并发症 葡萄糖代谢的PP由ALR2与山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase,SDH)共同调控,此通路不依赖胰岛素。其中ALR2以还原型辅酶Ⅱ(NADPH)为辅酶,是 PP的关键限速酶,可催化葡萄糖还原为山梨醇,山梨醇再在SDH的作用下,以氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)为辅酶,进一步氧化为果糖。在正常情况下, ALR2与葡萄糖的亲和力较低(Km >100mmol/L), ALR2并不被激活，葡萄糖转化为山梨醇很少；而在糖尿病所致的高血糖状态下, 催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖的己糖激酶饱和，细胞内高浓度的葡萄糖通过化学修饰ALR2和诱导ALR2 mRNA 的表达,使ALR2激活,导致山梨醇大量产生;山梨醇的增多使得果糖也随之增多,果糖的聚集继而抑制SDH的活性,使山梨醇分解减少。以上两方面的作用使山梨醇在组织中大量堆积,它作为一种极性很强的化合物,不能自由出入细胞,造成细胞内的高渗状态,从而造成细胞的渗透性水肿, 同时细胞内山梨醇大量蓄积也可使Na+、K+-ATP酶活性下降，细胞中肌醇流失，从而导致细胞代谢与功能的损害，进而出现糖尿病并发症等器官病变。 三.各类醛糖还原酶抑制剂的作用机理 1. 海因类 1978年,辉瑞公司(Pfizer)开发出第一个在体内外均具有较高活性的海因类ARIs索比尼尔(sorbinil),此后一些活性更强的同系物也陆续被合成。不幸的是,索比尼尔由于被发现了引起严重的过敏反应而被迫终止临床试验。索比尼尔的衍生物如甲索比尼尔，非达司他(fidarestat)和米那司他(minalrestar)等，其中非达司他活性比索比尼尔强10倍,可恢复糖尿病神经病变患者的红细胞山梨醇含量，连续口服1年，无明显不良反应。试验表明,非达司他可以抑制糖尿病大鼠肾脏和高血糖患者肾小球膜细胞硝硫氰酯和多聚核苷酸聚酶活性，从而减缓或逆转糖尿病肾病进展,而且非达司他几无明显皮疹、粒细胞减少和肝毒性等毒副作用,近期已成功通过三期临床试验，在药物开发当中，这有可能为基于ARIs的糖尿病并发症药物创制提供强有力的支持。化合物ranirestat(AS-3201)是和米那司他类似的酰亚胺，包含一个琥珀酰亚胺环，在生理pH水平，该环是开放的，该化合物属于R异构体，相比于S同分异构体亲

醛糖还原酶抑制剂

和力更强，连接更紧密，而且不易水解，作用持续时间更长。被期待用于广泛糖尿病并发症如神经疾病、白内障、视网膜及肾疾病的治疗，目前处于三期临床试验中。 N HN Br F OO O O Ranirestat F ONH HN O OO NH2 NNH HN O OF Br FOO Fidarestat Minalrestat F ONH HN OOSorbinil 海因类 海因类ARIS构效关系研究表明(以fidarestat为例),其结构中的苯并二氢毗喃环可与ALR2多肽链上的氨基酸残基Trp20、Trp111、Phe122和Trp219形成疏水键,同时1- 位O通过水分子与Ala299和Leu300主链上的N形成间接氢键。螺乙内酞脉环上的两个羰基通过亲水作用与酶形成氢键,2’-位羰基与Tyr48的O形成一氢键,5’-位羰基与Trp111的N形成另一氢键。1’位的N与His110的N也适合形成一个氢键,同时氨甲酰基上的O可与ALR2主链Leu300的N形成氢键,这是fidarestat具有较强亲和力的原因。Fidarestat与ALR2主要氨基酸残基作用情况见图1。 O NH N OO O NH2 HNH N

COOH N NH N OH NH HHHTrp219 Leu300Trp111 His110 Tyr48 Phe122 Trp20 图1 fidarestat与ALR2活性位点的主要氨基酸残基相互作用示意图 2. 羧酸类 在海因类ARIs研究的基础上,人们合成了一系列带有环状羟基乙酸结构和色原环骨架的化合物。该类化合物在体内外对ALR2 有较强的抑制活性,而且没有索比尼尔类似的过敏反应,其代表性化合物有依帕司他(epalrestat)、托瑞司他(tolrestat)、苯并噻嗪乙酸衍生物(SG-210)[9]和唑泊司他(zopolrestat) 。epalrestat已经通过三期临床试验, 20世纪90年代在日本和欧洲上市，但至今仍没有获得美国FDA的许可。依帕司他可以有效预防并且改善糖尿病并发的末梢神经障碍、震动感觉异常和心搏异常等症状，其渗透性和生物利用度都相当高[，轻微的副作用发生率很低。托瑞司他在1989 年曾以Alredase 为商品名在爱尔兰上市, 用于治疗糖尿病继发的周围感觉性神经疾病。但在后续的治疗糖尿病并发的神经病变的大规模随机双盲临床试验中, 托瑞司他因未能表现出足够的疗效, 未能通过FDA。苯并噻嗪乙酸衍生物(SG-210)对于部分提纯的ALR2，有非常高的活性,吸收快、半衰期长、生物利用度

植物中降血糖活性成分研究进展

植物中降血糖活性成分研究进展 2004-03-19 糖尿病是临床常见疾病，近年来患病率呈上升趋势。长期的高血糖可引起一系列的并发症，严重威胁病人的生活和生命。因此对降血糖药物的研究越来越受到重视，其中从天然药物尤其是植物药中寻找降血糖的有效成分是一非常重要的途径。近年来，已发现多种可降血成分，本文根据其化学结构分类进行综述。 1 多糖类 多糖类是目前发现的降血糖成分中数目最多的一类。目前已发现有降糖作用的不少于90种，近年来进行研究的有丹皮多糖、南瓜多糖、螺旋藻多糖等。 1.1丹皮多糖 分别以丹皮多糖粗提品和纯品给胰岛素抵抗的四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠灌胃，并以降糖灵和消渴丸作对照，发现丹皮多糖纯品PSM2b增强糖耐量和改善胰岛素抵抗的效果最好，并有一定的量效趋势，可能是丹皮多糖的主要降血糖有效成分。PSM2b对血清胰岛素水平无明显升高作用，对正常动物的降糖作用也不明显。PSM2b的降糖机理可能是通过促进外周组织对葡萄糖的利用及提高机体对胰岛素反应性来实现的。 1.2 南瓜多糖 用两种南瓜多糖A和B给四氧嘧啶糖尿病小鼠连续灌胃21天后，测定其空腹血药浓度，并以消渴丸作阳性对照。结果发现，南瓜多糖有明显降低血糖的作用，效果优于对照组，多糖B的效果更好。 1.3螺旋藻多糖（PSP） PSP是一种酸性杂多糖，具有多种作用，降血糖作用是其中之一。实验研究发现，PSP 可明显降低链脲佐菌素性糖尿病小鼠和四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖，也可降低肾上腺素和葡萄糖引起的高血糖，提高体内抗氧化生化物质的指标。PSP对小鼠空腹血糖无明显的影响，表明PSP的降糖作用可能不是通过直接刺激胰腺β细胞分泌胰岛素，而是减弱链脲佐菌（STZ）和四氧嘧啶（ALX）对β细胞的伤害作用；另外还可能抑制肝糖原分解、促进组织对葡萄糖的摄取利用，抑制葡萄糖在小鼠肠道的吸收。 1.4 羊栖菜多糖（SFP） SFP也有多种作用，降血糖是其中之一。实验研究发现，SFP可明显降低四氧嘧啶糖尿病小鼠的血糖，提高糖耐量。SFP对正常小鼠的血糖水平无明显的影响，表明SFP的降血糖作用不是通过促进胰岛素分泌来实现。SFP对小鼠空腹血糖也无明显的影响，但可降低糖尿病小鼠血液和胰腺过氧化脂质的含量，表明SFP的降血糖作用与抗氧化损伤胰岛细

远志对糖尿病周围神经病变大鼠尾部感觉神经传导速度和坐骨神经醛糖还原酶活性的影响

远志对糖尿病周围神经病变大鼠尾部感觉神经传导速度和坐骨神经醛糖还原酶活性的影响 赵晓丽 马洪伟 1 陈志宏 1 （承德医学院附属医院神经内科，河北承德067000） 〔摘 要〕目的 观察远志对糖尿病周围神经病变（DPN ）大鼠尾部感觉神经传导速度（SNCV ）和坐骨神经醛糖还原酶（AR ）活性的作用。方 法36只雄性Wistar 大鼠随机分为3组（n =12）：正常对照组、 DPN 模型组和远志治疗组，DPN 模型组和远志治疗组大鼠均采用腹腔注射链脲佐菌素的方法建立DPN 模型，以尾部SNCV ＜30m /s 作为DPN 成模标准；待DPN 模型成功建立后，DPN 模型组大鼠不再做任何处理，远志治疗组大鼠给予远志（2.7g 生药/kg /d ）灌胃6w 。分别检测各组大鼠血糖、尾部SNCV 和坐骨神经AR 活性。结果与正常对照组大鼠比较， DPN 模型大鼠的血糖、坐骨神经AR 活性明显升高，尾部SNCV 明显降低（P ＜0.01）；与DPN 模型组大鼠比较，远志治疗组大鼠的血糖、坐骨神经AR 活性明显降低，尾 部SNCV 明显升高（P ＜0.01）。结论远志可明显降低DPN 大鼠坐骨神经AR 活性、逆转DPN 大鼠尾部SNCV 减慢，对DPN 时周围神经损伤具有明 显的改善作用。 〔关键词〕远志；糖尿病周围神经病变；坐骨神经；感觉神经传导速度；醛糖还原酶〔中图分类号〕R587.2 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1005-9202（2012）21-4683-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.21.035 Effects of Polygala on Caudal sense nerve conduction velocity and aldose reductase activity of sciatic nerve of DPN rats ZHAO Xiao-Li ，MA Hong-Wei ，CHEN Zhi-Hong. Department of Neurology ，the Affiliated Hospital of Chengde Medical College ，Chengde 067000，Hebei ，China 【Abstract 】Objective To observe the effects of Polygala on caudal sense nerve conduction velocity （SNCV ）and aldose reductase （AR ）activity of sciatic nerve of diabetic peripheral neuropathy （DPN ）rats.Methods 36male Wistar rats were randomly divided into 3groups with 12rats in each group ：normal ，DPN model and Polygala treatment groups.The rats in DPN model and Polygala treatment groups were established DPN animal model by intraperitoneal injection of streptozotocin ，and SNCV ＜30m /s was taken as standard.After the DPN rats model were successfully established ，the rats in DPN model group were not given more handling ，the rats in Polygala treatment group were lavaged with Polygala （2.7g ·kg －1·d －1）for 6weeks.The blood glucose ，caudal SNCV and AR activity of sciatic nerve of rats in each group were respectively detected.Results Compared with rats in normal control group ，the blood glucose and AR activity of sciatic nerve of rats in DPN model group were increased obviously ，caudal SNCV decreased obviously （P ＜0.01）.Compared with rats in DPN mod-el group ，the blood glucose and AR activity of sciatic nerve of rats in Polygala treatment group were decreased obviously ，caudal SNCV in-creased obviously （P ＜0.01）.Conclusions Polygala can obviously decrease the AR activity of sciatic nerve of DPN rats and prevent de-scending of caudal SNCV of DPN rats.So Polygala could improve peripheral nerve injury apparently during DPN. 【Key words 】Polygala ；Peripheral nerve injury ；Sciatic nerve ；Sense nerve conduction velocity ；Aldose reductase 基金项目：河北省教育厅项目（2008407；2009404）1 承德医学院人体解剖学教研室 通讯作者：陈志宏（1971-），女，博士，教授，硕士生导师，主要从事解剖 学研究。 第一作者：赵晓丽（1964-），女，副主任护师，主要从事神经电生理学 研究。 糖尿病周围神经病变（DPN ）是糖尿病最常见的慢性并发症之一，发病率高达47% 91% 〔1〕 。DPN 可累及感觉神经、运 动神经和自主神经，但以感觉神经最为常见〔2〕 。虽然治疗DPN 的药物种类繁多，但目前尚无确切有效的治疗药物，通常在控制饮食、应用降糖药的基础上对症治疗。部分患者严格控制血糖并不能使神经功能完全改善，且短期内控制血糖与改善DPN 临床症状并不平行；同时，降糖药物在降低血糖的同时会产生较多的毒副作用 〔3，4〕 。为此，本研究观察了中药远志对DPN 大 鼠尾部感觉神经传导速度（SNCV ）和坐骨神经醛糖还原酶（AR ）活性的影响，为临床探寻有效、且毒副作用小的治疗DPN 的药物提供实验基础。 1材料与方法1.1 试剂与药品 远志水煎液，中药远志（Polygala ）浸泡、水 煎、浓缩获得，生药1g /ml 。链脲佐菌素（STZ ），美国Sigma 公司；血糖检测试剂盒，保定长城临床试剂有限公司（批号：20090511）；BCA 蛋白定量试剂盒，北京索莱宝生物科技有限公司。1.2 实验动物分组 成年雄性Wistar 大鼠36只，体重180 220g ，购自河北医科大学实验动物中心（合格证号：905075）。大鼠随机分为3组（n =12）：正常对照组、 DPN 模型组和远志治疗组。正常对照组大鼠常规饲养，不做任何处理。DPN 模型组和远志治疗组大鼠连续腹腔注射2%STZ （25mg /kg ，3d ），1w 后以血糖≥16.7mmol /L 作为糖尿病成模标准。成功建立糖尿病模型后，DPN 模型组和远志治疗组大鼠继续饲养6w ，以大鼠尾部SNCV ＜30m /s 作为DPN 成模标准；成功建立DPN 大鼠模型后，DPN 模型组大鼠不再做任何处理，远志治疗组大鼠给 予远志（2.7g 生药·kg －1·d －1 ）灌胃6w 。 1.3检测血糖各组大鼠用药结束后禁食12h 以上， 4%水合氯醛腹腔注射麻醉，经内眦于眶后静脉丛采血，离心后收集