ATP荧光微生物快检法中不同材质及孔径微孔滤膜细菌截留效果的评价

DOI ：10.13995/https://www.360docs.net/doc/5d837552.html,ki.11－1802/ts.201503038

ATP 荧光微生物快检法中不同材质及孔径

微孔滤膜细菌截留效果的评价

*

侯玉柱，田雨，柯润辉，尹建军，宋全厚

（中国食品发酵工业研究院，北京，

100027）摘

要

在相同的操作条件下考察了直径13mm 的混合纤维素酯膜、聚碳酸酯膜、醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜

等4种常用微孔滤膜对细菌的截留能力。以细菌总数含量为10CFU /mL 的水样为待测样品，过滤体积为50mL ，过滤测定5次。当孔径为0.22μm 时，4种滤膜的平均截留率依次为100%、94%、84%和72%；当孔径为0.45μm 时，4种滤膜的平均截留率依次为92%、82%、70%和70%。因此，孔径为0.22μm 的混合纤维素酯膜对细菌的截留效果最好。以该滤膜过滤细菌总数含量为42CFU /mL 、

20CFU /mL 、10CFU /mL 、4CFU /mL 的水样各50mL ，然后以ATP 生物发光法测定膜上细菌，所得ATP 荧光值与细菌浓度的线性相关系数Ｒ2

＞0.9，线性相

关性较好。结果显示，0.22μm 的混合纤维素酯膜能够满足ATP 生物发光法对微菌含量样品的富集测定要求。关键词

微孔滤膜；截留率；菌落总数；ATP 生物发光法

第一作者：硕士，工程师。

*“十二五”国家科技支撑计划“食品加工过程质量安全在线监测与控制技术研究示范”课题（No．2012BAO29B04）收稿日期：2014－09－15，改回日期：2014－11－15

食品生产用水、医疗用水等微菌含量样品中细菌

总数的测定是目前微生物测定的难点之一［1］

。多数微生物快速检测技术都是利用膜过滤方法富集细菌后进行测定，膜过滤富集细菌的主要机理是机械筛分作用和吸附截留作用

［2－4］

，尺寸较大的微生物（大多数细菌）主要通过机械筛分作用截留细菌，尺寸较小的微生物（大部分病毒）则依靠吸附截留作用。对于膜过滤富集方法而言，影响膜过滤的因素众多，例如滤压、pH 值、滤液温度、过滤体积等

［5］

，然而操作条件能够通过成型的操作规范或标准进行约束，膜孔径及膜材质等客观因素是膜过滤效果的主要影响因素。本文通过对比不同材质、不同孔径的微孔滤膜的细菌截留效果及测定结果，优选出适用于ATP 微生物快检法滤膜富集、膜上测定法测定微菌含量样品中的细菌总数

［6］

。

1

仪器与试剂

1.1

仪器与设备

ATP 荧光检测仪（SF0012型），中质赛福（北京）科技仪器有限公司；恒温培养箱、涡旋振荡器、高压灭

菌锅、移液枪（5 50μL ）、一次性注射器（50mL ）；过

滤器（适用于直径13mm 的微孔滤膜，

可重复使用，先用75%酒精浸泡，用无菌水反复冲洗，无菌条件下

晾干备用）；小镊子（塑料材质，用酒精浸泡再用无菌水冲洗，晾干后备用）。1.2试剂

复合荧光试剂（ZF0011），

中质赛福（北京）科技仪器有限公司；PCA 培养基、

5%生理盐水（自配）；待滤样液（用未消毒台面涂抹洗脱菌悬液自配，以GBT4789.2－2010［7］检测细菌总数，用无菌生理盐水稀释2倍、4倍和10倍，原液及稀释液备用）。

2

材料与方法

2.1

实验材料

混合纤维素酯膜（d =13mm ，孔径0.22μm 和

0.45μm ）；聚碳酸酯膜（d =13mm ，孔径0.2μm 和0.4μm ）；醋酸纤维素膜（d =13mm ，孔径0.22μm 和0.45μm ）；硝酸纤维素膜（d =13mm ，孔径0.22μm 和0.45μm ）。2.2实验方法

2.2.1

细菌富集方法

将0.22μm 孔径和0.45μm 孔径的4种滤膜分别装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧压平，包装，灭菌

后待用（0.1MPa ，

121.5?灭菌20min ），用50mL 无菌注射器吸取50mL 按1.2小节制备的4倍稀释备用液，将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液的注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。将注射器中

的待滤溶液加压缓缓挤入过滤到无菌试管中，滤毕，将针头拨出。压滤时，每次用力要一致且适当，不可太猛太快，以免压力变化太大影响截留效果，每种滤膜做5次平行试验。

2.2.2细菌截留率计算

将2.2.1小节中带橡皮塞的无菌试管中的滤液用涡旋振荡器振荡均匀，以GB4789.2－2010方法测定滤液中残留的细菌总数。

滤膜细菌截留率/%=［（待滤样液细菌浓度?过滤体积）－（滤液细菌浓度?过滤体积）］/（待滤样液细菌浓度?过滤体积）?100

2.2.3ATP荧光微生物快检法

将2.2.1小节中过滤器无菌状态打开，用无菌小镊子将滤膜取出，转移至ATP荧光检测特制样品杯中，用移液枪滴加25μL复合荧光试剂至膜上，再加200μL无菌水至膜上，用移液枪来回吹吸4 5次，推入仪器测定，得出膜上细菌总ATP荧光值，考察各种材质滤膜膜上裂解测定的重复性。

2.2.4梯度实验验证

将按1.2小节中配制好的4个浓度的待滤样液，每个浓度均用2.2.1中所述细菌富集方法，用0.22μm孔径的混合纤维素酯膜过滤富集50mL待滤样液后，用2.2.3中所述的ATP荧光微生物快检法检测的荧光值，对结果做线性相关性分析。

3结果与分析

3.1截留效果统计及分析

1.2中用未消毒台面涂抹洗脱自配的菌悬液经过GB4789.2－2010测定，结果见表1。

表1制备菌悬液细菌总数含量单位：CFU/mL Table1Total bacteria number of prepared suspension

稀释倍数原液2倍稀释后4被稀释后10倍稀释后细菌总数含量4220104

从表1国标测定的结果可以得出，自制菌悬液浓度为42CFU/mL，由此可以推算出不同稀释倍数后的稀释液的含菌量，为后面梯度实验效果的计算提供数据。

按照2.2.1中描述的方法过滤待滤样品，按照2.2.2中所描述的方法计算截留率，得出4种滤膜在相同的操作条件下过滤50mL样液所得细菌截留率统计结果见表2所示。

表2四种滤膜截留效果统计分析表

Table2Statistical analysis of four kinds of membrane intercept effect

滤膜材质孔径/

μm

待滤液含菌量/

（CFU·mL－1）

过滤体积/

mL

滤液平均含菌量/

（CFU·mL－1）

n=5

平均截留率/%

n=5

混合纤维素酯膜0.2210500100 0.4510500.892

聚碳酸酯膜0.2010500.694 0.401050 1.882

醋酸纤维素膜0.221050 1.684 0.451050370

硝酸纤维素膜0.221050 2.872 0.451050370

从表2中可以得出，在相同的操作条件下，同一材质滤膜孔径为0.22μm（或0.2μm）的截留效果优于0.45μm（或0.4μm）的，因此选择0.22μm（或0.2μm）孔径的滤膜过滤细菌更为可行。再对不同材质的0.22μm孔径滤膜做比较：实验中0.22μm 混合纤维素酯膜的平均截留率为100%，优于聚碳酸酯膜的94%、醋酸纤维素膜的84%以及硝酸纤维素膜的72%，由此可以得出，孔径为0.22μm的混合纤维素酯膜对细菌的截留效果最好。3.2ATP荧光法膜上裂解测定重复性评价

从表3可以得出，经过5次平行测定，混合纤维素酯膜上ATP荧光值的相对标准偏差（ＲSD）为5.0%，低于聚碳酸酯膜、醋酸纤维素膜及硝酸纤维素膜的相对标准偏差（后3者ＲSD分别为6.1%、14.1%和19.5%），具有更好的重复性。因此，在以ATP生物发光法测定低菌含量液体样品中的细菌总数时，孔径为0.22μm的混合纤维素酯膜最适合用于过滤截留液体样品中的细菌。

表3

0.22μm 孔径膜上总ATP 测定重复性分析（n =5）

Table 3

Total ATP measurement repeatability analysis

of membrane in 0.22μm aperture （n =5）

序号混合纤维

素酯膜（ＲLU ）聚碳酸酯膜（ＲLU ）醋酸纤维素膜（ＲLU ）硝酸纤维素膜（ＲLU ）1202018611588121021957208720621533321421894155010254218819401865170551974176814991357平均值（ＲLU ）2056191117141365ＲSD /%

5.0

6.1

14.1

19.5

3.3

梯度实验验证效果分析

从图1可以得出，在其他操作条件相同的情况

下，使用0.22μm 孔径的混合纤维素酯膜过滤不同浓度的菌悬液，膜上的ATP 荧光值与待测样液的细

菌含量的相关系数Ｒ2

为0.9543，说明二者之间具有良好的线性相关性。

表4不同浓度待滤样液过滤后膜上测定荧光值Table 4

Fluorescence value from membrane filtrate

samples of different bacteria concentration

原液

2倍稀释液

4倍稀释液

10倍稀释液

细菌总数含量/（CFU ·mL －1）4120104过滤体积/mL

50

505050膜上荧光值/ＲLU 7470

4682

2120

580

图1梯度实验验证效果线性分析图

Fig.1

Linear analysis of gradient experiment results

4

结论

目前，膜过滤技术已经发展得比较成熟。罗

祎

［8］

、刘弋青

［10］

、Parveen

［11］

、嵇志远

［12］

、Namvar

［13］

等专家和学者均曾用微孔滤膜进行微生物检测，但仅评价了单一特定滤膜的细菌截留效果，并未对不同材质、孔径的微孔滤膜做对比研究。本研究在相同操作条件下，分析了微孔滤膜材质及孔径等客观因素对细

菌截留效果的影响，此项研究在业内尚属首次。

在相同的操作条件下，0.22μm 孔径的混合纤维素酯膜能够100%截留低菌含量水中的细菌，其细菌

截留率和ATP 荧光测定重复性皆优于其他常用材质和孔径的微孔滤膜，ATP 荧光值与国标方法测定结

果的线性相关性较好，线性相关系数Ｒ2

＞0.9。以上结论说明，

0.22μm 孔径的混合纤维素酯膜最适用于ATP 荧光微生物测定中细菌的富集与测定。

参

考

文

献

［1］杨笑鹤，郭淼，杨昊，等.ATP 发光法在微菌含量样品测

试中的集菌方式与测试方法的研究［J ］．生物医学工程研究，

2011，30（4）：226－228.［2］Madaeni S S.The application of membrane technology for

water disinfection ［J ］．Water Ｒesearch ，1999，33（2）：301－308.

［3］徐建英.水消毒处理中膜技术的应用［J ］．环境污染治

理技术与设备，

2001，2（2）：86－90.［4］蒋绍阶，石长恩，江志贤.膜过滤技术用于饮用水消毒

可行性探讨［

J ］．重庆环境科学，2003，25（4）：52－55.［5］郑祥，吕文洲，杨敏，等.膜技术对污水中病原微生物取

出的研究进展［

J ］．工业水处理，2005，25（1）：1－5.［6］尹子波，侯玉柱，尹建军，等.ATP 生物发光技术在微生

物检测中的应用［J ］．食品研究与开发，2012，33（2）：228－232.

［7］GBT4789.2－2010.食品微生物学检验菌落总数测定

［S ］．

［8］罗祎，赵晋府，周尔明.微生物检测国标法和滤膜法的

比较［

J ］．食品工业科技，1999，20（6）：54－56.［9］Sakakibara T ，Murakami S ，Imai K．Enumeration of bacte-rial cell numbers by amplified firefly bioluminescence with-out cultivation ［J ］．Analytical Biochemistry ，2003，312（1）：48－56.

［10］刘弋青，吕维敏，刘魁武，等.基于滤膜上细菌直接计

数法的细菌总数快速检测［J ］．生物医学工程研究，2009，28（1）：60－62.

［11］

Parveen S ，Kaur S ，David S A ，et al.Wilson D ，et al.Evaluation of growth based rapid microbiological meth-ods for sterility testing of vaccines and other biological products ［J ］．Vaccine ，2011，29（45）：8012－8023.

［12］嵇志远，翁天楚.3种方法测定水中粪便污染指示菌比

较研究［

J ］．工业水处理，2013，33（10）：79－82.［13］Azadeh Namvar ，Haq I ，Shields M ，et al.Extraction of Ba-cillus endospores from water ，apple juice concentrate ，raw

milk and lettuce rinse solutions using tangential flow filtra-tion［J］．Food Control，2013，32（2）：632－637.

Evaluation on microporous membrane with different material

and aperture through ATP fluorescent rapid detection

HOU Yu-zhu，TIAN Yu，KEＲun-hui，YIN Jian-jun，SONG Quan-hou （China NationalＲesearch Institute of Food and Fermentation Industry，Beijing10027，China）

ABSTＲACT The bacterial retention performances of mixed cellulose membrane，polycarbonate membrane，cellu-lose nitrate membranes and cellulose acetate membranes with13mm-diameter were investigated under the same condi-tions．The total plate count of bacteria in the tested sample was10CFU/mL．The filtrate volume was50mL，and the filtration was repeated5times．When the aperture was0．22μm，the average retention rates of four membranes were 100%，94%，84%and72%，respectively．When the aperture was0．45μm，they were92%，82%，70%and 70%，respectively．Therefore，the best membrane to retain bacteria was mixed cellulose membrane with0．22μm ap-erture．50mL samples respectively containing bacteria42CFU/mL，20CFU/mL，10CFU/mL and4CFU/mL were separately filtered through mixed cellulose membrane．The bacteria on the membranes were determined by ATP biolu-minescent method．There was a good linear correlation between fluorescent value and the bacteria concentration（Ｒ2＞0．9）．The experiment results proved that mixed cellulose membrane with0．22μm aperture could meet the require-ments about concentration and measurement of low-level bacteria content sample by ATP bioluminescent method．Key words microporous membrane；retention rate；total plate count；ATP bioluminescent method