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题目三种肺炎支原体检测法
的临床应用分析
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三种肺炎支原体检测法的临床应用分析
摘要
目的探讨肺炎支原体（MP）咽拭子快速液体培养法、咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清MP被动凝集法（MP-Ab）等方法在儿童MP感染诊断治疗过程中的敏感性方法采用3MP检测法对362例临床拟诊呼吸道（非细菌性）感染的患儿的咽拭子和血清标本进行配对研究，每患儿取咽拭子做快速培养和PCR，同时取血清做MP-Ab检测，对3种方法的检测结果与临床诊断治疗病例进行回顾性分析。结果回顾临床病例诊断MP感染患儿152例。MP快速培养法检出阳性78例，阳性率为51.3%，病程为（4.5±2.6）天；PCR法检测出阳性103例，阳性率为67.8%，病程为（6.2±3.5）天；MP-Ab法检测出阳性127例，阳性率83.5%，病程（8.1±4.5）天。结论 3种MP检测法的敏感性与病程有相关性，临床医生应根据患儿病程选取检测方法，以提高阳性检出率和敏感性。
关键词肺炎支原体，快速培养法，咽拭子聚合酶链反应，血清抗体，配对研究
目录
前言 (5)
第一章文献综述 (6)
§1.1 肺炎支原体的定义 (6)
§1.2 肺炎支原体的发病机制 (6)
§1.3 肺炎支原体的分类 (6)
§1.4 肺炎支原体的临床表现 (6)
§1.5 肺炎支原体的临床诊断 (7)
§1.6 肺炎支原体的实验室检查 (7)
第二章材料和方法 (8)
§2.1 样本 (8)
§2.2方法概述 (8)
§2.3临床诊断MP感染的诊断标准 (8)
§2.4实验方法 (9)
§2.5统计学方法 .................................................................... .. (9)
第三章结果 (10)
第四章讨论 (11)
结论 (12)
参考文献 (12)
致谢 (13)
附录 (14)
错误！未定义书签。
前言
肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae,MP）是婴幼儿、青少年急道感染的主要病原体之，临床上表现为呼吸道感染综合征，其中约3%～10%可发展为支原体肺炎。但只根据临床症状很难鉴别由MP或病毒、细菌等病原体引起的儿童呼吸道感染，给临床治疗带来一定的困难。笔者采用3种MP检测法对362例临床拟诊为呼吸道（非细菌性）感染患儿的咽拭子和血清标本进行配对研究，通过病例回顾来探索对支原体肺炎敏感的实验室诊断方法，以协助临床准确做出诊治。
第一章文献综述
§1.1肺炎支原体的定义
小儿肺炎支原体肺炎多见于5~15岁儿童，婴幼儿患病常表现为毛细支气管炎。多数为亚急性起病，发热无定型，或体温正常，咳嗽较重，初期为刺激性干咳，常有咽痛，头痛等症状。X线改变明显，多为单侧病变，也可见双侧病变，以下叶为多见，有时病灶呈游走性，少数呈大叶性阴影；病程2~3周不等，X线阴影完全消失比症状消退更延长2~3周之久，偶有延长至6周者。
§1.2 肺炎支原体的发病机制
肺炎支原体肺炎（Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia，MPP）的发病机制仍不十分清楚，目前主要有呼吸道上皮吸附作用、MP直接侵入和免疫学发病机制等学说，其中免疫调节异常在MPP的发生发展中可能起重要作用
§1.3肺炎支原体的临床表现
1. 多数为亚急性起病，发热无定型，或体温正常，咳嗽较重，初期为刺激性干咳，常有咽痛，头痛等症状。
2. 可出现多系统多器官的损害，皮肤粘膜表现为麻疹样或猩红热样皮疹；偶见非特异性肌痛和游走性关节痛；也有表现心血管系统、神经系统损害、血尿及溶血性贫血等。
3. 全身症状比胸部体征明显。体检肺部体征不明显，偶有呼吸音稍低及少许干湿罗音者
§1.4 肺炎支原体的临床诊断
病原学诊断
肺炎支原体快速鉴定培养法优于被动凝集法，在肺炎支原体肺炎感染的早期
可提供重要的依据，可做为临床诊断MP感染的优先试验[8]；气管肺泡灌洗液MP-DNA测定不仅能诊断MP感染,且支气管肺泡灌洗术可促进呼吸道症状的改善及体征恢复，且通过纤维支气管镜收集支气管肺泡灌洗液MP-DNA，痰液MP-DNA 及血清MP抗体检测阳性率没有差异。CRP的检测是肺炎病原体的辅助诊断方法，一定程度可区分细菌性肺炎和支原体肺炎。聚合酶链反应(PCR)技术检测MP具有可靠、特异性高的特点，逐渐成为早期特异诊断的有力武器。
§1.5 肺炎支原体的实验室检查
急性期MPP患儿血清hs-CRP、C3、CA、IgM、IgG明显升高，IgA明显降低；而恢复期hs-CR、IgG仍然较高，而IgM和IgA均没有明显变化，补体C3、C4在恢复期内也没有明显变化，因此血清C-反应蛋白、免疫球蛋白和血清补体的监测对诊断急性期或恢复期MPP有重要意义。MP-IgM和冷凝集试验同时检测可提高小儿支原体肺炎实验诊断的准确率；支原体肺炎患儿外周血白细胞大多正常占80%，中性粒细胞增高占61%；65.6%患儿C-反应蛋白增高；53.6%患儿血沉增快；
58.4%患儿心肌酶谱增高；24.0%患儿肝酶增高；16.8%患儿尿酸增高。5流行病学特点及进展
MP肺炎发生率约为22.3%，9～12岁感染率最低,3～6岁最高,10～12月是发病高峰月,小儿支原休肺炎发病率有所上升,发病年龄有趋小倾向,秋冬季发病率高,肺炎支原体只要通过呼吸道进行传播，尤其发病率较高的地区，局部区域每隔3-5年可发生一次肺炎支原体感染，每2-6年可发生一次大范围的肺炎支原体感染，每次感染的时间都持续较长，有的感染可持续一年左右，因此，有关部门一定要采取相应的预防措施，切断呼吸道飞沫传播途径对控制疾病发生和流行具有重大意义。控制支原体感染的发生和流行。
第二章材料和方法
§ 2.1 样本
收集黄河中心医院检验科2013年1月1日～8月6日在儿科就诊住院患儿病例，有呼吸道感染症状，已经初诊为非细菌性感染的患儿362例作为研究对象，其中男175例，女187例；年龄为2个月～12岁，病程为1～90天。
§2.2 方法
具体方法有：（1）用MP快速培养法、PCR法和MP-Ab法等3种MP检测法对362例研究对象同时进行检测，记录结果。（2）通过研究对象病历回顾统计MP 感染的例数，并按年龄、病程和3种MP检测法结果进行统计学分析。
§2.3 临床诊断MP感染的诊断标准
按文献［1］、临床症状、体征标准，包括回顾性诊断——即患儿经红霉素治疗有效，经青霉素、头孢菌素治疗无效者等；以及实验室检查3种检测法至少有一种阳性。病程计算方法：以病历本记录为准，即在患儿开始有症状或体征时开始计算，到患儿来就诊检测时为止进行计算。
§ 2.4 MP快速培养法
支原体分离鉴别培养液由珠海市浪峰生物技术有限公司提供。清晨患儿未洗漱用咽拭子取咽部分泌物，严格按说明书进行，将咽拭子用无菌生理盐水处理，接种到预温的培养基中，37 ℃培养；培养基液体颜色由紫红色变为草绿色或嫩绿色且清亮，并且在静置时，瓶底有蓝色颗粒或物质沉淀为阳性，5天后培养基颜色不变或无蓝色颗粒或物质沉淀为阴性。PCR法：试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供。应用PCR法检测MP-DNA，严格按试剂盒说明书进行，以在紫外灯下出现180 bp扩增带结果判为阳性。每次试验均设阳性、阴性对照（阳性对照为MP质粒，阴性对照为无菌生理盐水），由专人进行操作，质量控制。MP-Ab法：试剂为日本瑞必欧株式会社MP-Ab检测试剂SERODIA-MYCOⅡ凝集试验试剂盒，严格按试剂盒说明书操作，抽取患儿静脉血 3 ml，采用明胶颗粒被动凝集法，用血清检测，结果以≥1∶40判断为阳性。每次试验均设未致敏明胶颗粒、致敏明胶颗粒和阳性、阴性血清进行测定。
§ 2.5 统计学方法
计量资料用均数±标准差（x±s）表示，各年龄组与3种检测方法结果比较用Spearman检验；各年龄组间确诊病例的阳性率比较用χ2检验；3种检测方法阳性结果与病程之间的比较用q检验。
第三章结果
§ 3.1 阳性样本
经过回顾性诊断，在配对研究组362例研究对象中有152例符合MP感染的诊断标准，即有152例确诊病例，其中肺炎45例，支气管炎56例，上呼吸感染49例，支气管哮喘2例。MP快速培养法检测出78例阳性，PCR法检测出103例阳性，MP-Ab法检测出127例阳性。
§ 3.2 结果分析
各确诊病例的年龄分布，见表1。表1显示儿童MP感染的年龄以3～4岁年龄段的病例最多，为46例，阳性率最高，为70.77%，与其余年龄组段比较P<0.05。3种检测法的阳性检测结果与年龄分布见表1，表1显示3种检测法与年龄之间差异无统计学意义，以3～4岁的年龄段与其余年龄组段比较差异无统计学意义，P>0.05。不同病程患儿3种检测法的检测结果，见表2，表2显示MP快速培养法为阳性的患儿病程均值较短为（4.5±2.6）天，PCR法为阳性的患儿病程均值为（6.2±3.5）天，MP-Ab法为阳性的患儿病程均值较长为（8.1±4.5）天。3组之间两两比较，差异有统计学意义（P<0.05）。表1 不同年龄组MP感染确诊病例和3种检测方法结果对比分析注：△□代表与年龄组3～4岁组段比较结果表2 不同病程患儿3种检测方法阳性结果对比分析注：△代表三组之间的两两比较
第四章讨论
1 MP感染的临床表现常无特异性，临床的实际工作中，容易与一般病毒性感冒
相混淆。在临床上患儿有下列症状：（1）发热呈弛张热或不规则热。刺激性咳嗽非脓性痰，偶带血丝。（2）可有咽痛、头痛、胸痛，全身症状比体征明显。（3）
肺部体征不典型而胸片炎症显著，可见云雾状大片阴影。（4）WBC正常或升高。（5）青霉素类、磺胺类抗生素治疗无效，改用或一开始用大环内酯类抗生素有效。（6）实验室MP检验有1项或1项以上阳性具备以上2个条件或以上者可初步诊断为MP感染。多时候，临床医生为了尽快缓解患儿的症状，需根据患儿的症状、体征和病史做MP感染的诊断性治疗，但应与肺结核相互鉴别。
2 近年来由于诊断技术的提高，MP感染报道日渐增多，一般认为MP感染以年长
儿发病较多，本文表1资料显示，2～8岁年龄段是发病的高峰期［2］。占同期呼吸免疫科住院患儿的9.3%，比有关文献报道各年龄组支原体肺炎占肺炎发病的10%～20%低。说明MP感染的发病年龄有提前，且年龄越小，临床表现愈不典型。
3临床实验室检测MP的方法很多，过去所用的冷凝集试验法诊断MP感染缺乏特
异性，敏感性也差，易受病程的影响［3］。本文采用配对资料研究，对疑为MP 感染的患儿进行3种MP检测法，以探讨MP快速培养法、PCR法和MP-Ab法等方法在儿童支原体肺炎诊断治疗过程中的敏感性。提示临床医生根据患儿不同的病程选取不同的检测方法，以提高实验室的阳性检出率。
4MP快速培养法是利用MP生长代谢产物使培养基液体中指示剂颜色发生改变来
判断MP生长；标本中的其他支原体和细菌则因培养基中加入了青霉素和醋酸陀均被抑制。该法阳性结果可48 h检出。结果显示，培养法阳性率为51.3%（78/152），低于另外两种方法的阳性率。可能与在检测前患儿已经用了MP敏感药物有关。表2结果显示，该法阳性病例病程最短。提示病程时间较短的患儿选择此方法对检测的阳性率较高。MP培养是诊断MP的金标准［4］。
5 咽拭子PCR法检测质粒核酸，该法快速、敏感和特异，通过一技术可从患儿
痰中检测MP-DNA。由于此方法相当敏感，易受污染，故实验室操作时应特别小心。统计结果显示，该法的阳性率为67.76%（103/152），高于快培法。此法弥补了极微量的和被药物杀死的MP不能通过快速培养法检出的病例。表2结果显示，该法阳性病例，病程为（6.2±3.5）天。详细资料显示，有病程在30天以上的患儿经抗MP治疗，该法仍可为阳性，说明MP的生存力相当强，要系统化治疗。
血清MP-Ab法阳性率是3种检测方法中最高的，为83.55%（127/152），该法是检测患儿血清中的MP抗体，而非直截了当检测MP本身，因而阳性结果并不能确诊是MP感染。对患儿状态的综合评估应包括对患者临床症状和试验结果的严谨分析。极低量的抗体可能不被此试验检测出来。另外还有些MP感染的患者不产生抗体或只产生少量的抗体，高抗体滴度的样品要出现前带现象。表2结果显示，该法阳性病例，病程最长，这是由于发病初期，机体中尚未产生抗体而不能被检测出，提示发病时间较长或经过多种药物治疗过的患儿选择此方法有较高的阳性率。此检测法结果往往受抗体出现的时相及患儿年龄、机体免疫系统状况等多方面的影响。
结论
临床应根据患儿的不同病程、不同年龄以及用药情况来选取实验室的检测方法，以提高MP的阳性检测率，以更好地结合临床症状进行综合分析，从而提高小儿MP感染诊断的准确率。
参考文献
1 檀卫平.聚合酶链反应及血清学检测在肺炎支原体感染诊断中的意义.广东医学，1996，17（4）：218.
2陆定，陆诗强，庄丽宝，等.肺炎支原体引起小儿上呼吸道感染的临床研究.中国当代儿科杂志，2006，8（3）：205-206.
3杨莉.小儿肺炎支原体感染的早期诊断.南京铁道医学院学报，1997，16（2）：116.
4周金凤，黄秀琼.1362例呼吸道感染患者痰、咽拭子肺炎支原体培养结果分析.现代医院，2006，6（6）：86-87.